华中大-微生物学实验讲义.doc

实验一 微生物制片及形态观察一、细菌简单染色法及形态观察（一）基本原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。（二）实验材料1菌种：大肠杆菌、酵母菌的斜面培养物。2染色剂：吕氏碱性美蓝、草酸铵结晶紫等。3仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸等。（三）实验步骤1. 涂片：取一块载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，从菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，并涂成薄膜。涂片要涂抹均匀，不宜过厚。2. 干燥：室温自然干燥或烘干。3. 固定：涂面朝上，通过火焰23次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同时还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。4. 染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加12滴染液于涂片上。草酸铵结晶紫染色约1 min；若用吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色12 min。5. 水洗：倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。6. 干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。7. 镜检：涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。（四）实验报告内容根据观察结果，绘出所观察细菌的形态图。二、革兰氏染色法（一）基本原理革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌，细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。而革兰氏阴性菌：细胞壁肽聚糖层较薄、网状结构交联少，且类脂质含量较高，经乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫碘的复合物被溶出细胞壁，细胞被脱色，复染后，细胞被染上复染剂的颜色。（二）实验材料1菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。2染色剂：革兰氏染色液。3仪器或其他用具同实验一。（三）实验步骤1制片：取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色2 min。 3媒染：先用水冲去染色液，再用滴加碘液覆盖约1 min。 4脱色：将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约2030 s。 5复染：用蕃红液复染约2 min，水洗。 6镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。混合涂片染色：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片进行比较。（四）实验报告内容根据观察结果，绘出所观察细菌的形态图。三、细菌的芽孢染色（一）基本原理芽孢又叫内生孢子是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行简单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。芽孢染色是用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。（二）实验材料1菌种：枯草芽孢杆菌的斜面培养物。2染色剂：5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。3仪器或其它用具：小试管，滴管，烧杯、试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。（三）实验步骤1. 制片：按常规涂片、干燥、固定。2. 染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5 min。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。3. 水洗：待玻片冷却后，用自来水冲洗，直至流出的水无色为止。4. 复染：用番红染液复染2 min 。5. 水洗：水洗后，吸干。6. 镜检：从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。（四）实验报告内容根据观察结果，绘出所观察细菌的形态图。四、酵母菌的形态结构观察（一）基本原理在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为15530 m、，最大可达100 m。各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。大多数酵母在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶见黑色）。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖或裂殖，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。（二）实验材料1菌种：酿酒酵母。2染液及溶液：蕃红染液。3其它物品：载玻片及盖玻片等。（三）实验内容个体形态特征与出芽繁殖的观察：酵母细胞较大，用水浸片法观察，即在载玻片中央滴加一滴水，滴加一小滴蕃红液，用接种环取酿酒酵母少许（并注意酵母菌与培养基结合是否紧密），置于水与蕃红的混合液中，制成菌悬液。将盖玻片斜置轻轻盖在液滴上。先用低倍镜，再换高倍镜观察酵母细胞的形状。（四）实验报告内容根据观察结果，绘出所观察菌体的形态图。实验二 微生物显微计数（一）实验原理利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但是不论哪一种，一个大方格，都等分成（2516或1625）400个小方格。因为每个大方格边长为1 mm，载片与盖片间距离为0.1 mm，所以每个计数室（1个大方格）体积为0.1 mm3。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出每毫升菌液内所含的菌数。