生化药物和基因工程药物分析概念专家讲座.pptx

第十三章第十三章 生化药品和基因工程生化药品和基因工程药品分析概念药品分析概念生化药物和基因工程药物分析概念第1页1 1、了解生化药品、基因工程药品定义、了解生化药品、基因工程药品定义、种类。种类。2 2、熟悉质量检验基本程序与方法。、熟悉质量检验基本程序与方法。3 3、掌握生化药品、基因工程药品特点、掌握生化药品、基因工程药品特点及惯用化学定量分析方法。及惯用化学定量分析方法。本章学习关键点本章学习关键点生化药物和基因工程药物分析概念第2页人类用于预防、治疗和诊人类用于预防、治疗和诊疗疾病三大主要药品疗疾病三大主要药品第一节第一节 概概 述述化学药品化学药品生物药品生物药品中中 药药生化药物和基因工程药物分析概念第3页生物药品定义：生物药品定义：利用利用生物体、生物组织或器官生物体、生物组织或器官等成等成份，综合利用生物学、生物化学、微生份，综合利用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学原理与物学、免疫学、物理化学和药学原理与方法制得一大类药品。方法制得一大类药品。生化药物和基因工程药物分析概念第4页生物药品分类：生物药品分类：生化药品生化药品生物技术药品生物技术药品生物制品生物制品从生物体分离纯化制得生化基本从生物体分离纯化制得生化基本物质，以及用化学合成、微生物物质，以及用化学合成、微生物合成或当代生物技术制得一类药合成或当代生物技术制得一类药品。品。利用生物体或其组成部分利用生物体或其组成部分发展产品技术体系即当代发展产品技术体系即当代生物技术研制药品称之。生物技术研制药品称之。应用普通或基因工程、细应用普通或基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术取得微酵工程等生物技术取得微生物、细胞及各种动物和生物、细胞及各种动物和人源组织和体液等生物材人源组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊疗药品。防、治疗和诊疗药品。生化药物和基因工程药物分析概念第5页一、生化药品和基因工程药品定义一、生化药品和基因工程药品定义1 1、生化药品定义、生化药品定义 从动物、植物及微生物提取，也可从动物、植物及微生物提取，也可用生物化学半合成或用当代生物技术用生物化学半合成或用当代生物技术制得生命基本物质及其衍生物、降解物制得生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子结构修饰物等。以及大分子结构修饰物等。生化药物和基因工程药物分析概念第6页2 2、基因工程药品定义、基因工程药品定义 先先确确定定对对某某种种疾疾病病含含有有预预防防和和治治疗疗作作用用蛋蛋白白质质，然然后后将将控控制制该该蛋蛋白白质质合合成成过过程程基基因因进进行行分分离离、纯纯化化或或人人工工合合成成，利利用用重重组组DNADNA技技术术加加以以改改造造，最最终终将将该该基基因因导导入入能能够够大大量量生生产产受受体体细细胞胞中中不不停停繁繁殖殖或或表表示示，并并能能进进行行大大规规模模生生产产含含有有预预防防和和治治疗疗这这种种疾疾病病蛋蛋白白质质，经经过过这这种种方方法法生生产产药药品品称之。称之。生化药物和基因工程药物分析概念第7页1 1、氨基酸、多肽与蛋白质类药品、氨基酸、多肽与蛋白质类药品二、生化药品和基因工程药品种类二、生化药品和基因工程药品种类（一）生化药品种类（一）生化药品种类（1 1）氨基酸及其衍生物：）氨基酸及其衍生物：单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨单氨基酸：亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸等。