青霉素发酵生产工艺.pptx

青霉素及其发酵生产工艺青霉素及其发酵生产工艺1青霉素发酵生产工艺第1页青霉素介绍青霉素介绍 发觉发觉 化学结构化学结构 理化性质理化性质 抗菌作用和临床应用抗菌作用和临床应用青霉素发酵生产工艺青霉素发酵生产工艺 菌种菌种 发酵工艺流程发酵工艺流程 培养基培养基 发酵培养控制发酵培养控制 提取精制提取精制 2青霉素发酵生产工艺第2页青霉素发觉青霉素发觉 1928年，英国细菌学家年，英国细菌学家Fleming发觉污染在培养葡萄发觉污染在培养葡萄球菌双蝶上一株霉菌能杀死球菌双蝶上一株霉菌能杀死周围葡萄球菌。他将此霉菌周围葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后得到菌株判定为分离纯化后得到菌株判定为青霉，并将这菌产生抗生物青霉，并将这菌产生抗生物质命名为青霉素质命名为青霉素。3青霉素发酵生产工艺第3页1940年，英国年，英国Florey和和Chain深入研究此深入研究此菌，并从培养液中制出了干燥青霉素制品。菌，并从培养液中制出了干燥青霉素制品。经试验和临床试验证实，它毒性很小，并经试验和临床试验证实，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引发许多疾病有卓对一些革兰氏阳性菌所引发许多疾病有卓越疗效越疗效。4青霉素发酵生产工艺第4页青霉素类抗生素青霉素类抗生素青霉素青霉素(Penicillin)又称盘尼西林，是人类发觉第又称盘尼西林，是人类发觉第一个抗生素，也是当前全球销量最大抗生素。一个抗生素，也是当前全球销量最大抗生素。青霉素是青霉素是-内酰胺类抗生素中一类，是分子中含内酰胺类抗生素中一类，是分子中含有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞系列有青霉烷、能破坏细菌细胞壁并在细菌细胞系列生长久起杀菌作用一类抗生素。生长久起杀菌作用一类抗生素。一个高效、低毒、临床应用广泛主要抗生素。它一个高效、低毒、临床应用广泛主要抗生素。它研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染能力，研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染能力，带动了抗生素家族诞生。带动了抗生素家族诞生。5青霉素发酵生产工艺第5页青霉素化学结构青霉素化学结构 青霉素是青霉素是-内酰胺类抗生素中一类，内酰胺类抗生素中一类，含有含有-内酰胺环结构；是分子中含有内酰胺环结构；是分子中含有青青霉素母核（霉素母核（青霉烷青霉烷）各种化合物总称。）各种化合物总称。分子结构球棍模型分子结构球棍模型-内酰胺环内酰胺环6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸6青霉素发酵生产工艺第6页 青霉素类抗生素青霉素类抗生素 青霉素青霉素G G 青霉素青霉素X X 青霉素青霉素V V 霉菌属青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有各种G、V、N、K、X、其中PG活性最高、产量最高。青霉素青霉素N N 青霉素青霉素K K7青霉素发酵生产工艺第7页青霉素理化性质青霉素理化性质一元有机酸一元有机酸普通羧酸普通羧酸 Pka 4-6PG Pka 2.7（解离常数）（解离常数）8青霉素发酵生产工艺第8页不稳定性不稳定性 内酰胺环是青霉素中最内酰胺环是青霉素中最不稳定部分，原因：不稳定部分，原因：1 1、四元环和五元环稠合，、四元环和五元环稠合，环张力大环张力大 2 2、两个环不在同一平面，、两个环不在同一平面，青霉素结构中青霉素结构中-内酰胺环内酰胺环中羰基和氮原子孤对电子中羰基和氮原子孤对电子不能共轭，不能共轭，易受到亲核性易受到亲核性或亲电性试剂进攻，使或亲电性试剂进攻，使-内酰胺环破裂。内酰胺环破裂。