生化药物制造工艺糖类药物专家讲座.pptx

第五节第五节糖类药品糖类药品一、糖类药品概述一、糖类药品概述糖类是自然界广泛存在一大类生生物物活活性性物物质质，已发觉不少糖糖类类物物质质及及其其衍衍生生物物含有很高药用价值，有些已在临床广泛应用。多多糖糖类类药药品品最近很引人注目，尤其在抗抗凝凝、降降血血脂脂、提提升升机机体体免免疫疫和和抗抗肿肿瘤瘤、抗抗辐辐射射方面都含有显著药理作用与疗效。伴随糖糖生生物物学学发展，糖类在生生命命过过程程中中主要作用不停揭示，对糖类药品糖类药品研究也越来越受到重视。生化药物制造工艺糖类药物第1页（一）糖类药品分类（一）糖类药品分类糖类药品种种类类繁繁多多，其分类方法也有各种，按照含有糖基数目糖基数目不一样可分为以下几类。（1）单单糖糖类类：如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。（2）低聚糖类）低聚糖类：如蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖等。（3）多多糖糖类类：多糖又有各种，依据其起起源源不不一一样样又可分为：起起源源于于植植物物多多糖糖，如黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖；生化药物制造工艺糖类药物第2页起起源源于于动动物物多多糖糖，如肝素、透明质酸、硫酸软骨素等；起起源源于于微微生生物物多多糖糖，如香菇多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝糖肽等。（4）糖糖衍衍生生物物：如1，6二磷酸果糖、6磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。生化药物制造工艺糖类药物第3页（二）多糖药理活性（二）多糖药理活性多糖含有十分广泛药理生理作用药理生理作用：1、抗肿瘤和免疫促进活性、抗肿瘤和免疫促进活性多糖对免免疫疫功功效效含有主要调整作用，从多多个个层层次次多多个个路路径径激激活活机机体体免免疫疫系系统统。包含对各种免免疫疫细细胞胞调调整，对细胞因子调整以及对补体调整整，对细胞因子调整以及对补体调整等。香菇多糖已用于临床，另外灵芝多糖、地黄多糖、冬虫夏草多糖、海带多糖、微藻多糖等也含有抗抗肿肿瘤瘤活性活性。生化药物制造工艺糖类药物第4页2、抗病毒活性、抗病毒活性多糖类在结构上与细胞表面糖糖胺胺聚聚糖糖类类似似，竞竞争争抑抑制制病病毒毒与与细细胞胞结结合合，同时又是许多细胞表面分子模模拟拟配体，能直接与细胞结合，妨碍病毒吸附。配体，能直接与细胞结合，妨碍病毒吸附。3、抗凝血活性、抗凝血活性肝素肝素是天然抗凝剂，带有负电荷。甲壳素、硫酸化昆昆布布多多糖糖、海海带带多多糖糖均含有体内外抗抗凝凝血血作作用用。芦芦荟荟多多糖糖、黑黑木木耳耳多多糖糖等也含有肝素样抗凝血作用抗凝血作用。生化药物制造工艺糖类药物第5页4、抗氧化活性、抗氧化活性多糖可经过提提升升抗抗氧氧化化酶酶活活性性、去去除除自自由由基基、抑抑制制脂质过氧化脂质过氧化，从而保护生物膜保护生物膜。5、抗感染作用、抗感染作用多多糖糖能够提升机体组织细胞对细细菌菌、原原虫虫、病病毒毒和和真真菌菌感感染染抵抗力。如甲壳素对皮皮下下肿肿胀胀有有治治疗疗作作用用，对皮肤伤口有愈合作用愈合作用。6、降血脂、抗动脉粥样硬化作用、降血脂、抗动脉粥样硬化作用类肝素、硫酸软骨素、小分子量肝素等含有降降血血脂脂、降降血血胆胆固固醇醇、抗抗动动脉脉粥粥样样硬硬化化作作用用，用于防治冠心病和动脉硬化。生化药物制造工艺糖类药物第6页7、抗辐射、抗突变、抗辐射、抗突变伴随人类对多糖研究不停深入。将会发觉多多糖糖更多作用和用途。生化药物制造工艺糖类药物第7页二、糖类药品制备普通方法二、糖类药品制备普通方法（一）单糖及其衍生物制备（一）单糖及其衍生物制备游离单单糖糖及及小小分分子子寡寡糖糖易易溶溶于于冷冷水水及及温温乙乙醇醇，单糖、双糖类、三糖类、四糖类以及多元醇类。