核酸类药物专题知识专家讲座.pptx

第六章 核酸类药品核酸类药物专题知识第1页 本章主要内容 核酸类物质分离提取及其发酵生产 主要核酸类药品生产工艺本章要求（1）掌握酶解法制备核苷酸方法（2）掌握发酵法生产肌苷酸基本方法；（3）了解叠氮胸苷、阿糖腺苷等生产方法；（4）了解核酸类药品分类以及主要临床用途核酸类药物专题知识第2页第一节第一节 核酸类物质分离提取及其发酵核酸类物质分离提取及其发酵生产生产一、核酸（一、核酸（DNA与与RNA)提取与制备提取与制备（了解）（了解）1、工业用、工业用RNA提取提取（1）RNA及其工业起源及其工业起源核酸类药物专题知识第3页核酸类药物专题知识第4页（2）高）高RNA含量酵母菌株筛选含量酵母菌株筛选1.从自然界筛选从自然界筛选2.诱变育种诱变育种（3）用工业废水培养高含量）用工业废水培养高含量RNA酵母酵母菌体在味精废水中（菌体在味精废水中（还原糖还原糖0.7总糖总糖1.2总氮总氮0.2总磷总磷0.5无机盐无机盐0.1-0.2）驯化培养，发）驯化培养，发酵酵24小时，小时，RNA含量含量8-10酵母菌主要生长在酵母菌主要生长在偏酸性潮湿含糖环偏酸性潮湿含糖环境境中，比如，在水果、蔬菜、蜜饯内中，比如，在水果、蔬菜、蜜饯内部和表面以及在果园土壤中最为常见。部和表面以及在果园土壤中最为常见。物理诱变：射线、离子束、微波、超声波物理诱变：射线、离子束、微波、超声波化学化学诱变：硫酸二乙酯（诱变：硫酸二乙酯（DFS）亚硝基胍）亚硝基胍（NTG）等）等生物诱变：病原微生物诱变，转基因诱变生物诱变：病原微生物诱变，转基因诱变核酸类药物专题知识第5页（4）RNA提取实例提取实例碱解碱解230ml1.3%NaOH碱解液碱解液100g压压榨啤酒榨啤酒酵母酵母6mol/LHCL，pH7,15min20,30min清液清液沉淀沉淀10，Ph2.56mol/LHCL离心置冷过夜置冷过夜1.8gRNA（纯度（纯度80）中和，离心核酸类药物专题知识第6页（二）（二）DNA提取与制备提取与制备1工业用工业用DNA提取提取粉碎新鲜冷冻鱼精新鲜冷冻鱼精水，10015min浆状浆状鱼精鱼精加热去杂蛋白，离心含热变性含热变性DNA溶液溶液乙醇，丙酮纤维状纤维状DNA沉淀，离心95乙醇洗涤，减压干燥DNA粗品粗品（含（含50-60热变性热变性DNA)核酸类药物专题知识第7页2、生物活性、生物活性DNA制备制备肝、脾、胸腺、脾、胸腺4倍生理盐水捣碎，匀浆匀浆液离心2500r/pm,30min沉淀1洗涤3次，悬浮生理盐水悬浮液捣碎，离心3min,5SDS,搅拌搅拌2-3h,0,0,2500r/pm上清液冷95乙醇离心纤维状DNA洗涤冷乙醇、丙酮减压、低温干燥DNA粗品粗品核酸类药物专题知识第8页粗品DNA蒸馏水，5SDS搅拌1h离心5000r/pm清液NaCL，95冷乙醇沉淀DNA沉淀洗涤、真空干燥乙醇、丙酮活性DNA核酸类药物专题知识第9页二、核苷酸制备方法（熟悉）二、核苷酸制备方法（熟悉）水解法（水解法（DNA或或RNA经酶或碱水解）经酶或碱水解）发酵法发酵法半合成法半合成法核酸类药物专题知识第10页（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸1.酶解法制备脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉产生核酸酶桔青霉产生核酸酶P1核酸类药物专题知识第11页核酸酶核酸酶P1 酶法生产酶法生产5核苷酸主要工业用酶核苷酸主要工业用酶 起源起源：桔青霉：桔青霉(Penicillium citrinum)发酵发酵 催化特征催化特征：1）水解单链RNA和DNA中3-5磷酸二酯键（磷酸二酯酶活力强）2）水解单核苷酸和寡核苷酸中3-磷酸单酯键核酸类药物专题知识第12页2、酶解法制备、酶解法制备5单核苷酸单核苷酸CMPCMPCMPCMP核酸类药物专题知识第13页3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG）I+G：呈味核苷酸：呈味核苷酸核酸类药物专题知识第14页4菌体自溶法生产核苷酸菌体自溶法生产核苷酸原原理理：磷磷酸酸二二酯酯酶酶在在适适当当条条件件下下降降解解细细胞胞内内RNA可可产产生生5-核核苷酸。