-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、醇、胺不稳定，醇、胺不稳定，-环开裂、活性降低或消失环开裂、活性降低或消失9青霉素发酵生产工艺第9页对碱或酶对碱或酶(-(-内酰胺酶内酰胺酶)不稳定，水解不稳定，水解10青霉素发酵生产工艺第10页对稀酸不稳定，发生重排；对稀酸不稳定，发生重排；PH=4PH=4青霉二酸青霉二酸青霉醛青霉醛青霉胺青霉胺-CO2对羰基亲核反应对羰基亲核反应分解分解重排重排11青霉素发酵生产工艺第11页对强酸不稳定，发生重排对强酸不稳定，发生重排 PH=2 or HgClPH=2 or HgCl2 2 青霉酸青霉酸+青霉醛酸青霉醛酸 青霉醛青霉醛a a-环开裂环开裂,-CO,-CO2 2abb12青霉素发酵生产工艺第12页青霉素理化性质青霉素理化性质青霉素本身为一元有机酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。青霉素本身为一元有机酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化合成盐类。青霉素游离酸易溶于醇、酸、醚、酯等普通有机溶剂，但在碳氢化合物青霉素游离酸易溶于醇、酸、醚、酯等普通有机溶剂，但在碳氢化合物中溶解度很小；在水中溶解度也很小，且会快速丧失抗菌能力。中溶解度很小；在水中溶解度也很小，且会快速丧失抗菌能力。青霉素金属盐类极易溶于水；几乎不溶于乙醚、氯仿、醋酸戊酯，略溶青霉素金属盐类极易溶于水；几乎不溶于乙醚、氯仿、醋酸戊酯，略溶于乙醇、丁醇、酮类和醋酸乙酯。于乙醇、丁醇、酮类和醋酸乙酯。青霉素钠盐、铵盐、钾盐吸湿性依次减小，钠盐比钾盐更不易保留。青霉素钠盐、铵盐、钾盐吸湿性依次减小，钠盐比钾盐更不易保留。青霉素游离酸不耐热，普通保留于冰箱中；但青霉素盐结晶纯品，稳定青霉素游离酸不耐热，普通保留于冰箱中；但青霉素盐结晶纯品，稳定性很好，在干燥条件下可于室温保留多年。性很好，在干燥条件下可于室温保留多年。青霉素钾盐结晶，青霉素钾盐结晶，150 150 加热加热1.5h1.5h效价无影响，所以结晶青霉素可效价无影响，所以结晶青霉素可干热灭菌。干热灭菌。青霉素临床上普通用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。青霉素临床上普通用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。粉针剂，使用期粉针剂，使用期2 2年年 临床用粉针剂，现用现配临床用粉针剂，现用现配13青霉素发酵生产工艺第13页抗菌作用和临床应用抗菌作用和临床应用青霉素主要抑制革兰氏阳性细菌，但对一些青霉素主要抑制革兰氏阳性细菌，但对一些革兰氏阴性细菌，螺旋体及放线菌也有较革兰氏阴性细菌，螺旋体及放线菌也有较强抗菌作用。青霉素抗菌作用与抑制细胞强抗菌作用。青霉素抗菌作用与抑制细胞壁合成相关。壁合成相关。青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。病、梅毒和炭疽等。14青霉素发酵生产工艺第14页青霉素应用青霉素应用溶血性链球菌感染。溶血性链球菌感染。肺炎链球菌感染。肺炎链球菌感染。不产青霉素酶葡萄球菌感染。不产青霉素酶葡萄球菌感染。炭疽。炭疽。破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感钩端螺旋体病。钩端螺旋体病。流行性脑脊髓膜炎。流行性脑脊髓膜炎。放线菌病。放线菌病。淋病。淋病。除脆弱拟杆菌以外许多厌氧菌感染。除脆弱拟杆菌以外许多厌氧菌感染。青霉素与氨基糖苷灯药品联适用于治疗草绿色链球菌心内青霉素与氨基糖苷灯药品联适用于治疗草绿色链球菌心内膜炎。膜炎。15青霉素发酵生产工艺第15页青霉素发酵生产工艺青霉素发酵生产工艺16青霉素发酵生产工艺第16页17青霉素发酵生产工艺第17页青霉素制备普通流程图青霉素制备普通流程图菌种菌种孢子制备孢子制备种子制备种子制备发酵发酵发酵液预处理及种子加滤发酵液预处理及种子加滤提取及精制提取及精制成品检验成品检验成品包装成品包装前体前体发酵阶段发酵阶段提取精制提取精制18青霉素发酵生产工艺第18页菌种菌种 当前国内青霉素生产菌按其在深层培当前国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝形态分为丝状菌和球状菌两种，养中菌丝形态分为丝状菌和球状菌两种，依据丝状菌产生孢子颜色又分为黄孢子丝依据丝状菌产生孢子颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，惯用菌种为绿孢子状菌和绿孢子丝状菌，惯用菌种为绿孢子丝状菌，如丝状菌，如产黄青霉素产黄青霉素。