动物实验室疾病诊断工作流程.doc

生物实验室疾病诊断工作流程
流程：
业务接收流程：
客户——内勤——研发部——生物实验室
业务反馈流程：
生物实验室——内勤——客户
实施细则:
一、样品采集与运输
1.病料的采集要求：
（1）新鲜，代表性。病料存放时间夏天少于6h，冬天12-24h.
（2）减少污染。第一时间采取病料，减少病料因暴露于空气中而造成的污染。
（3）病料采集后，应先存放于冰箱中1-2小时后，再做微生物检验
2.病料的采集方法
（1）组织和实质器官的采集
采集病料心、肝、脾脏、胰腺、肺等，剪切小块组织，放入灭菌试管（青霉素瓶），密封。
（2）液体病料的采集
血液、胆汁、脓肿液、渗出物等液体病料，使用注射器（或灭菌吸管）吸取病变组织的液体，将病料注入灭菌试管（青霉素瓶），塞好棉塞送检。
（3）全血的采集方法
用注射器自鸡的心脏或翅静脉采血2-5毫升，注入灭菌试管（青霉素瓶）中。
（4）血清的采集方法
用灭菌注射器自鸡的心脏或翅静脉采血2毫升，注入灭菌试管中（青霉素瓶）摆成斜面，待血液凝固血清析出后，将血清吸出注入另一个灭菌试管中，备用。
采样的比例：按每个舍0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常规采样15-30份即可。

二、检测项目
项目一、药敏试验
一、 试验步骤 1.试验材料：培养基、药敏试纸、细菌、接种环、酒精灯、打孔器、移液器、滴头。
2.试验准备：
药液的制备(用于商品药的试验)：按商品药使用治疗量的比例配制药液；如商品药“百病消”按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。
3.试验操作方法：
3.1药敏片法
3.1.1在“超净台”中，用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面，涂布均匀致密)。
3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片)，每种药敏片的名称要记住。
3.1.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
二、结果观察：
过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
三、结果判定
药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。实验条件不同，判定标准有所不同。对于一般抑菌环的直径，20 以上极敏;15 以上者为高度敏感；10-15 为中度敏感；10以下为低度敏感；无抑菌环者为耐药。
抗菌药物
纸片含药量
(μg )
抑菌圈直径()
不敏感
低度敏感
中度敏感
敏感
青霉素
50
0
≤10
10 ～26
≥26
链霉素
500
0
≤10
10～15
≥15
氯霉素
700
0
≤10
10～20
≥20
新霉素
300
0
≤10
10～25
≥25
多黏菌素抑菌圈在9毫米以上为高敏，6-9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。
四、应用
药物敏感试验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用。
在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，这样才会达到好的治疗效果。

项目二、抗体试验
一、实验用设备：
离心机 1台 、冰箱 1台、振荡器 1台、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸头、积液槽、一次性采血管、2毫升注射器、红细胞、柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、吸管、吸耳球、针头、蒸馏水、10毫升离心管 、生理盐水。
二、实验过程：
（一）血凝（）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价

（二）4单位抗原校正：
（三）血凝抑制（）试验：每排孔检查1份血清。
（四）结果判定：
1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的滴度，以2的指数表示。
2）判定标准：
1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
25抗体：抗体值在6以上。
39抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。

项目三、检测
一、反应的条件设置
反应条件为温度、时间和循环次数。
1．温度与时间的设置
基于原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度 酶仍有较高的催化活性）。
2．循环次数
循环次数决定扩增程度。循环次数主要取决于模板的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

二、扩增产物分析
产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
三、结果异常分析
产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

二、 试验结果

试验类别
检测项目
检测结果
检测人
时间
药敏
公司产品的药敏性

生物实验室或兽药化验室
接收病料后24-48小时
抗体检测
抗体滴度

生物实验室
接收病料后
12-24小时

各种病毒

生物实验室
接收病料后12-24小时