生化药物和基因工程药物分析概念第8页 氨氨基基酸酸衍衍生生物物：N-N-乙乙酰酰-L-L-半半胱胱氨氨酸酸、S-S-氨氨基基甲甲酰酰半半胱胱氨氨酸酸、S-S-甲甲基基半半胱胱氨氨酸酸、谷胺酰胺、谷胺酰胺、S-S-羟色氨酸。羟色氨酸。复复合合氨氨基基酸酸注注射射液液：3S3S、6S6S、9S9S、11S11S、13S13S、14S14S、15S15S、17S17S、18S18S复复合合氨氨基基酸注射液。（酸注射液。（S S代表氨基酸种类）代表氨基酸种类）生化药物和基因工程药物分析概念第9页（2 2）多肽类药品）多肽类药品 ：垂垂体体多多肽肽：促促肾肾上上腺腺皮皮质质激激素素、促促胃液素、加压素。胃液素、加压素。消消化化道道多多肽肽：促促胰胰液液素素（胰胰泌泌素素）、胃泌素、抑胃肽。胃泌素、抑胃肽。下下丘丘脑脑多多肽肽：促促甲甲状状腺腺素素释释放放激激素素、促促性性腺腺激激素素释释放放激激素素、生生长长激激素素释释放放激激素。素。生化药物和基因工程药物分析概念第10页 脑脑多多肽肽：由由人人及及动动物物脑脑和和脑脑脊脊液液中中分分离离出出来来多多肽肽、蛋蛋氨氨酸酸脑脑啡啡肽肽和和亮亮氨氨酸酸脑脑啡肽等。啡肽等。激激肽肽类类：血血管管担担心心肽肽I I、II II、IIIIII等等活活性性肽。肽。其其它它肽肽类类：谷谷脱脱甘甘肽肽、降降钙钙素素、睡睡眠眠肽肽、松松果果肽肽、血血活活素素（分分子子量量为为30003000肽为主成份肽为主成份)。生化药物和基因工程药物分析概念第11页（3 3）蛋白类药品）蛋白类药品 猪猪或或牛牛纤纤维维蛋蛋白白原原、纤纤维维蛋蛋白白、胃胃膜膜素素（糖糖蛋蛋白白）、水水蛭蛭素素、肝肝细细胞胞生生长长因因子子；属属蛋蛋白白质质类类激激素素还还有有生生长长素素、催催乳乳素素、促促甲甲状状腺腺素素、促促泡泡激激素素（FSHFSH）、促促黄黄体体激激素素（LHLH）；植植物物起起源源蛋蛋白白类类药药品品有有植植物物凝凝集集素素、天天花花粉粉蛋蛋白白、蓖蓖麻麻和和相思豆毒蛋白等。相思豆毒蛋白等。生化药物和基因工程药物分析概念第12页2 2、酶类药品、酶类药品（1 1）助助消消化化酶酶类类：胃胃蛋蛋白白酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。、胰淀粉酶、麦芽淀粉酶。（2 2）蛋蛋白白水水解解酶酶类类：溶溶菌菌酶酶、胰胰DNADNA酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白酶。（3 3）凝凝血血酶酶及及抗抗栓栓酶酶：凝凝血血酶酶（猪猪、牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。牛血）、纤溶酶、尿激酶、蛇毒凝血酶。生化药物和基因工程药物分析概念第13页（4 4）抗抗肿肿瘤瘤酶酶类类：L-L-天天门门冬冬酰酰胺胺酶酶、甲甲硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。硫氨酸酶、组氨酸酶、谷氨酸胺酶。（5 5）其其它它酶酶类类：细细胞胞色色素素C C、超超氧氧化化物物歧化酶（歧化酶（SODSOD）、）、RNARNA酶、青霉素酶。酶、青霉素酶。（6 6）辅辅 酶酶：CoACoA、黄黄 素素 单单 核核 苷苷 酸酸（FMNFMN）、黄黄 素素 腺腺 嘌嘌 呤呤 二二 核核 苷苷 酸酸（FADFAD）。）。生化药物和基因工程药物分析概念第14页3 3、多糖类药品、多糖类药品（1 1）肝素、硫酸软骨素）肝素、硫酸软骨素A A和和C C、硫酸皮、硫酸皮肤素（硫酸软骨素肤素（硫酸软骨素B B）、硫酸角质素、透）、硫酸角质素、透明质酸等。明质酸等。