19青霉素发酵生产工艺第19页菌种菌种 青霉素最初生产菌为音符型青霉菌，生青霉素最初生产菌为音符型青霉菌，生产能力仅为几十个单位，不能满足工业生产能力仅为几十个单位，不能满足工业生产需要。以后发觉适合深层培养新菌种产需要。以后发觉适合深层培养新菌种产黄青霉，生产能力产黄青霉，生产能力100U/ml100U/ml，经不停诱，经不停诱变选育，当前平均生产能力变选育，当前平均生产能力66000-66000-70000U/ml70000U/ml，国际最高生产能力已超，国际最高生产能力已超100000U/ml100000U/ml。20青霉素发酵生产工艺第20页青霉素产生菌生长过程青霉素产生菌生长过程分生孢子发芽期分生孢子发芽期菌丝繁殖期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒形成期脂肪粒降低，小空孢脂肪粒降低，小空孢大空孢大空孢自溶自溶菌丝生长久菌丝生长久青霉素分泌期青霉素分泌期菌丝自溶期菌丝自溶期21青霉素发酵生产工艺第21页 14期为菌丝生长久，期为菌丝生长久，3期菌体适宜为种子。期菌体适宜为种子。45期为生产期，生产能力最强，经过工期为生产期，生产能力最强，经过工程办法，延长此期，取得高产。程办法，延长此期，取得高产。在第六期到来之前结束发酵。在第六期到来之前结束发酵。22青霉素发酵生产工艺第22页青霉素发酵过程中代谢改变分为青霉素发酵过程中代谢改变分为菌体生长、青霉素菌体生长、青霉素合成和菌体自溶合成和菌体自溶三个阶段。三个阶段。菌体生长阶段菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在适：发酵培养基接种后生产菌在适当环境中经过短时间适应，即开始发育、生长当环境中经过短时间适应，即开始发育、生长和繁殖，直至到达菌体临界浓度。和繁殖，直至到达菌体临界浓度。青霉素合成阶段青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，：这个阶段主要合成青霉素，青霉素生产速率到达最大，并一直维持到青霉青霉素生产速率到达最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌呼吸强度普通无显著改变。增加，但产生菌呼吸强度普通无显著改变。菌体自溶阶段菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始：这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，下降，氨基氮增加，PHPH上升。上升。23青霉素发酵生产工艺第23页丝状菌三级丝状菌三级发酵工艺流程发酵工艺流程冷冻管（冷冻管（25C25C，孢子培养，孢子培养，7 7天）天）斜面母瓶斜面母瓶（25C25C，孢子培养，孢子培养，7 7天）天）大米孢子（大米孢子（26C26C，种子培养，种子培养56h56h）一级种子培养液（一级种子培养液（27C27C，种子培养，种子培养，24h24h）二级种子培养液二级种子培养液（2726C,2726C,发酵发酵,7,7天）天）发酵液。发酵液。24青霉素发酵生产工艺第24页青霉素发酵过程青霉素发酵过程青霉素发酵时，青霉素生产菌在青霉素发酵时，青霉素生产菌在适当培养基、适当培养基、PHPH、温、温度和通气搅拌度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。等发酵条件下进行生长并合成青霉素。发酵开始前，相关设备和培养基（主要是碳源、氮源、发酵开始前，相关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过前体和无机盐等）必须先经过灭菌灭菌，后接入种子。，后接入种子。在整个过程中，需要不停通气和搅拌，维持一定罐温在整个过程中，需要不停通气和搅拌，维持一定罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂泡沫剂，假如酸碱，假如酸碱控制发酵液控制发酵液PHPH，还需要间歇或连续加入葡萄糖及铵盐，还需要间歇或连续加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充等化合物以补充碳源及氮源碳源及氮源，或补进其它料液和前体，或补进其它料液和前体等以促进青霉素生产。