苷酸。（1）谷氨酸产生菌体自溶法生产）谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸工艺流程：核苷酸工艺流程：核酸类药物专题知识第15页5碱水解法生产碱水解法生产2，3-混合核苷酸混合核苷酸RNA水溶液水溶液33.5%碱解0.3mol/lNaoH保温38，16-20h水解液中和6molL盐酸盐酸2，3-核苷酸核苷酸核酸类药物专题知识第16页2,3环状磷酸酯分解RNA注意：酶法降解注意：酶法降解RNA得到是得到是5核苷酸核苷酸碱水解法降解碱水解法降解RNA生产生产2，3混合核苷酸混合核苷酸核酸类药物专题知识第17页（二）发酵法生产核苷酸（二）发酵法生产核苷酸1发酵法生产肌苷酸（发酵法生产肌苷酸（IMP）菌种菌种：产氨短杆菌：产氨短杆菌对菌种要求对菌种要求：1）使使用用腺腺嘌嘌呤呤缺缺点点型型菌菌株株（解解除除腺腺嘌嘌呤呤衍衍生生物物反反馈馈抑抑制）制）2）菌体本身）菌体本身5核苷酸降解酶活力低核苷酸降解酶活力低3）选选取取Mn2+不不敏敏感感性性变变异异株株（培培养养基基中中添添加加限限量量Mn2+，以增加细胞膜通透性，使肌苷酸在胞外大量合成）以增加细胞膜通透性，使肌苷酸在胞外大量合成）核酸类药物专题知识第18页（三）半合成法制备核苷酸（三）半合成法制备核苷酸工业生产呈味核苷酸约有工业生产呈味核苷酸约有40-50是由半合成法而制得是由半合成法而制得半合成法制备核苷酸基本路线：半合成法制备核苷酸基本路线：发酵法生产核苷发酵法生产核苷提取、精制提取、精制磷酸化磷酸化5-核苷酸核苷酸肌苷 氯化氧磷磷酸三乙酯，水磷酸化反应，2h5-IMP(产率91）发酵核酸类药物专题知识第19页三、核苷制备三、核苷制备化学法化学法发酵法发酵法（）（）RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷1核苷生产工艺流程（图核苷生产工艺流程（图148）核酸类药物专题知识第20页图图14.8RNA经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图经甲酰胺化学水解制备核苷生产工艺流程图1.水解水解2.离子交换分离离子交换分离3.浓缩浓缩4.结晶结晶（鸟苷腺苷尿苷胞苷）磷酸（鸟苷腺苷尿苷胞苷）磷酸（腺苷尿苷胞苷）（腺苷尿苷胞苷）（阳离子交换）（阳离子交换）阴离子交换阴离子交换阴离子交换阴离子交换核酸类药物专题知识第21页（二）发酵法生产核苷（二）发酵法生产核苷规模：规模：千吨千吨/年年优点优点：产量大，周期短，易控制。：产量大，周期短，易控制。产核苷菌株共同特点产核苷菌株共同特点：选选取取磷磷酸酸单单酯酯酶酶活活力力强强枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌或或短短小小芽芽抱抱杆杆菌菌诱变出发菌株；诱变出发菌株；用物理或化学法筛选出诱变菌用物理或化学法筛选出诱变菌发发酵酵培培养养时时必必须须提提供供限限量量生生长长原原因因，而而且且好好氧氧，在在某某一特定范围内累积大量核苷。一特定范围内累积大量核苷。核酸类药物专题知识第22页1发酵法生产肌苷发酵法生产肌苷菌种：枯草杆菌保藏斜面菌种32活化,20h生产斜面种32,15h一级种子液1%接种量32,8h二级种子液10%接种量1.2L发酵罐发酵液过滤，除菌体发酵清液阳离子交换树脂洗脱液活性炭吸附洗脱液减压浓缩、冷冻结晶肌苷粗品其它产肌苷菌种：产氨短杆菌核酸类药物专题知识第23页第二节第二节 核酸类药品核酸类药品核酸类药品分类核酸类药品分类：第一类第一类：天然核酸类物质：天然核酸类物质（与代谢障碍疾病相关）（与代谢障碍疾病相关）第二类：第二类：自然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚自然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物合物（抗病毒、肿瘤、艾滋病药品，产生干扰素、免疫抑制）（抗病毒、肿瘤、艾滋病药品，产生干扰素、免疫抑制）核酸类药物专题知识第24页一、叠氮胸苷（一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质（一）结构与性质AZT是是1987美国美国FDA同意治疗艾滋病药同意治疗艾滋病药（二）生产工艺（二）生产工艺以胸苷为起始原料进行化学合成以胸苷为起始原料进行化学合成核酸类药物专题知识第25页工艺特点：原料起源少，合成路线复杂，成本高。