（二）实验材料1. 器材：血球计数板、显微镜。2. 菌种：酿酒酵母菌液。（三）操作步骤1. 血球计数板的操作1）取一个清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片放置在计数室上；2）把酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有35个酵母菌为宜；3）摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜太多），使菌液自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；注意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5 min；4）将计数板放置在显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下进行观察和计数。2. 计数方法1）不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（1625），应当数4角4个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方格的（2516），除取4角4个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。注意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数；位于两个中方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上不数下，数左不数右；2）每个样品重复（需重新加样）计数23次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平均值；3）按下列公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数；每小方格内菌数4106稀释倍数（四）实验报告内容记录计数结果，并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数。实验三 培养基配制及灭菌一、培养基的常规配制程序正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同。（一）实验材料 1. 药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液等。2. 仪器：天平或台秤、高压蒸汽灭菌锅。3. 玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。4. 其它物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。（二）实验步骤1. 玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。详见附录一。2. 灭菌前玻璃器皿的包装(1) 培养皿的包装：培养皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。(2) 移液管的包装：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5 cm左右，棉花自身长度约11.5 cm。塞棉花时，可用一外圈拉直的回形针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将牛皮纸或报纸裁成宽约5 cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45角，折迭纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折迭打结，准备灭菌。3. 液体及固体培养基的配制过程1）液体培养基配制称量：一般可用1/l00粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。称牛肉膏、蛋白胨时要用小烧杯进行称量。溶化：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶化。定容：待全部药品溶化后，倒入搪瓷杯中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积的溶液，加入到培养基中。调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪取一小段pH试纸，然后用镊子夹住pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分；边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2）固体培养基的配制 配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.52)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。 4. 培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉或卷纸，擦去管口或瓶口的培养基。 1）试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15150 mm时，液体培养基可分装至试管高度l/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中；用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/3 (约10 m1)；半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。2）锥形瓶的分装用于振荡培养微生物用时，可在250 m1锥形瓶中加入50 m1的液体培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250 ml锥形瓶中加入150 m1液体培养基，然后再加入3 g琼脂粉(按2计算)，灭菌时瓶中琼脂同时被融化。5. 棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。1）试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折迭卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞，直接盖在试管口上，灭菌待用。