等以促进青霉素生产。25青霉素发酵生产工艺第25页青霉素发酵青霉素发酵发酵工艺控制：发酵工艺控制：1.基质浓度基质浓度 2.培养基成份控制培养基成份控制 3.温度温度 4.pH 值、溶氧值、溶氧 5.菌丝状态菌丝状态 6.泡沫控制泡沫控制26青霉素发酵生产工艺第26页发酵工艺控制发酵工艺控制 1.基质浓度基质浓度：在发酵过程中，经常因为前期基质量浓度过在发酵过程中，经常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖阻遏和抑制抑制（如葡萄糖阻遏和抑制,苯乙酸生长抑制）苯乙酸生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成。所以，所以，在青霉素发酵中通常采取补料分批操在青霉素发酵中通常采取补料分批操作法作法，以维持一定最适浓度，以维持一定最适浓度。27青霉素发酵生产工艺第27页发酵工艺控制发酵工艺控制2.培养基成份控制培养基成份控制:A.碳源：碳源：发酵中惯用乳酸或葡萄糖。发酵中惯用乳酸或葡萄糖。乳糖最为廉价，但因货源较少，很多国家采取葡乳糖最为廉价，但因货源较少，很多国家采取葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超出一定程度时，会过萄糖代替。但当葡萄糖浓度超出一定程度时，会过分加速菌体呼吸，以至培养基中溶解氧不能满足需分加速菌体呼吸，以至培养基中溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，造成或培养基中，造成pH下降，影响一些酶活性，从而下降，影响一些酶活性，从而抑制微生物生长和产物合成。抑制微生物生长和产物合成。当前普遍采取淀粉酶水解产物，葡萄糖化液流加，当前普遍采取淀粉酶水解产物，葡萄糖化液流加，以降低成本。以降低成本。28青霉素发酵生产工艺第28页发酵工艺控制发酵工艺控制B.氮源：氮源：主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米浆为较理想氮源，含固体量少，有利于玉米浆为较理想氮源，含固体量少，有利于通气及氧传递，因而利用率较高。通气及氧传递，因而利用率较高。有机氮源还能够提供一部分有机磷，供菌体有机氮源还能够提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。使用。29青霉素发酵生产工艺第29页发酵工艺控制发酵工艺控制C.无机盐：无机盐：碳酸钙用来中和发酵过程中产生杂酸，并控制发酵液碳酸钙用来中和发酵过程中产生杂酸，并控制发酵液pH值值 为菌体提供营养无机磷源普通采取磷酸二氢钾。为菌体提供营养无机磷源普通采取磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需硫。需硫。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在含量在30ug/mL以下。现在还有一些工厂采取铁罐发酵，以下。现在还有一些工厂采取铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐步进入发酵液；发酵时间愈长，在发酵过程中铁离子便逐步进入发酵液；发酵时间愈长，则铁离子愈多。铁离子在则铁离子愈多。铁离子在50g/ml以上便会影响青霉素合以上便会影响青霉素合成。所以青霉素发酵罐采取不锈钢制造为宜。成。所以青霉素发酵罐采取不锈钢制造为宜。30青霉素发酵生产工艺第30页发酵工艺控制发酵工艺控制D.前体：前体：前体加入是青霉素发酵关键问题之一。前体加入是青霉素发酵关键问题之一。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，能够借酰基转移作用，将添加苯乙酸或者苯乙酰胺，能够借酰基转移作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提升青霉素苯乙酸转入青霉素分子，提升青霉素G生产强度。生产强度。但苯乙酸对发酵有影响，普通以苯乙酰胺很好。但苯乙酸对发酵有影响，普通以苯乙酰胺很好。也有采取苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇也有采取苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。