工艺特点：原料起源少，合成路线复杂，成本高。叠氮胸苷合成工艺路线叠氮胸苷合成工艺路线核酸类药物专题知识第26页起始原料胸苷制备方法：起始原料胸苷制备方法：DNA水解法水解法（主要方法）（主要方法）2-脱氧胞苷脱氧胞苷2-脱氧鸟苷脱氧鸟苷2-脱氧腺苷脱氧腺苷+胸腺嘧啶胸腺嘧啶大肠杆菌磷酸化酶磷酸化酶胸苷鸟苷 胸腺嘧啶胸腺嘧啶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶5-甲基尿苷甲基尿苷胸苷化学法核酸类药物专题知识第27页二、阿糖腺苷二、阿糖腺苷Adeninearabinoside（一）结构与性质（一）结构与性质化化学学名名：9-D-阿阿拉拉伯伯呋呋喃喃糖糖腺腺嘌嘌呤呤，或或称称腺腺嘌嘌呤呤阿阿拉拉伯糖苷。伯糖苷。已经有合成方法：已经有合成方法：发酵法发酵法酶转化法酶转化法阿糖脲苷阿糖脲苷尿嘧啶磷酸化酶尿嘧啶磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶阿糖腺苷阿糖腺苷核酸类药物专题知识第28页（二）生产工艺（二）生产工艺1、酶、酶-化学合成法化学合成法原料：原料：尿苷尿苷过过程程：氧氧氯氯化化磷磷和和二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺反反应应、水水解解反反应应、酶酶法法转化。转化。核酸类药物专题知识第29页氧氯化磷氧氯化磷二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺氧桥化合物氧桥化合物（水解）（水解）（原料（原料1）原料原料2酶酶-化学合成法制备阿糖尿苷工艺路线化学合成法制备阿糖尿苷工艺路线化学催化化学催化酶催化酶催化酶催化酶催化核酸类药物专题知识第30页（三）作用与用途（三）作用与用途作用：广谱作用：广谱DNA病毒抑制剂病毒抑制剂，对单纯疱疹，对单纯疱疹、型，带型，带状疱疹，巨细，牛痘等状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有显著病毒，在体内外都有显著抑制作用抑制作用用途用途：治疗：治疗单纯疱疹脑炎单纯疱疹脑炎最好抗病毒药品。最好抗病毒药品。核酸类药物专题知识第31页三、三氮唑核苷（熟悉）三、三氮唑核苷（熟悉）（一）结构与性质（一）结构与性质商品名病毒唑，对商品名病毒唑，对DNA病毒、病毒、RNA病毒都有广泛作用。病毒都有广泛作用。性质：白色结晶，熔点性质：白色结晶，熔点174176，易溶于水。，易溶于水。特点：毒副作用小于特点：毒副作用小于AZT（叠氮胸苷），价格低廉，（叠氮胸苷），价格低廉，不易产生抗药性不易产生抗药性核酸类药物专题知识第32页（二）生产工艺（二）生产工艺1.酶合成法酶合成法微生物：产气肠杆菌微生物：产气肠杆菌底底物物：肌肌苷苷（尿尿苷苷、鸟鸟苷苷）和和三三叠叠氮氮羧羧基基酰酰胺胺（TCA）N N尿苷尿苷核糖核糖1-磷酸磷酸（嘧啶核苷（嘧啶核苷磷酸化酶）磷酸化酶）嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶尿尿苷苷核酸类药物专题知识第33页 酶促法直接生产酶促法直接生产三氮唑核苷方法：三氮唑核苷方法：1.1.