（2 2）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、）类肝素（酸性粘多糖）、鹿茸多糖、壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓壳聚多糖、右旋糖苷、灵芝多糖、猪苓多糖、人参多糖、黄芪多糖等。多糖、人参多糖、黄芪多糖等。生化药物和基因工程药物分析概念第15页4 4、脂质类药品、脂质类药品 卵卵磷磷脂脂、脑脑磷磷脂脂、胆胆固固醇醇、麦麦角角固固醇醇、B B谷谷固固醇醇、胆胆汁汁酸酸（胆胆酸酸与与甘甘氨氨酸酸或或牛牛黄黄酸酸结结合合物物）、鹅鹅脱脱氧氧胆胆酸酸、胆胆红红素素、原原叶叶琳琳、血血叶叶琳琳、亚亚油油酸酸、花花生生四四烯烯酸酸、五五-六六烯烯酸酸、前前列列腺腺素素系系列列（PGE1PGE1、PGE2PGE2、PGE2aPGE2a和和PG12PG12）。）。生化药物和基因工程药物分析概念第16页5 5、核酸类药品、核酸类药品 RNARNA（包包含含iRNA-iRNA-免免疫疫核核糖糖核核酸酸）、DNADNA（脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸）、聚聚肌肌苷苷酸酸、巯巯基聚胞苷酸、基聚胞苷酸、cAMPcAMP、AMPAMP、肌苷。、肌苷。另另外外，有有核核酪酪制制剂剂，6-6-巯巯基基嘌嘌呤呤、6-6-硫硫代代嘌嘌呤呤、5-5-氟氟尿尿嘧嘧啶啶、阿阿糖糖胞胞苷苷、5-5-碘苷和无环鸟苷等。碘苷和无环鸟苷等。生化药物和基因工程药物分析概念第17页二、基因工程工药品种类二、基因工程工药品种类1 1、激素类及神经递质类药品、激素类及神经递质类药品（1 1）人生长激素释放抑制因子）人生长激素释放抑制因子（2 2）人胰岛素）人胰岛素（3 3）人生长激素）人生长激素2 2、细胞因子类药品、细胞因子类药品（1 1）人干扰素）人干扰素生化药物和基因工程药物分析概念第18页（2 2）人白细胞介素）人白细胞介素（3 3）集落刺激因子）集落刺激因子（4 4）促红细胞生长素）促红细胞生长素3 3、酶类及凝血因子类药品、酶类及凝血因子类药品 单单克克隆隆抗抗体体、疫疫苗苗、基基因因治治疗疗药药品品、白白介介素素、生生长长因因子子、反反义义药药品品、肿肿瘤瘤坏坏死因子等。死因子等。生化药物和基因工程药物分析概念第19页1 1、共同特点：、共同特点：含含有有一一定定生生物物活活性性或或生生理理功功效效，能能够够参参加加、影影响响和和调调控控人人体体代代谢谢和和生生理理功功效效，对对于于一一些些疾疾病病治治疗疗含含有有针针对对性性强强、毒毒副副作作用用小小、易易为为人人体体所所吸吸收收等特点。等特点。三、生化药品和基因工程药品特点三、生化药品和基因工程药品特点生化药物和基因工程药物分析概念第20页2 2、分子量不是定值、分子量不是定值 除除氨氨基基酸酸、核核苷苷酸酸、辅辅酶酶及及甾甾体体激激素素等等属属化化学学结结构构明明确确小小分分子子化化合合物物外外，大大部部分分为为大大分分子子物物质质，其其分分子子量量普普通通几几千千至至几几十十万万。对对大大分分子子药药品品而而言言，即即使使组组分分相相同同，往往往往因因为为分分子子量量不不一一样样而而产产生不一样生理活性。生不一样生理活性。生化药物和基因工程药物分析概念第21页 3 3、结构确证难、结构确证难 在这类药品中，因为在这类药品中，因为有效结构或分有效结构或分子量不确定子量不确定，其结构确实证极难沿用元，其结构确实证极难沿用元素分析、素分析、IRIR、UVUV、NMRNMR、MSMS等方法等方法加以证实，往往还要用加以证实，往往还要用生化法生化法如氨基酸如氨基酸序列等法加以证实。序列等法加以证实。生化药物和基因工程药物分析概念第22页4 4、全过程质量控制、全过程质量控制 这类药品对热、酸、碱、重金属以这类药品对热、酸、碱、重金属以及及pHpH较敏感，需对原材料、生产过程较敏感，需对原材料、生产过程和最终产品进行质量控制。