前体要在发酵开始前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中后加入，并在整个发酵过程中控制在控制在50g/ml左右。前体用量大于左右。前体用量大于0.1%时，青霉素生物时，青霉素生物合成均下降。所以普通发酵液中前体浓度以一直维持在合成均下降。所以普通发酵液中前体浓度以一直维持在0.1%为宜。为宜。31青霉素发酵生产工艺第31页发酵工艺控制发酵工艺控制3.温度温度：青霉素发酵最适温度随所用菌株不一样可能青霉素发酵最适温度随所用菌株不一样可能稍有差异稍有差异,但普通认为应在但普通认为应在25 C 左右。温度过高左右。温度过高将显著降低发酵产率将显著降低发酵产率,同时增加葡萄糖维持消耗同时增加葡萄糖维持消耗,降低葡萄糖至青霉素转化率。对菌丝生长和青霉降低葡萄糖至青霉素转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说素合成来说,最适温度不是一样最适温度不是一样,普通前者略高于普通前者略高于后者后者,故有发酵过程在菌丝生长阶段采取较高温度，故有发酵过程在菌丝生长阶段采取较高温度，以缩短生长时间以缩短生长时间,抵达生产阶段后便适当降低温度抵达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素合成。以利于青霉素合成。32青霉素发酵生产工艺第32页发酵工艺控制发酵工艺控制4.pH 值、溶氧值、溶氧：pHpH值：青霉素发酵最适值：青霉素发酵最适pH pH 值普通认为在值普通认为在6.87.2 左右左右,应尽可能防止应尽可能防止 pH pH 值超出值超出7.07.0。因为青霉素在碱性。因为青霉素在碱性条件下不稳定条件下不稳定,轻易加速其水解。轻易加速其水解。溶氧溶氧:对于好氧青霉素发酵来说对于好氧青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵溶氧浓度是影响发酵过程一个主要原因。当溶氧浓度降到过程一个主要原因。当溶氧浓度降到30%30%饱和度以下时饱和度以下时,青青霉素产率急剧下降霉素产率急剧下降,低于低于10%10%饱和度时饱和度时,则造成不可逆损害。则造成不可逆损害。溶氧浓度过高溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸造成呼吸强度下降强度下降,一样影响生产能力发挥。一样影响生产能力发挥。在罐夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。在罐夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。在整个发酵过程中，需不停通无菌空气和搅拌，以维在整个发酵过程中，需不停通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。持一定罐压或溶氧。33青霉素发酵生产工艺第33页5.菌丝状态：菌丝状态：菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不超出浓度不超出临界菌体浓度临界菌体浓度,从而使氧从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上到达平衡。平上到达平衡。菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长条菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长条件下，当比生长速率低于件下，当比生长速率低于0.015h-10.015h-1时，时，比生产速率与比生长速率成正比。所比生产速率与比生长速率成正比。所以以,要在发酵过程中到达并维持最大要在发酵过程中到达并维持最大比生产速率比生产速率,必须使比生长速率不低必须使比生长速率不低0.015h-10.015h-1。菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生长和结球生长两种形态。在丝丝状生长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中状菌发酵中,控制菌丝形态使其保持控制菌丝形态使其保持适当分支和长度适当分支和长度,并防止结球并防止结球,是取是取得高产关键要素之一。