能够用水或在中性条件下以50乙乙醇醇为提取溶剂，也能够用82乙醇，在乙醇，在7078下回流提取下回流提取。植物材料磨碎经乙乙醚醚或或石石油油醚醚脱脱脂脂，拌加碳酸钙，（药材中拌拌入入碳碳酸酸钙钙或或氢氢氧氧化化钡钡，以预预防防酶酶和和有有机机酸酸影响。）以50乙醇温浸，用中中性性醋醋酸酸铅铅去杂杂蛋蛋白白及其它杂质，铅离子可通通H2S除去除去，再浓缩。生化药物制造工艺糖类药物第8页醇液经活性炭脱脱色色、浓浓缩缩、冷冷却却、滴滴加加乙乙醚醚，或或置于硫酸干燥器置于硫酸干燥器中旋转，析出结晶。单糖或小分子寡糖也能够在提取后，用吸吸附附层层析析法法或离子交换法进行纯化或离子交换法进行纯化。（二）多糖分离与纯化（二）多糖分离与纯化多糖可来自动动物物、植植物物和和微微生生物物。起源不一样，提取分离方法也不一样。植植物物体体内内含有水水解解多多糖糖衍衍生生物物酶酶，必须抑抑制制或或破破坏坏酶作用酶作用后，才能制取天然存在形式多糖。生化药物制造工艺糖类药物第9页因温温度度升升高高，使多糖受到内内源源酶酶作作用用。速速冻冻冷冷藏藏是保留提取多糖材料保留提取多糖材料有效方法。提取方法提取方法依照不一样种类多糖溶解性质溶解性质而定。酸性黏多糖酸性黏多糖常含有氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸基基等各种结组成份，且常与蛋白质结合与蛋白质结合在一起，提取分离时，通常先用蛋白酶或浓碱、浓中性盐解蛋白酶或浓碱、浓中性盐解离蛋白质与糖结合键后，用水提取。生化药物制造工艺糖类药物第10页1、多糖提取、多糖提取提提取取多多糖糖时时，普通需先进行脱脱脂脂，方便多糖释放。方法是将材材料料粉粉碎碎，用甲醇或1：1乙乙醇醇乙乙醚醚混混合合液液，加热搅拌13h，也可用石油醚脱脂石油醚脱脂。动物材料动物材料可用丙酮脱脂、脱水处理丙酮脱脂、脱水处理。多糖提取方法主要有以下几个。（1）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者对甘甘露露聚聚糖糖、半半乳乳聚聚糖糖等能形成硼硼酸酸络络合合物物多多糖糖，可加入硼砂硼砂，此法可得相当纯物质。生化药物制造工艺糖类药物第11页（2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者材料用冷冷水水浸浸过过，用热水提取，必要时可加加热热至至8090搅拌提取，提取液用正正丁丁醇醇与与三三氯氯甲甲烷烷混混合合液液除去杂蛋白（或用三三氯氯乙乙酸酸除除杂杂蛋蛋白白），透析后用乙醇沉淀乙醇沉淀得多糖。（3）黏多糖）黏多糖因大部分黏黏多多糖糖与与蛋蛋白白质质结结合合于细胞中，所以需用酶酶解解法法或或碱碱解解法法使糖糖蛋蛋白白质质间结结合合键键断断裂裂，促使多糖释放多糖释放。碱碱解解法法能够预防黏多糖分子中硫硫酸酸基基水解破坏，也能够同时用酶解法酶解法处理组织。生化药物制造工艺糖类药物第12页碱碱解解法法。多糖与蛋白质结合糖糖肽肽键键对对碱碱不不稳稳定定，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。黏多糖分子上硫硫酸酸基基普普通通对对碱碱较较稳稳定定，但若硫硫酸酸基基与与邻邻羟羟基基处处于于反反式式结结构构或硫硫酸酸基基在C3或或C6上，此时易发生脱脱硫硫作作用用。所以对这类多糖不不宜宜用用碱碱解解法法提取提取。酶解法。酶解法。蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖最惯用方法。鉴于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近肽键断裂糖肽键及其附近肽键，所以成品中会保留较长肽段。为除去长肽段，常可与碱解碱解法适用法适用。生化药物制造工艺糖类药物第13页2、多糖纯化、多糖纯化多糖纯化方法很多，但必须依据目目标标物物性性质质及及条条件件选择适当纯化方法。