和最终产品进行质量控制。生化药物和基因工程药物分析概念第23页5 5、生物活性检验、生物活性检验 在在制制备备多多肽肽或或蛋蛋白白质质类类药药品品时时，有有时时因因工工艺艺条条件件改改变变，造造成成蛋蛋白白质质失失活活。所所以以，除除了了用用通通常常采采取取理理化化法法检检验验外外：尚尚需需用用生生物物检检定定法法进进行行检检定定，以以证证实实药药品生物活性。品生物活性。生化药物和基因工程药物分析概念第24页6 6、安全性检验、安全性检验 因为这类药品性质特殊，生产工艺因为这类药品性质特殊，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常复杂，易引入特殊杂质和污染物，故常需做安全性检验。需做安全性检验。7 7、效价测定、效价测定 对酶类药品需进行效价测定或酶活力对酶类药品需进行效价测定或酶活力测定，以表明其有效成份含量高低。测定，以表明其有效成份含量高低。生化药物和基因工程药物分析概念第25页第二节第二节 质量检验基本程序与方法质量检验基本程序与方法 一、判别试验一、判别试验（一）理化判别法（一）理化判别法 利利用用化化学学法法、物物理理法法及及生生物物学学方方法法来来确确证证生生化化药药品品真真伪伪。用用标标准准品品或或对对照照品品在同一条件下进行对照试验。在同一条件下进行对照试验。生化药物和基因工程药物分析概念第26页1 1、化学反应法、化学反应法 通通常常利利用用药药品品与与某某试试剂剂在在一一定定条条件件下下反反应应，生生成成有有颜颜色色产产物物或或沉沉淀淀进进行行判判别别。比比如如，溶溶菌菌酶酶判判别别采采取取呈呈色色法法；胃胃蛋白酶判别采取沉淀法。蛋白酶判别采取沉淀法。2 2、HPLCHPLC法法生化药物和基因工程药物分析概念第27页3 3、UVUV法法 三三磷磷酸酸腺腺苷苷二二钠钠分分子子中中含含有有共共轭轭系系统统，能能吸吸收收紫紫外外光光。本本品品0.01mol0.01molL L盐盐酸酸 水水 溶溶 液液（20g20g mlml），在在（25712571）nmnm波波优优点点有有最最大大吸吸收收。A250nmA250nmA260nmA260nm值应为值应为0.170.170.270.27。生化药物和基因工程药物分析概念第28页（二）生化判别法（二）生化判别法 1 1、酶酶法法：尿尿激激酶酶是是专专属属性性较较强强蛋蛋白白水水解解酶酶，依依据据尿尿激激酶酶能能激激活活牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原，而而含含有有相相同同作作用用链链激激酶酶不不能能激激活活牛牛纤纤维维蛋蛋白白溶溶酶酶原原而而加加以以区区分分，并并用用直直接接观观察察溶溶解解纤纤维维蛋蛋白白作作用用气气泡泡上上升升法法作作为判断指标。为判断指标。生化药物和基因工程药物分析概念第29页2 2、电泳法、电泳法 肝素判别采取糖凝胶电泳法：肝素肝素判别采取糖凝胶电泳法：肝素是由是由D-D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间组成酸性粘多糖，其水溶液带强负子间组成酸性粘多糖，其水溶液带强负电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，电荷，于琼脂凝胶板上，在电场作用下，向正极方向移动，与肝素国家标准品对向正极方向移动，与肝素国家标准品对照，其移动位置应相一致。照，其移动位置应相一致。生化药物和基因工程药物分析概念第30页3 3、样品脱盐后等电点聚焦法测定、样品脱盐后等电点聚焦法测定 测定药品等电点（为出现多条区带测定药品等电点（为出现多条区带多个等电点），同批次同一产品等电点多个等电点），同批次同一产品等电点应相同，表明其工艺稳定。应相同，表明其工艺稳定。