而在球状菌发得高产关键要素之一。而在球状菌发酵中酵中,使菌丝球保持适当大小和松紧使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽可能降低游离菌丝含量并尽可能降低游离菌丝含量,也是充也是充分发挥其生产能力关键素之一。分发挥其生产能力关键素之一。34青霉素发酵生产工艺第34页发酵工艺控制发酵工艺控制6.泡沫控制泡沫控制：在发酵过程中产生大量泡沫在发酵过程中产生大量泡沫,能够用天然油脂能够用天然油脂,如豆油、如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌泡敌”来消泡。来消泡。应该控制其用量并要少许屡次加入应该控制其用量并要少许屡次加入,尤其在发酵前期尤其在发酵前期不宜多用不宜多用,不然会影响菌体呼吸代谢不然会影响菌体呼吸代谢。加消沫剂控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调整发酵加消沫剂控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调整发酵液液pHpH。35青霉素发酵生产工艺第35页染染 菌菌 处处 理理 染菌是发酵工业长久以来不能彻底处理染菌是发酵工业长久以来不能彻底处理问题，所以怎样处理染菌问题就成了发酵问题，所以怎样处理染菌问题就成了发酵工业工作重点之一。要处理染菌问题首要工业工作重点之一。要处理染菌问题首要问题就是要能检测出是否染菌。问题就是要能检测出是否染菌。染菌通常经过三个路径发觉：无菌试验，染菌通常经过三个路径发觉：无菌试验，发酵液直接镜检，发酵液生化分析。其中发酵液直接镜检，发酵液生化分析。其中无菌试验是判断染菌主要依据。无菌试验是判断染菌主要依据。36青霉素发酵生产工艺第36页染染 菌菌 处处 理理染菌在发酵过程每个阶段都可能发生，下面就各染菌在发酵过程每个阶段都可能发生，下面就各个不一样阶段染菌情况和处理方法一一说明。个不一样阶段染菌情况和处理方法一一说明。种子培养期染菌种子培养期染菌 发酵前期染菌发酵前期染菌 发酵中期染菌发酵中期染菌 发酵后期染菌发酵后期染菌 37青霉素发酵生产工艺第37页染染 菌菌 处处 理理种子培养期染菌种子培养期染菌 种子培养主要是生长繁殖菌体。此时菌体浓种子培养主要是生长繁殖菌体。此时菌体浓度低，培养基营养丰富，所以轻易染菌。种子培度低，培养基营养丰富，所以轻易染菌。种子培养期染菌，带进发酵罐中危害极大，应严格控制养期染菌，带进发酵罐中危害极大，应严格控制种子污染。当发觉种子受污染后均应灭菌后弃去，种子污染。当发觉种子受污染后均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检验和彻底灭菌。并对种子罐、管道进行检验和彻底灭菌。返返 回回38青霉素发酵生产工艺第38页染染 菌菌 处处 理理发酵前期染菌发酵前期染菌 发酵前朗主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成发酵前朗主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成极少，染菌后杂菌轻易繁殖，与生产菌争夺营养极少，染菌后杂菌轻易繁殖，与生产菌争夺营养成份和氧分，严重干扰生产菌生长繁殖和产物生成份和氧分，严重干扰生产菌生长繁殖和产物生成，所以要尤其注意发酵前期染菌。当发酵前期成，所以要尤其注意发酵前期染菌。当发酵前期染菌时，因为营养成份消耗不多，能耗也不大，染菌时，因为营养成份消耗不多，能耗也不大，从经济性角度考虑应快速重新灭菌，补充必要营从经济性角度考虑应快速重新灭菌，补充必要营养成份，重新接种进行发酵。养成份，重新接种进行发酵。返返 回回39青霉素发酵生产工艺第39页染染 菌菌 处处 理理发酵中期染菌发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰生产菌代谢，影响产发酵中期染菌将严重干扰生产菌代谢，影响产物生成。如产酸，产泡沫，使菌体自溶，使发酵物生成。如产酸，产泡沫，使菌体自溶，使发酵液变臭等。发酵中期染菌，因为营养成份大量消液变臭等。