一个方法不易得到理想结果，所以必要时应考虑适用几个方法。（1）乙乙醇醇沉沉淀淀法法乙醇沉淀法是制备黏多糖最惯用伎俩。乙醇加入，改变了溶液极性，造成糖溶解度下降。如使用充分过过量量乙乙醇醇，黏黏多多糖糖浓浓度度少少于于01也能够沉淀完全沉淀完全。向溶液中加入一定浓度盐，如醋醋酸酸钠钠、醋醋酸酸钾钾、醋醋酸酸铵铵或或氯氯化化钠钠有利于使黏多糖从溶液中析出，盐最最终终浓浓度度5即即足足够够。使用醋醋酸酸盐盐优优点点是在乙醇中其溶解度更大，即使在乙乙醇醇过过量量时，也不会发生这类盐共共沉沉淀淀。生化药物制造工艺糖类药物第14页加完乙醇，搅拌数小时，以确保多糖完完全全沉沉淀淀。沉淀物可用无无水水乙乙醇醇、丙丙酮酮、乙乙醚醚脱水，真空干燥即可得疏松粉末状疏松粉末状产品。（2）分级沉淀法）分级沉淀法不一样多糖在不一样浓度甲甲醇醇、乙乙醇醇或或丙丙酮酮中溶溶解解度度不不一一样样，所以可用不一样浓度有有机机溶溶剂剂分分级级沉沉淀淀分子量大小不一样黏多糖。在Ca2、Zn2十十等等二二价价金金属属离离子子存存在在下下，采取乙乙醇醇分级分离分级分离黏多糖能够取得最正确效果。生化药物制造工艺糖类药物第15页（3）季季铵铵盐盐络络正正当当黏黏多多糖糖与一些阳阳离离子子表表面面活活性性剂剂如十六烷基三三甲甲基基溴溴化化铵铵和十六烷基氯氯化化吡吡啶啶（CPC）等能形成季铵盐络合物季铵盐络合物。这些络合物在低离子强度水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物能够解离、溶解、释放解离、溶解、释放。无无机机盐盐浓浓度度（临界盐浓度）主要取决于聚聚阴阴离离子子电荷密度电荷密度。黏多糖硫酸化程度硫酸化程度影响其电荷密度电荷密度。季季胺胺盐盐沉沉淀淀能能力力受其烷基链中亚亚甲甲基基数数影响，还能够用不不一一样样种种季季铵铵盐盐混混合合物物作为酸性黏多糖分分离离沉沉淀淀剂剂。应应用用季季铵铵盐盐沉沉淀淀多多糖糖是是分分级级分分离离复复杂杂黏黏多多糖糖最最有有用方法之一用方法之一。生化药物制造工艺糖类药物第16页（4）离离子子交交换换层层析析法法黏多糖因为含有酸酸性性基基团团如糖糖醛醛酸酸和和各各种种硫硫酸酸基基，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂阴离子交换剂进行交换吸附。洗脱时能够逐步提升盐浓度如梯梯度度洗洗脱脱或分步阶段洗脱。（5）凝凝胶胶过过滤滤法法凝胶过滤法可依据多糖分分子子量量大大小小不一样不一样进行分离。另外，区区带带电电泳泳法法、超超滤滤法法及及金金属属络络正正当当等在多糖分离纯化中也常采取。生化药物制造工艺糖类药物第17页3、溶液中多糖浓度测定、溶液中多糖浓度测定（1）蒽酮硫酸比色法测定糖含量）蒽酮硫酸比色法测定糖含量糖糖类类遇遇浓浓硫硫酸酸脱水生成糠糠醛醛或或其其衍衍生生物物，可与蒽蒽酮酮试剂结合产生颜颜色色反反应应，反应后溶液呈蓝蓝绿绿色色，于620nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系吸收值与糖含量呈线性关系。标标准准曲曲线线：以“0”管作空白对照，620nm处处吸吸光光度度，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。取样品液0.1ml，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算标准曲线计算多糖含量。生化药物制造工艺糖类药物第18页（2）3，5二二硝硝基基水水杨杨酸酸（DNS）比比色色法法测测定定还还原原糖糖在在碱碱性性溶溶液液中中，DNS与与还还原原糖糖共共热热后后被被还还原原成成棕棕红红色色氨氨基基化化合合物物，在一定范围内还还原原糖糖量量与反应液颜色强度呈百分比关系百分比关系，利用比色法可测定样品中含糖量。（3）苯酚硫酸比色法）苯酚硫酸比色法苯苯酚酚硫硫酸酸试试剂剂可与多糖中己己糖糖、糖糖醛醛酸酸起显显色色反反应应，在490nm处处有有最最大大吸吸收收，吸收值与糖含量呈线性关系。