（三）（三）生物判别法：利用生物体进行试生物判别法：利用生物体进行试验来判别药品。验来判别药品。生化药物和基因工程药物分析概念第31页二、杂质检验二、杂质检验（一）普通杂质检验（一）普通杂质检验 检验项目包含氯化物、硫酸盐、磷检验项目包含氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液澄清度或溶液颜色、水分及干燥失重、液澄清度或溶液颜色、水分及干燥失重、炽灼残渣等。炽灼残渣等。生化药物和基因工程药物分析概念第32页（二）特殊杂质检验（二）特殊杂质检验 许多药品是从生物组织中提取或用许多药品是从生物组织中提取或用微生物发酵法制得，药品中易残余一些微生物发酵法制得，药品中易残余一些杂质或其它成份。杂质或其它成份。1 1、原料药纯度分析、原料药纯度分析2 2、生产过程中杂质检验、生产过程中杂质检验生化药物和基因工程药物分析概念第33页三、安全性检验三、安全性检验（一）（一）热原热原检验法（家兔、检验法（家兔、鲎鲎试剂）试剂）（二）异常毒性试验（二）异常毒性试验 ：用一定剂量药品：用一定剂量药品按指定操作方法和给药路径给予要求体按指定操作方法和给药路径给予要求体重某种试验动物，观察其急性毒性反应。重某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应判断以试验动物死亡是否为终点。反应判断以试验动物死亡是否为终点。生化药物和基因工程药物分析概念第34页（三）过敏试验（检验（三）过敏试验（检验异性蛋白异性蛋白）药药品品中中若若夹夹杂杂有有异异性性蛋蛋白白，在在临临床床使使用用时时易易引引发发病病人人各各种种过过敏敏反反应应，轻轻者者皮皮肤肤出出现现红红斑斑或或丘丘疹疹，严严重重者者可可出出现现窒窒息息、发发结结、血血管管神神经经性性水水肿肿、血血压压下下降降，甚至休克和死亡。甚至休克和死亡。生化药物和基因工程药物分析概念第35页（四）（四）降压物质降压物质检验法检验法 降压物质是指一些药品中含有能造成降压物质是指一些药品中含有能造成血压降低杂质，包含组胺、类组胺或其它血压降低杂质，包含组胺、类组胺或其它造成血压降低物质。造成血压降低物质。起源起源：用动物脏器或组织为原料制备生化：用动物脏器或组织为原料制备生化药品，正常组织内存在组胺及部分氨基酸药品，正常组织内存在组胺及部分氨基酸脱羧形成组胺、酪胺等胶类物质。脱羧形成组胺、酪胺等胶类物质。生化药物和基因工程药物分析概念第36页（五）无菌检验法（五）无菌检验法 （检验（检验活菌活菌）因为许多药品是在无菌条件下制备，因为许多药品是在无菌条件下制备，且不能高温灭菌。所以，无菌检验就更且不能高温灭菌。所以，无菌检验就更有必要。中国药典中几乎全部注射用药有必要。中国药典中几乎全部注射用药如注射用尿激酶等，均做无菌检验。如注射用尿激酶等，均做无菌检验。生化药物和基因工程药物分析概念第37页1 1、无菌检验基本步骤：、无菌检验基本步骤：培养基制备，为细菌生长、繁殖提供所必培养基制备，为细菌生长、繁殖提供所必需营养物质需营养物质碳源、氮源、维生素、矿物质碳源、氮源、维生素、矿物质等。等。选择对照用菌液，供对照试验用。选择对照用菌液，供对照试验用。详细检验，如接种、培养等操作。详细检验，如接种、培养等操作。结果判断，得出阴性或阳性结论。结果判断，得出阴性或阳性结论。生化药物和基因工程药物分析概念第38页2 2、注意事项：、注意事项：无菌检验全部过程应严格恪守无菌操作法，无菌检验全部过程应严格恪守无菌操作法，包含对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等，包含对操作环境、试验材料及用具酶灭菌等，预防微生物污染。预防微生物污染。应防止在有抑菌条件下操作。应防止在有抑菌条件下操作。