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。2）锥形瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口上，既保证良好通气，过滤除菌又操作简便，故极受欢迎。在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。 6. 培养基的灭菌 培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，121灭菌15 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。 7. 斜面和平板的制作1）斜面的制作将已灭菌装有固体培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度为试管长度1/3，底层长为试管的2/3。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。2）平板的制作将装在锥形瓶中已灭菌的固体培养基融化后，待冷至60左右倾入无菌培养皿中。冷凝后即成平板。倒平板时，培养基温度过高，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45，培养基易于凝固而无法制作平板。8. 培养基的无菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出12管(瓶)，置于37温箱中培养12d，确定无菌后方可使用。二、细菌、放线菌常用培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。牛肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。而LB培养基的主要成分是胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。培养基都是水溶液，这是因为一切生物细胞都必须要水，蒸馏水不含杂质，比自来水好，特别是配制合成培养基时都必须用蒸馏水，配天然培养基时可用自来水，但自来水中常含Ca2+，Mg2+离子，易与其它成分形成沉淀。高氏合成号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HPO4、MgSO4和FeSO4为无机盐等。（一）实验材料1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、Mg2SO47H2O、FeSO47H2O等。2. 溶液：1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl。3. 仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅。4. 玻璃器皿：移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。5. 其它物品：药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。（二）实验步骤 1. 肉膏蛋白胨培养基的配制1）培养基成分：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，琼脂2 g，水100 ml，pH 7.2。 2）配制方法称量及溶化：取一干净小烧杯置于电子称上，去皮，分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，用玻棒挑取牛肉膏刮于一小烧杯壁上，进行称量，然后加入少量蒸馏水，加热溶化后倒入搪瓷杯中。将搪瓷杯置于电炉上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。定容：补充水量至所需体积。调pH：待溶液冷至室温时，用1 mol/L NaOH溶液调pH至7.07.2。 加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水（亦可不用融化琼脂，pH调好后直接分装后，将所需琼脂装入三角瓶或试管中，注意琼脂要没入液体中，然后包扎灭菌）。 分装、加塞、包扎。高压蒸汽灭菌：121灭菌15 min。2. 高氏合成号培养基的配制1）培养基成分：可溶性淀粉2 g，KNO3 0.1g，K2HPO43H2O 0.05 g，NaCl 0.05 g，MgSO47H2O 0.05 g，FeSO47H2O 0.001 g，琼脂2 g，蒸馏水100 ml，pH 7.27.4。2）配制方法称量及溶化：用小烧杯称量可溶性淀粉，加入少量蒸馏水，将淀粉调成糊状，置于电炉上加热，边加热边搅拌至沸腾，使淀粉完全溶化。然后倒入搪瓷杯中，再加入所需水量的/左右。分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4和MgSO4，分别溶解后倒入上述搪瓷杯中。按每100 m1培养基加入1FeSO4溶液0.1 ml的量加入FeSO4。定容：加水至所需体积。调pH：用1mol/L NaOH溶液调pH至7.4。加琼脂：加入所需重量的琼脂，加热融化，补充失水。分装、加塞、包扎。高压蒸汽灭菌：121灭菌15 min。 三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。（一）实验材料1. 药品：葡萄糖、琼脂等。2. 仪器：天平、高压蒸汽灭菌锅。3. 玻璃器皿：移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。4. 其它物品：药匙、pH试纸、称量纸、纱布、线绳、塑料试管盖、报纸等。（二）实验步骤1. 马铃薯葡萄糖培养基的配制1）培养基成分：马铃薯20 g，葡萄糖2 g，琼脂2 g，水100 m1，自然pH。2）配制方法配制20马铃薯浸汁：称取马铃薯40 g，加水300 ml，加热煮沸30 min，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积，即制成20马铃薯汁。配制：每100 ml马铃薯浸汁加入2 g葡萄糖和2 g琼脂，加热溶化，并补足失水。分装、加塞、包扎。高压蒸汽灭菌：121灭菌15 min。2. 豆芽汁葡萄糖培养基的配制1）培养基成分：黄豆芽10g，葡萄糖5 g，琼脂2 g，水100 ml，自然pH。2）配制方法称量溶化：称取新鲜黄豆芽20 g，置于烧杯中，加水300 ml，加热煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成l0豆芽汁。配制：每100 ml 10豆芽汁加入5 g葡萄糖和2 g琼脂，加热溶化，补足失水。