双酶法：双酶法：采采取取前前段段与与后后段段由由两两个个不不一一样样酶酶催催化化，即即前前段段使使用用嘧嘧啶啶核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶（urose)urose)，后后段段使使用用嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶（pynpasepynpase）（两种酶可同时由产气肠杆菌培养取得）（两种酶可同时由产气肠杆菌培养取得）2.2.单酶法：单酶法：前段及后段反应都利用前段及后段反应都利用嘌呤核苷磷酸化酶（嘌呤核苷磷酸化酶（由乙酰短杆由乙酰短杆菌培养取得菌培养取得）核酸类药物专题知识第34页2.化学合成法（当前国内工业生产多采取）化学合成法（当前国内工业生产多采取）（肌苷法）（肌苷法）三步：三步：1.乙酰化（醋酐冰醋酸）乙酰化（醋酐冰醋酸）2.融熔缩合（融熔缩合（160-165，减压），减压）3.3.氨解（甲醇溶液）氨解（甲醇溶液）三废处理：三废处理：催化剂、氨气、甲醇和副产物催化剂、氨气、甲醇和副产物 肌苷肌苷四乙酰核糖四乙酰核糖TCA双磷酸酯催化双磷酸酯催化三氮唑核苷三氮唑核苷核酸类药物专题知识第35页（鸟苷法）：（鸟苷法）：三氮唑核苷（收率三氮唑核苷（收率50%）3-3.5kg1kg水解鸟苷醋酐与冰醋酸（水解）核糖1-磷酸+TCA双磷酸酯（缩合）80%缩合物氨解鸟苷酸核酸类药物专题知识第36页 3.发酵法发酵法（日本报导）（日本报导）培养基培养基：1，2，4-三唑三唑-3-羧酰胺（羧酰胺（TCA）、）、D-葡萄糖葡萄糖菌种菌种：短杆菌、棒状杆菌、节核杆菌、微球菌或杆菌：短杆菌、棒状杆菌、节核杆菌、微球菌或杆菌培培养条件养条件：室温培养：室温培养2-8天天 转化率为转化率为40-60%。优点优点：直接从：直接从D-葡萄糖制备，三废易于治理。葡萄糖制备，三废易于治理。缺点：原材料单耗较大，葡萄糖用量为缺点：原材料单耗较大，葡萄糖用量为1:560，TCA为为1:19。核酸类药物专题知识第37页（三）作用与用途（三）作用与用途 广谱抗病毒（广谱抗病毒（DNA和和RNA病毒）和抗肿瘤作用病毒）和抗肿瘤作用 临床用于治疗流感、疱疹、肿瘤和肝炎临床用于治疗流感、疱疹、肿瘤和肝炎核酸类药物专题知识第38页四、阿糖胞苷四、阿糖胞苷（一）结构与性质（一）结构与性质别名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖组成部分是阿拉伯糖。别名：胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖组成部分是阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。核酸类药物专题知识第39页（二）生产工艺（二）生产工艺1以以5CMP为原料合成法为原料合成法（1）工艺路线：）工艺路线：核酸类药物专题知识第40页核酸类药物专题知识第41页2、工艺过程：、工艺过程：水水解解：加加入入处处理理好好6.5L氢氢氧氧化化镧镧凝凝胶胶，总总体体积积为为7.5L，升温至，升温至90，在不停搅拌下，于，在不停搅拌下，于pH9下进行水解。下进行水解。氧桥化：冰盐浴中进行氧桥化：冰盐浴中进行氨解：使氧桥断裂氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落乙酰基脱落。成盐：成盐：2盐酸盐酸-甲醇甲醇2、以葡萄糖酸钙为原料合成路线、以葡萄糖酸钙为原料合成路线（略）（略）核酸类药物专题知识第42页五五、聚聚肌肌胞胞苷苷酸酸（聚聚肌肌胞胞）（Poyinosinic，PolycytidylicAcid，Poly1：C）（一）结构与性质（一）结构与性质干干扰扰素素诱诱导导剂剂，由由多多聚聚肌肌苷苷酸酸和和多多聚聚胞胞苷苷酸酸组组成成双双股股多聚核苷酸。含有广谱抗病毒作用多聚核苷酸。含有广谱抗病毒作用可溶于可溶于0.85氯化钠溶液。氯化钠溶液。核酸类药物专题知识第43页（二）生产工艺（二）生产工艺1、底物、底物5-核苷二磷酸吡啶盐制备核苷二磷酸吡啶盐制备5核苷酸（核苷酸（5肌苷酸或肌苷酸或5胞苷酸）吗啡啉双环胞苷酸）吗啡啉双环己基碳二亚胺己基碳二亚胺5核苷酸吗啡啉盐核苷酸吗啡啉盐三正丁胺磷酸盐无水吡啶三正丁胺磷酸盐无水吡啶5核苷酸二磷酸吡啶核苷酸二磷酸吡啶盐（即盐（即CDP吡啶盐，吡啶盐，IDP吡啶盐）吡啶盐）乙醇83回流核酸类药物专题知识第44页2.