从事无菌操作人员应具备微生物学基础知从事无菌操作人员应具备微生物学基础知识及一定工作经验，不然要经过无菌技能培识及一定工作经验，不然要经过无菌技能培训，方能从事此工作。训，方能从事此工作。生化药物和基因工程药物分析概念第39页（六）基因工程药品中可能杂质与污染（六）基因工程药品中可能杂质与污染物检验物检验可能杂质：残留可能杂质：残留DNADNA、宿主细胞蛋白质、宿主细胞蛋白质、内毒素等；内毒素等；主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要污染物：微生物、热原、病毒等。主要检验项目：外源性主要检验项目：外源性DNADNA、其它外源、其它外源性杂质测定性杂质测定生化药物和基因工程药物分析概念第40页（七）致突变试验（七）致突变试验包含：微生物回复突变试验、哺乳动物包含：微生物回复突变试验、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微培养细胞染色体畸变试验、啮齿动物微核试验等。核试验等。（八）生殖毒性试验（八）生殖毒性试验包含：普通生殖毒性试验、围生期毒性包含：普通生殖毒性试验、围生期毒性试验。试验。生化药物和基因工程药物分析概念第41页四、含量（效价）测定四、含量（效价）测定含量含量表示表示方法方法百分含量，适合用于结构明确小百分含量，适合用于结构明确小分子药品或经水解后变成小分子分子药品或经水解后变成小分子药品。药品。生物效价或酶活力，适合用于酶类、生物效价或酶活力，适合用于酶类、蛋白质类等药品。蛋白质类等药品。生化药物和基因工程药物分析概念第42页（一）含量测定（一）含量测定1 1、HPLCHPLC法法2 2、SDS-PAGESDS-PAGE法法（二）效价测定：采取国际或国家参考（二）效价测定：采取国际或国家参考品，或经国家检定机构认可参考品，以品，或经国家检定机构认可参考品，以体内或体外法测定其生物学活性，并标体内或体外法测定其生物学活性，并标明其活性单位。明其活性单位。生化药物和基因工程药物分析概念第43页第三节第三节 惯用定量分析方法及其应用惯用定量分析方法及其应用一、理化法一、理化法（一）化学分析法（一）化学分析法1 1、重重量量法法：依依据据样样品品中中分分离离出出单单质质或或化合物重量测定所含成份含量。化合物重量测定所含成份含量。（1 1）提取法）提取法 （2 2）挥发法）挥发法 （3 3）沉淀法）沉淀法生化药物和基因工程药物分析概念第44页（二）电化学分析法（二）电化学分析法 离子选择性电极：测量离子活度指离子选择性电极：测量离子活度指示电极。示电极。2 2、滴滴定定分分析析法法：依依据据样样品品中中一一些些成成份份与与标标准准溶溶液液能能定定量量地地发发生生酸酸碱碱中中和和、氧化还原或络合反应等进行测定。氧化还原或络合反应等进行测定。生化药物和基因工程药物分析概念第45页（三）光谱分析法（三）光谱分析法1 1、比比色色法法：样样品品与与显显色色剂剂可可发发生生颜颜色色反反应应，依依颜颜色色反反应应强强度度测测定定含含量量。如如蛋蛋白白质质含含量量测测定定，可可利利用用蛋蛋白白质质与与双双缩缩脲脲试试剂剂发发生生颜颜色色反反应应，而而进进行行定定量量测定。测定。生化药物和基因工程药物分析概念第46页2 2、UVUV法法：样样品品或或转转化化后后产产物物在在某某一一波波优优点点有有最最大大吸吸收收，在在一一定定浓浓度度范范围围内内，其其浓浓度度与与吸吸收收度度成成正正比比，则则可可进进行行定定量量测测定定。如蛋白质在如蛋白质在280nm280nm左右有最大吸收左右有最大吸收 。3 3、荧荧光光分分光光光光度度法法：依依据据物物质质被被UVUV光光照照射后产生荧光强度进行定量测定。射后产生荧光强度进行定量测定。