分装、加塞、包扎。高压蒸汽灭菌：121灭菌15 min。（三）实验内容1. 配制下列固体培养基（200 ml），每组只配其中的一种培养基。 肉汤蛋白胨培养基、高氏号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁培养基（各组选择其中一种培养基进行配制）。2. 分装 3 支试管（每支约10 ml），余 170 ml 装入250 ml 三角瓶内。3. 包扎：10套平皿、6支（马铃薯培养基、豆芽汁培养基5支）试管（装入自来水 9 ml）、1 ml移液管6支（马铃薯培养基、豆芽汁培养基5支）、三角涂布棒2支。4. 以上物品在121高温蒸气灭菌备用。实验四 土壤微生物分离与纯化土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。（一）实验材料1. 菌源：土壤菌悬液。2. 培养基：肉膏蛋白胨培养基、高氏合成l号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁培养基。3. 其它物品：培养皿、移液管、玻璃涂棒、称量纸、药勺、橡皮头等。（二）实验步骤本次实验采用涂布法。1. 制备土壤稀释液：已制备。2. 倒平板：将已灭菌的培养基倾注到10个培养皿中，待冷凝后即成平板。在皿盖上标明稀释度或编号。3. 梯度稀释：按10倍稀释法进行稀释分离，以制备106稀释度为例，具体操作过程如下，第一步：制备土壤菌悬液；第二步：取 6 支无菌水试管，按 101106 顺序编号，放在试管架上；第三步：吸取 1 m1 土壤菌悬液注入第一支盛有9 ml 无菌水试管中，一手拿试管，在另一手掌上反复击打振荡20次以上，制成101的土壤稀释液；第四步：另取一支无菌取移液管，从101 稀释液试管内吸出1 m1 菌悬液，加入到第二支装有 9 ml 无菌水试管中，反复敲打振荡20 次，制成102土壤稀释液。用同法再制成 103、104、105 、106 的土壤稀释液。图45 梯度稀释示意图4. 涂布法分离：用无菌移液管吸取106稀释度菌悬液0.2 ml，滴加于相应编号的培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一条缝，在火焰旁或超净台上，右手持玻璃涂棒于平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破，重复涂 3 皿。依此法将105、104稀释液各涂 3 皿。5.培养：涂布完毕，将平板倒置于恒温箱中培养，培养23d后观察结果。将用过的移液管冲洗后用来苏尔水浸泡1h灭菌后再洗涤。6. 微生物菌落计数(平板菌落计数法)含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目，推算出每克（毫升）含菌样品中所含的活菌总数。一般由三个稀释度计算出的每克（毫升）含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。 7. 平板菌落形态及个体形态观察从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，视其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。8. 分离纯化菌株转接斜面（斜面接种）在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的菌落各挑选一个用接种环接种到斜面上。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面上，放线菌接种于高氏1号斜面上，酵母菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上，霉菌接种于马铃薯葡萄糖斜面上。贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种。置冰箱保藏。（三）实验报告内容计算你所分离的微生物平板菌落计数结果。实验五 环境因素对微生物生长的影响（一）目的要求了解某些物理因素、化学因素和生物因素对微生物生长的影响及芽孢对不良环境的抵抗能力。（二）基本原理环境因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)，如温度、渗透压、紫外线、pH、氧气、某些化学药品及拮抗菌等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响。不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽孢，对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。我们可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而使有益微生物得到发展。（三）实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌。2. 培养基：肉膏蛋白胨培养基。3. 其它物品：培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅。4. 药品：1%新洁尔灭、5%来苏儿水、10%青霉素、40%甲醛和75%乙醇。（四）实验步骤1.微生物检查：将100 ml 培养基融化后，倒4个平板，每皿约25 ml培养基，冷却。检查纸币、手指、空气及咳嗽中的微生物，至 37恒温培养。2. 理化因素对微生物的影响：(1) 取5个无菌培养皿，在皿底写明测试药品名称。(2) 将100 ml肉膏蛋白胨培养基融化，并冷却至50左右后加入2 ml金黄色葡萄球菌菌悬液，迅速混匀，倾入无菌培养皿中，每皿约20 ml，倒 5 皿，冷凝，即制成含菌平板。(3) 将镊子在酒精灯上灼烧后取分别浸泡在1%新洁尔灭、5%来苏儿水、10%青霉素、40%甲醛和75%乙醇药品溶液中的滤纸片各一片，置于含菌平板的中央。(4) 将平板倒置于37温箱中，培养24h后观察结果，测量并记录抑菌圈的直径。根据其直径的大小，可初步确定测试药品的抑菌效能。实验六 深层培养生产-淀粉酶及其酶活测定枯草杆菌细胞为杆状，能产生淀粉酶、蛋白酶等，因而可以液化明胶、水解干酪素、糖化淀粉；一般培养基上生长茂盛，菌落为蔓延性，灰白、淡黄至黄色，少数为黑色，细皱或折迭。在5056时能生长，适温3037。为需氧菌。存在于土壤、枯草中。在培养基中加入淀粉，可以刺激枯草芽孢杆菌产生-淀粉酶来分解培养基中的淀粉，以满足其生长所需要的养分。由于微生物的多样性，其代谢能力不尽相同，利用同一种微生物对同一种物质进行发酵，通过酶活力检测，即可挑选出优良菌株，或是改进发酵工艺。