发酵中期染菌，因为营养成份大量消耗，普通挽救处理困难，危害性大，发酵中期染耗，普通挽救处理困难，危害性大，发酵中期染菌应做到早发觉，早处理，通常做法是菌应做到早发觉，早处理，通常做法是“倒罐倒罐”，即用一罐没有染菌发酵液与染菌发酵液混合，使即用一罐没有染菌发酵液与染菌发酵液混合，使有害菌浓度下降，生产菌浓度提升进而重新成为有害菌浓度下降，生产菌浓度提升进而重新成为优势生长菌群。显然，倒罐必定造成物料消耗和优势生长菌群。显然，倒罐必定造成物料消耗和操作费用增加。操作费用增加。返返 回回40青霉素发酵生产工艺第40页染染 菌菌 处处 理理发酵后期染菌发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多，效价已经很高，营发酵后期产物积累较多，效价已经很高，营养物质靠近耗尽，此时如染菌量不多，可继续进养物质靠近耗尽，此时如染菌量不多，可继续进行发酵，如严重污染也可提前放罐，停顿发酵，行发酵，如严重污染也可提前放罐，停顿发酵，这在经济上往往是合算。这在经济上往往是合算。41青霉素发酵生产工艺第41页下游操作下游操作过滤过滤萃取萃取脱色脱色结晶结晶42青霉素发酵生产工艺第42页发酵液预处理发酵液预处理青霉菌素发酵后，放罐，加少许絮凝剂沉淀蛋白，青霉菌素发酵后，放罐，加少许絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤（青霉菌丝较粗，然后经真空转鼓过滤或板框过滤（青霉菌丝较粗，过滤较轻易）过滤较轻易），除掉菌丝体及部分蛋白，过滤收，除掉菌丝体及部分蛋白，过滤收率普通在率普通在90%90%左右。左右。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷却至青霉素易降解，发酵液及滤液应冷却至10 10 低温低温保留，备后续提取精制保留，备后续提取精制。通常发酵液中青霉素浓度很低，仅通常发酵液中青霉素浓度很低，仅0.1%4.5%左左右，而杂质浓度比青霉素高几十倍甚至几千倍。右，而杂质浓度比青霉素高几十倍甚至几千倍。发酵液中常见杂质有：菌丝、未用完培养基、易发酵液中常见杂质有：菌丝、未用完培养基、易污染杂菌、产生菌代谢产物等。污染杂菌、产生菌代谢产物等。43青霉素发酵生产工艺第43页 提提 取取溶媒萃取法溶媒萃取法 青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调整pH，再转入中性水相，重复几次萃取，即可提纯浓缩。惯用有机溶剂：醋酸丁酯（或戊酯）44青霉素发酵生产工艺第44页 提提 取取溶媒萃取法溶媒萃取法 萃取2-3次。从发酵液萃取到醋酸丁酯时，pH选择1.8-2.0，从醋酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.4。发酵滤液与醋酸丁酯体积比3-4。萃取总收率在85%左右。45青霉素发酵生产工艺第45页青青 霉霉 素素 提提 取取青霉素提取遵照下面四个标准青霉素提取遵照下面四个标准：时间短时间短 温度低温度低 pH适中适中 勤清洗消毒勤清洗消毒46青霉素发酵生产工艺第46页脱色脱色 萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。除去活性炭。47青霉素发酵生产工艺第47页结晶结晶 萃取液普通经过结晶提纯萃取液普通经过结晶提纯。直接结晶：在直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾乙乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液，得到青霉素钾盐。醇溶液，得到青霉素钾盐。共沸蒸馏结晶：萃取液，再用共沸蒸馏结晶：萃取液，再用0.5 M NaOH萃萃取，取，pH6.4-4.8下得到钠盐水浓缩液。加下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体倍体积丁醇，积丁醇，1626，0.67-1.3KPa下蒸馏。水和下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素钠产品。过洗涤、干燥后，得到青霉素钠产品。48青霉素发酵生产工艺第48页青霉素钾盐发酵生产流程青霉素钾盐发酵生产流程49青霉素发酵生产工艺第49页谢谢！谢谢！50青霉素发酵生产工艺第50页