生化药物和基因工程药物分析概念第47页（四）色谱分析法（四）色谱分析法1 1、HPLCHPLC法法（1 1）RP-HPLCRP-HPLC法法：适适合合用用于于肽肽类类、氨氨基基酸、蛋白质和多糖测定，如生白能。酸、蛋白质和多糖测定，如生白能。固定相：固定相：C8C8、C18C18烷基硅烷键合相烷基硅烷键合相流流动动相相：甲甲醇醇-水水、乙乙腈腈-水水（甲甲醇醇）、乙乙腈腈-缓冲液缓冲液生化药物和基因工程药物分析概念第48页（2 2）高效离子交换色谱法（）高效离子交换色谱法（HPIECHPIEC）HPIEC HPIEC特点以下：特点以下：蛋蛋白白质质、多多肽肽分分离离是是依依据据其其对对应应离离子子化程度而进行。化程度而进行。分分离离过过程程是是以以盐盐浓浓度度增增大大梯梯度度洗洗脱脱法法进行进行 柱效中等并具较高质量活性回收。柱效中等并具较高质量活性回收。生化药物和基因工程药物分析概念第49页（3 3）高效凝胶过滤色谱法（）高效凝胶过滤色谱法（HPGFCHPGFC）HPGFC HPGFC特点以下：特点以下：活性蛋白质可得以回收。活性蛋白质可得以回收。分离是在固定百分比水溶液中进行。分离是在固定百分比水溶液中进行。分分离离是是依依据据蛋蛋白白质质或或多多肽肽在在溶溶液液中中对对应有效粒径而进行。应有效粒径而进行。生化药物和基因工程药物分析概念第50页2 2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE）HPCEHPCE是是依依据据带带电电组组分分在在管管中中因因为为其其所所带带电电荷荷和和分分子子量量大大小小，即即荷荷质质比比不不一样产生不一样迁移速度而分离。一样产生不一样迁移速度而分离。生化药物和基因工程药物分析概念第51页类类型型酶活力测定法酶活力测定法：以酶为分析对象，：以酶为分析对象，测定样品中某种酶活力或活性，并测定样品中某种酶活力或活性，并用活力单位和比活性表示用活力单位和比活性表示。酶分析法酶分析法：以酶为分析工具或分析：以酶为分析工具或分析试剂，测定样品中酶以外其它物质试剂，测定样品中酶以外其它物质含量。含量。二、酶法二、酶法生化药物和基因工程药物分析概念第52页（一）酶活力测定法（一）酶活力测定法 1 1、定义：、定义：酶酶活活力力是是指指酶酶催催化化一一定定化化学学反反应应能能力力。酶酶活活力力测测定定实实际际上上是是测测定定一一个个被被酶酶所所催催化化化化学学反反应应速速度度能能够够用用单单位位时时间间反应底物降低或产物增加来表示。反应底物降低或产物增加来表示。生化药物和基因工程药物分析概念第53页2 2、方法、方法（1 1）终终点点法法：在在适适当当条条件件下下，把把酶酶和和底底物物混混合合，测测定定生生成成一一定定量量产产物物所所需需时时间。间。（2 2）将将酶酶和和底底物物混混合合后后隔隔一一定定时时间间，间断地或连续地测定反应连续改变。间断地或连续地测定反应连续改变。生化药物和基因工程药物分析概念第54页（3 3）将将酶酶与与底底物物混混合合后后，让让其其反反应应一一定定时时间间，然然后后停停顿顿反反应应，定定量量测测定定底底物降低或产物生成量。物降低或产物生成量。生化药物和基因工程药物分析概念第55页（二）酶分析法（二）酶分析法 1 1、动力学分析法：、动力学分析法：经经过过条条件件控控制制，分分别别使使底底物物、辅辅酶酶活活化化剂剂或或抑抑制制剂剂浓浓度度在在酶酶反反应应中中起起决决定定反反应应速速度度主主导导作作用用。则则酶酶反反应应速速度度和和上上述述对对应应原原因因浓浓度度间间将将含含有有确确定定百百分分比比关关系系，经经过过测测定定酶酶反反应应速速度度即即可可求求出出它它们们浓度。浓度。生化药物和基因工程药物分析概念第56页2 2、总变量分析法（平衡法或终点法）：、总变量分析法（平衡法或终点法）：依依据据被被测测物物质质（底底物物）性性质质，选选择择适适宜宜分分析析工工具具酶酶对对该该物物质质进进行行作作用用，在在反反应应完完成成后后，借借助助理理化化方方法法测测出出其其总总改改变变量量，并并参参考考反反应应平平衡衡点点，计计算算出出被被测测物实际含量或浓度。