（一）实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌（产-淀粉酶）。2. 液体培养基：细菌用培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）+ 0.5%淀粉。3. 试剂：碘液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 6.0）。4. 其它器皿：250 ml三角瓶、小试管、移液管、白瓷板、摇床、离心机、水浴锅。（二）实验方法1. 发酵培养1）配制液体培养基50 ml（牛肉膏蛋白胨培养基）+ 0.5 % 淀粉，装入250 ml三角瓶内。2）灭菌：121 高压蒸气灭菌15 min。3）接种：培养基冷却后，将枯草芽孢杆菌斜面菌接入液体培养基（注意无菌操作），室温37，旋转式摇床120 r / min培养1周。2. 酶活力检测1）取发酵液5 ml，装入离心管中，在5000 r / min下离心5 min，上清液即为粗酶液。2）配制50 ml 2 % 可溶性淀粉液，用100 ml的烧杯称取1 g可溶性淀粉，加入50 ml蒸馏水，然后在电炉上加热至液体清澈透明为止。3）向干净的试管中加入2 % 可溶性淀粉液10 m l及（pH 6.0）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 1 ml，在70 水浴中平衡约5 min左右，然后加入1 ml上清液（酶液），充分混匀并立即计时，继续在水浴锅中保温。5）每隔30 s 取1滴反应液滴入预先盛有比色稀碘液（4滴）的白瓷板空穴内，当颜色反应由紫色逐渐变为棕橙色，即为反应终点，记录时间。6）计算-淀粉酶活力( )：式中：t为反应时间（min）；n为酶液稀释倍数；1是使用的酶液量（ml）。（三）实验报告根据实验结果和计算公式，计算出枯草芽孢杆菌产-淀粉酶的酶活力，写实验报告。实验七 管碟法测抗生素效价（一）基本原理管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管，叫牛津杯，将抗生素溶液装满小杯，并在含有敏感实验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透作用，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数（cm2/h）、扩散时间（即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间）、培养基的厚度（mm）和最低抑菌浓度（U/ml）等因素有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。（二）实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌2. 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基3. 试剂：含10 000单位链霉素母液（三）实验步骤1. 配制培养基：每组配制牛肉膏蛋白胨固体培养基100 ml，装于250 ml锥形瓶内。2. 洗涤、包扎物品：每组包扎大平皿 1套。3. 配制链霉素标准品：不同浓度链霉素溶液。4. 制备混菌平板：将冷却至50 左右的培养基，加入金色葡萄球杆菌菌悬液2 ml，轻轻摇匀，倾入大培养皿中，凝固后即成混菌平板，备用。5. 放置牛津杯：在底皿上分别标上100、200、500、1000、1500和待测液，将已灭菌的牛津杯放置在与所标数字或标记对应的平板表面（共6个牛津杯）。6. 滴加链霉素标准品和样品：用移液枪将不同浓度的链霉素溶液和样品溶液分别滴加到相应的牛津杯中，每个牛津杯滴加200 L。滴加时必须仔细小心，忽使溶液溢出孔外。滴加完毕后，在上盖上标明班级、姓名，置于37恒温箱内培养。7. 抑菌圈直径的测量：用直尺测量抑菌圈的直径。8. 标准曲线的绘制：以各浓度的抑菌圈直径的平方为横坐标，以标准品浓度(U/ml)的对数值为纵坐标，用Excel制作标准曲线，并显示R值及公式。9. 发酵样品效价计算：以样品稀释液抑菌圈直径通过公式计算出效价单位，即得发酵液的效价单位。（四）实验报告内容依据所测量各浓度链霉素标准品和样品抑菌圈直径，制作链霉素标准曲线，并计算出样品的效价。实验八 产-淀粉酶菌株诱变选育（一）基本原理许多化学因素如硫酸二乙酯、亚硝酸等，对微生物都有诱变作用。硫酸二乙酯是一种烷化剂，能与DNA中碱基发生化学变化，从而引起DNA复制时碱基配对的转换或颠换。一般化学诱变剂都有毒性，很多还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取，并防止与皮肤直接接触。中止反应时，可以用大量稀释法或加入硫代硫酸钠。本实验以产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌为实验菌种，以硫酸二乙酯为诱变剂，根据枯草芽孢杆菌诱变后在培养基上出现的透明圈直径大小，来指示诱变效应。（二）实验材料1. 菌种：菌悬液2. 培养基：肉膏蛋白胨培养基0.5 可溶性淀粉。3. 主要药品：硫酸二乙酯（简写DES）、25 硫代硫酸钠。（三）实验步骤1. 配制肉膏蛋白胨培养基：每组配制200 ml，分装3支试管（每支约10 ml），剩余的装入250 ml的三角瓶内；2. 包扎：平皿10套，1 ml 移液管5支，涂棒2支，试管6支（1支装自来水8 ml，5支装自来水9 ml）。以上各器皿及培养基在121 ，灭菌15 min。3. 倒平板：将已灭菌的培养基，在超净台上倒10个平板。静置冷凝，备用。4. 诱变处理：1）诱变：吸取1 ml菌悬液至盛有8 ml无菌水的试管内，再加硫酸二乙酯0.5 ml，振荡处理3 min。2）终止反应：振荡处理后，立即加入25 硫代硫酸钠溶液0.5 m1中止反应。3）稀释并涂平板：中止反应后的菌悬液以10倍稀释法作一系列稀释至105（具体可按估计的存活率进行稀释）。取最后3个稀释度涂平板，每个稀释度涂3个平板。每个平板加菌稀释液0.2 m1，用无菌玻璃涂棒涂均匀。以同样操作，取未经硫酸二乙酯处理的菌稀释液（104、105和106）涂布平板作对照，各梯度3个平板。平板背面要写明组别、处理时间、稀释度，并置于37 恒温培养箱中培养。5. 计算存活率及致死率：将培养后的平板取出进行细胞计数，根据对照平板上的菌落数，计算出每毫升菌悬液中的活菌数；同样依据诱变后的菌落数计算出诱变处理后的存活细胞数及其致死率。6. 筛选在平板上滴加碘液，依据所出现透明圈的大小，挑选菌株。一般地说，透明圈越大，酶活性越高；透明圈越小，则酶活性越低。选出酶活性高的菌落转接斜面，培养后留待复筛。（四）实验报告内容 依据实验所得数据计算出经DES不同时间处理后的枯草芽孢杆菌存活率及致死率。14 / 14