固定化多核苷酸磷酸化酶制备固定化多核苷酸磷酸化酶制备（3）将分离纯化酶液滴加入冰浴中载体，得到共价结合将分离纯化酶液滴加入冰浴中载体，得到共价结合固定化多核苷酸磷酸化。固定化多核苷酸磷酸化。核酸类药物专题知识第45页3、PolyI：C制备制备（1）底物预处理：）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。转成钠盐。（2）酶促反应：）酶促反应：（每毫升反应液含（每毫升反应液含molL数）数）IDP或或CDP15；Tris150；MgC126；EDTA1；聚聚合合酶酶5单位，单位，pH9.0，37，34小时。小时。用用盐盐酸酸调调pH1.52.0，使使PolyI（或或PolyC）沉沉淀淀，马马上上离离心心。今今后后在在磷磷酸酸液液冲冲液液中中溶溶解解，等等摩摩尔尔PolyI与与PolyC混合，生成产品混合，生成产品。核酸类药物专题知识第46页六六、胞胞二二磷磷胆胆碱碱（CDP-胆胆碱碱）（Citico line，CDPcholine，Cytidinediphosphocholine）（一）结构与性质（一）结构与性质化学名：胞嘧啶核苷化学名：胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐二磷酸胆碱钠盐性性质质：白白色色无无定定形形粉粉末末，易易吸吸湿湿，易易溶溶于于水水，几几不不溶溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。核酸类药物专题知识第47页（二）生产工艺（二）生产工艺1、酶合成法、酶合成法反应体系为：反应体系为：产酶菌体产酶菌体：酵母泥：酵母泥550mgm1底物：底物：CMP20molml，磷酰胆碱磷酰胆碱30molml，KH2PO4NaOH缓冲液（缓冲液（pH8.0）200molml，葡萄糖葡萄糖1000molml，MgSO4.7H2O20molml，上上述述反反应应体体系系于于28保保温温20小小时时，胞胞二二磷磷胆胆碱碱对对胞胞苷苷酸酸收率为收率为80。核酸类药物专题知识第48页2粘性红酵母发酵法粘性红酵母发酵法国外发觉一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。国外发觉一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。菌体培养基（菌体培养基（gL）：）：葡葡萄萄糖糖50；蛋蛋白白胨胨5；酵酵母母膏膏2；KH2PO42；（NH4）2HPO42；MgSO4.7H2O1；pH6.0，经经28，22h培培养养，搜搜集集菌菌体体，菌菌体体经经0.2molL磷磷酸酸缓缓冲冲液液pH7.0洗洗涤涤，备用。备用。核酸类药物专题知识第49页产生胞二磷胆碱反应体系（产生胞二磷胆碱反应体系（gL）：葡葡萄萄糖糖140；MgSO4.7H2O6；5CMPNa220；磷磷酸酸胆胆碱碱20；析析干干菌菌体体50；磷磷酸酸缓缓冲冲缓缓pH7.0、0.2molL，30，28小小时时产产胞胞二二磷磷胆胆碱碱9.8gL，对对5-CMP收收率率92.5。核酸类药物专题知识第50页提取工艺提取工艺：反应液离心除菌体清液阳离子交换树脂调PH8.5，水洗，梯度洗脱甲酸洗脱液甲酸洗脱液活性炭柱丙酮丙酮-氨水洗脱氨水洗脱洗脱液减压浓缩浓缩液乙醇结晶胞二磷胆碱胞二磷胆碱核酸类药物专题知识第51页（三）作用与用途（三）作用与用途临临床床用用于于减减轻轻严严重重脑脑外外伤伤和和脑脑手手术术伴伴随随意意识识障障碍碍，治治疗疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。用于脑外伤，脑出血患者可适用止血剂和防水肿药；用于脑外伤，脑出血患者可适用止血剂和防水肿药；用于震颤麻痹可适用用于震颤麻痹可适用L-多巴；多巴；用于精神病可适用镇静药用于精神病可适用镇静药。核酸类药物专题知识第52页