物实际含量或浓度。生化药物和基因工程药物分析概念第57页三、电泳法三、电泳法 （一）基本原理（一）基本原理 电电泳泳法法是是指指带带电电微微粒粒如如蛋蛋白白质质、核核苷苷酸酸、其其它它微微粒粒分分子子或或离离子子在在电电场场作作用用下下，向向其其对对应应电电极极方方向向按按各各自自速速度度泳泳动动而而使使组组分分分分离离，再再进进行行检检测测或或计计算算百百分分含量方法。含量方法。生化药物和基因工程药物分析概念第58页（二）电泳法分类（二）电泳法分类1 1、自由界面电泳：在一根、自由界面电泳：在一根U U形管里溶液形管里溶液中，同种分子构型及荷电情况基本一致，中，同种分子构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐步密集而与其它在电场影响下，它们逐步密集而与其它电泳迁移率不一样物质之间形成显著界电泳迁移率不一样物质之间形成显著界面。面。2、高效毛细管电泳法（、高效毛细管电泳法（HPCEHPCE）生化药物和基因工程药物分析概念第59页3 3、区区带带电电泳泳：在在电电泳泳过过程程中中，应应用用各各种种不不一一样样惰惰性性支支持持介介质质，在在电电场场作作用用下下，使使含含有有不不一一样样泳泳动动速速度度组组分分形形成成各各自自区区带带电电泳泳。惯惯用用支支持持物物有有：滤滤纸纸、醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜、聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（PAGEPAGE）、十十二二烷烷基基硫硫酸酸纳纳-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（SDS SDS-PAGE PAGE）。）。生化药物和基因工程药物分析概念第60页四、生物检定法四、生物检定法（一）基本原理（一）基本原理 生生物物检检定定法法是是利利用用药药品品对对生生物物体体（整整体体动动物物、离离体体组组织织、微微生生物物等等）作作用用以以测测定定其其效效价价或或生生物物活活性性一一个个方方法。法。生化药物和基因工程药物分析概念第61页（二）应用范围（二）应用范围1 1、药药品品效效价价：测测定定对对一一些些采采取取理理化化方方法法不不能能测测定定含含量量或或理理化化测测定定不不能能反反应应临临床床生生物物活活性性药药品品可可用用生生物物检检定定法法来来控控制制药药品品质质量量。如如洋洋地地黄黄、胰胰岛岛素素、肝肝素素及及各种抗生素。各种抗生素。生化药物和基因工程药物分析概念第62页2 2、大分子结构测定、大分子结构测定 一一些些生生物物制制品品因因结结构构复复杂杂、分分子子量量大大，而而且且由由结结构构类类似似、百百分分比比不不定定各各种种成成份份组组成成，极极难难用用理理化化方方法法反反应应其其生生物物活活性性；一一些些药药品品虽虽可可用用理理化化方方法法测测定定含含量量，但但不不能能完完全全反反应应效效价价。以以上上药药品品均均采取生物检定。采取生物检定。生化药物和基因工程药物分析概念第63页3 3、微量生理活性物质测定、微量生理活性物质测定 一一些些神神经经介介质质，激激素素等等微微量量生生理理活活性性物物质质，因因为为其其很很强强生生理理活活性性，在在体体内内浓浓度度很很低低，加加上上体体液液中中各各种种物物质质干干扰扰，极极难难用用理理化化方方法法测测定定。而而不不少少活活性性物物质质生生物物测测定定法法因因灵灵敏敏度度高高、专专一一性性强强，对对供试品稍作处理即可直接测定。供试品稍作处理即可直接测定。生化药物和基因工程药物分析概念第64页