生化药物制造工艺糖类药物第19页（4）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶专一氧化葡葡萄萄糖糖，生成葡葡萄萄糖糖酸酸和和过过氧氧化化氢氢，再利用过过氧氧化化物物酶酶催化过过氧氧化化氢氢氧化一些物质如邻邻甲甲氧氧苯苯胺胺使其从无无色色转转变变为为有有色色，经过比比色法计算色法计算葡萄糖含量。葡萄糖溶液中葡葡萄萄糖糖和和葡葡萄萄糖糖存存在在着着动动态态平平衡衡，伴随葡萄糖氧化，最终全部型型全全部部转转变变成成型被氧化型被氧化。（5）Nelson法法 还原糖还原糖将铜试剂铜试剂还原生成氧化亚铜氧化亚铜，在浓硫酸浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液砷钼酸生成蓝色溶液，在在560nm下吸收值与糖下吸收值与糖含量呈线性关系。含量呈线性关系。生化药物制造工艺糖类药物第20页4、纯度检验、纯度检验多糖纯度只代表某一多糖相相同同链链长长平平均均分分布布，通通常所说多糖纯品也是指含有一定分子量范围均一组分常所说多糖纯品也是指含有一定分子量范围均一组分。多糖纯度判定多糖纯度判定通常有以下几个方法：（1）常压凝胶层析法）常压凝胶层析法凝凝胶胶层层析析法法是依据在凝胶柱上不不一一样样分分子子量量多多糖糖与洗脱体积成一定关系与洗脱体积成一定关系特征来进行。选择适宜凝胶是取得良好分离效果确保。选择适宜凝胶是取得良好分离效果确保。生化药物制造工艺糖类药物第21页（2）高效凝胶渗透色谱法）高效凝胶渗透色谱法HPLC法法含有快速、高分辨率和重现性好优点，所以得到越来越多应用。用于HPLC凝胶柱均为商品柱，其填料有疏疏水水性性，也也有有亲亲水水性性，而且每根柱孔径不一样，分分离离分分子子量量范范围亦不一样围亦不一样。选取哪一个性质填料和用多大排排阻阻限限和和渗渗透透限限，主要取决于被分离溶质性质和可能分子量大小溶质性质和可能分子量大小。多糖检测不采取柱柱后后衍衍生生化化方方法法，而是采取直直接接检测检测。生化药物制造工艺糖类药物第22页（3）比旋度法）比旋度法不一样多糖含有不不一一样样比比旋旋度度，在不一样浓度乙醇中含有不一样溶解度不一样溶解度。假如多糖水溶液经不不一一样样浓浓度度乙乙醇醇沉沉淀淀所得沉淀含有相同比旋度相同比旋度，则该多糖为均一组分均一组分。（4）超离心法）超离心法假如多糖在离心力场作用下形成单一区带，说明多糖微粒沉沉降降速速度度相相同同，表表明明其其分分子子密密度度、大大小小和和形形状相同状相同。生化药物制造工艺糖类药物第23页三、主要糖类药品制备三、主要糖类药品制备糖类药品品种繁多，现依据其起源、性质及工艺特点不一样，主要介绍含有代表性几个主要品种生产工艺。（二）（二）1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖（1)、结构与性质、结构与性质1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖是果糖1，6-二磷酸酯，其分子形式有游离酸游离酸FDPH4与钠盐与钠盐如1，6-二磷酸果糖三钠盐（FDPNa3H）等。FDPNa3H为白色晶形粉末，有旋光，易溶于水，不溶于有机溶剂。生化药物制造工艺糖类药物第24页2、生产工艺、生产工艺1）酶转化工艺）酶转化工艺（1）工艺路线：）工艺路线：生化药物制造工艺糖类药物第25页取经多代发酵应用过酵母渣，悬浮于适量蒸馏水中，重复冻冻融融3次次，加入底物（8蔗糖，4NaH2PO4，30mmolLMgCl2，pH6.5）于30，反应6h。除杂蛋白除杂蛋白煮沸煮沸5min。阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析转转酸酸 FDPCa沉沉淀淀悬浮于水中，732树脂转酸，NaOH调pH535.8，除菌过滤后，冻干。生化药物制造工艺糖类药物第26页（三）肝素（三）肝素1、结构与性质、结构与性质肝素是天天然然抗抗凝凝剂剂，是一个含有硫硫酸酸基基酸酸性性粘粘多多糖糖。肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，易易溶溶于于水水，不溶于乙乙醇醇、丙丙酮酮、二二氧氧六六环环等有机溶剂，其游离酸游离酸在乙醚中有一定溶解性。肝素分子中含有硫硫酸酸基基与与羧羧基基，呈强强酸酸性性，为聚聚阴阴离子，能与阳离子反应成盐离子，能与阳离子反应成盐。硫硫酸酸化化程程度度高高肝素含有较高降降脂脂和抗抗凝凝活活性性。小分子量肝素（分子量40005000）含有较低抗抗凝凝活活性性和和较高较高抗血栓形成活性抗血栓形成活性。生化药物制造工艺糖类药物第27页2、生产工艺、生产工艺肝素肝素系广泛分布于哺乳动物肝、肺、心、脾、肾、肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液胸腺、肠粘膜、肌肉和血液里。其生产工艺生产工艺主要有盐解盐解-季胺盐沉淀法季胺盐沉淀法，盐解盐解-离子离子交换法交换法和酶解酶解-离子交换法离子交换法。肝素在组织内和其它粘粘多糖多糖一起与蛋白质结合成蛋白质结合成复合物复合物，所以肝素制备过程包含肝素蛋白质复合物提取肝素蛋白质复合物提取、解离解离和肝素分离纯化分离纯化两个步骤。生化药物制造工艺糖类药物第28页1）盐解）盐解-离子交换生产工艺离子交换生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：继续升温至继续升温至95，维持，维持10min。95乙醇乙醇沉淀过夜NaOH调PH11，按3量加入H2O2（H2O2浓度30），共共48小时小时。去热原、杂质去热原、杂质。生化药物制造工艺糖类药物第29页3、检验方法检验方法4、作用与用途、作用与用途肝素是经典抗凝血药抗凝血药，能阻止血液凝结过程，用于预防血栓预防血栓形成。生化药物制造工艺糖类药物第30页（四）小分子肝素（四）小分子肝素1、结构与性质、结构与性质肝素经过与AT结结合合并抑抑制制a因因子子和和Xa因因子子活活性性而发挥抗栓、抗凝作用。发挥抗栓、抗凝作用。生化药物制造工艺糖类药物第31页（2）工艺过程）工艺过程降降解解。HCl调pH至至2.8，加NaNO2反反应应，反应温度为1825，用KI试纸控制终点试纸控制终点。还还原原。调整pH至至9.8，反应温度为1825，加NaBH4反应2h。沉沉淀淀。调整pH至至5.56.6，95乙乙醇醇沉沉淀淀，得小分子肝肝素素粗粗品品。蒸馏水溶解，95乙乙醇醇沉沉淀淀。蒸馏水溶解，95乙醇沉淀乙醇沉淀。得小分子肝素精品小分子肝素精品。生化药物制造工艺糖类药物第32页3、检验方法、检验方法抗Xa因子活性测定抗IIa因子活性测定4、作用和用途、作用和用途 小分子量肝素钠含有抗抗Xa因子活性因子活性，药效学研究表明小分子量肝素钠对体内、外血栓体内、外血栓，动静脉血栓血栓形成有抑制作用抑制作用。生化药物制造工艺糖类药物第33页（五）香菇多糖（五）香菇多糖1、结构与性质、结构与性质香菇多糖系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化取得均一组分多糖，香菇多糖是以（l3）葡葡萄萄糖糖为为主主链链，（16）葡葡萄萄糖糖为为侧侧链链葡聚糖。重重复复结结构构单单位位普普通通含含有有7个个葡葡萄萄糖糖残残基基，其其中中2个残基在侧链上个残基在侧链上。生化药物制造工艺糖类药物第34页香菇多糖为白色粉末。香菇多糖抗抗肿肿瘤瘤作作用用与其化学结构尤其是D（13）链关系亲密）链关系亲密。采取凝胶过滤法（HPLC）和激激光光拉拉曼曼散散射射法法测测得得其相对分子量为41058105。生化药物制造工艺糖类药物第35页4、作用与用途、作用与用途 香菇多糖含有广泛药理学活性，如免疫调整作用免疫调整作用，抗肿瘤、抗衰老作用抗肿瘤、抗衰老作用。当前香菇多糖主要用于恶性肿恶性肿瘤辅助治疗瘤辅助治疗。生化药物制造工艺糖类药物第36页