生物化学与分子生物学实验指导.doc

嘉兴学院自编教材生物化学与分子生物学实验生物化学教研团队汇编嘉兴学院生化实验中心1. 绪论 生物化学与分子生物学实验属于化学类实验。对于大多数学生来说，这不是第一次做化学类的实验，但是生物化学与分子生物学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的科学研究中常用的实验方法。同学们在生物化学与分子生物学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。 当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出“克”数量级的产物。同学们将进行的是“毫克”和“微克”数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到“眼睛”的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。 同学们通过生物化学实验应该做到：学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。掌握生物化学与分子生物学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。 预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！1.1 生物化学与分子生物学实验技术发展简史 生物科学在20世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。 20年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000g（5000 r/min8000 r/min）相对离心力的超离心机(相对离心力“RCF”的单位可表示为“g”)，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。 30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。 40年代： 层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。 “电泳技术”是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。 60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。 1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。 此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在19681972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。 70年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。 1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。 除上述历史以外，还可以列出许多生物化学与分子生物学发展史上的重要成就，例如： 美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。 美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。 英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。 英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。 1959年，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。 1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪4070年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。 由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。1.2 实验室规则 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和HPLC等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。 每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。 每位学生要熟悉实验室内电闸的位置，烘箱和电炉用毕必须立即断电，不得过夜使用， 要严格遵守实验室安全用电规则和其他安全规则。 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。1.3 实验室安全及防护知识 在生物化学与分子生物学实验室（以下简称生化实验室）中可以说是“五毒”俱全，即着火、爆炸、中毒、触电、和割伤的危险均时刻存在。因此每一位在生化实验室工作的人员都必须有充分的安全意识，严格的防范措施和丰富实用的防护救治知识，一旦发生意外能正确地进行处置，以防事故进一步扩大。1.3.1 着火 生化实验室经常使用大量的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而实验室又经常使用电炉、酒精灯等火源，因此极易发生着火事故。常用有机溶剂的易燃性列表如下：表1-1 常见有机液体的易燃性名称沸 点/闪 点/自燃点/乙 醚 34.5 40180丙 酮5617538二硫化碳4630100 苯8011乙醇（95）7812 400 闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。 自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。 由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。 预防火灾必须严格遵守以下操作规程： 严禁在开口容器和密闭体系中用明火加热有机溶剂，只能使用加热套或水浴加热。 废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道。 不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。 在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。 灭火方法： 实验室中一旦发生火灾切不可惊慌失措，要保持镇静，根据具体情况正确地进行灭火或立即报火警（火警电话119）。 容器中的易燃物着火时，用灭火毯盖灭。因己确证石棉有致癌性，故改用玻璃纤维布作灭火毯。 乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。 导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用1211灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。 个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。1.3.2 爆炸 生化实验室防止爆炸事故是极为重要的，因为一旦爆炸其毁坏力极大，后果将十分严重。生物化学实验室常用的易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限（体积）见表1-2。 加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物氧化铜、 浓硫酸高锰酸钾、 三氯甲烷丙酮等。 常见的引起爆炸事故的原因有：随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。 在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。 在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器 ，或反应过于激烈而失去控制。 易燃易爆气体大量逸入室内。 高压气瓶减压伐摔坏或失灵。 表1-2 易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限 名 称 爆炸极限（体积百分数） 名 称 爆炸极限（体积百分数） 乙醚 1.936.5 丙酮 2.613 甲醇 6.736.5 乙醇 3.319 氢气 4.174.2 乙炔 3.082 1.3.3 中毒 生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴乙锭等。 剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈 、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。 中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。 中毒的预防： 保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行。 取用毒品时必须配戴橡皮手套。 严禁用咀吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋。 不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。 中毒急救的方法主要有：误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服Mg(OH)2乳剂，最后饮些牛奶。吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法。 砷和汞中毒者应立即送医院急救。1.3.4 外伤 化学灼伤： 眼睛灼伤或掉进异物：眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗十五分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。若有玻璃碎片进入眼内则十分危险，必须十分小心谨慎，不可自取，不可转动眼球，可任其流泪，若碎片不出，则用纱布轻轻包住眼睛急送医院处理。若有木屑、尘粒等异物进入，可由他人翻开眼睑，用消毒棉签轻轻取出或任其流泪，待异物排出后再滴几滴鱼肝油。 皮肤灼伤： (a)酸灼伤：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。 (b)碱灼伤：先用大量水冲洗，再用硼酸或醋酸浸洗，最后再用水洗。 (c)溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用20硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。 烫伤：使用火焰、蒸汽、红热的玻璃和金属时易发生烫伤，应立即用大量水冲洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上纱布后就医，轻度烫伤可涂抹鱼肝油和烫伤膏等。 割伤： 这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意预防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，且不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，就医时务必检查伤部神经是否被切断。 实验室应准备一个完备的小药箱，专供急救时使用。药箱内备有：医用酒精、红药水、紫药水、止血粉、创口贴、烫伤油膏（或万花油）、鱼肝油、1硼酸溶液或2醋酸溶液、1碳酸氢钠溶液、20硫代硫酸钠溶液、医用镊子和剪刀、纱布、药棉、棉签、绷带等。1.3.5 触电： 生物化学实验室要使用大量的仪器、烘箱和电炉等，因此每位实验人员都必须能熟练地安全用电，避免发生一切用电事故，当50HZ的电流通过人体25mA电流时呼吸会发生困难，通过了100mA以上电流时则会致死。 防止触电：不能用湿手接触电器。电源裸露部分都应绝缘。坏的接头、插头、插座和不良导线应及时更换。先接好线路再插接电源，反之先关电源再拆线路。仪器使用前要先检查外壳是否带电。如遇有人触电要先切断电源再救人。 防止电器着火：保险丝、电源线的截面积、插头和插座都要与使用的额定电流相匹配。三条相线要平均用电。生锈的电器、接触不良的导线接头要及时处理。电炉、烘箱等电热设备不可过夜使用。仪器长时间不用要拔下插头，并及时拉闸。电器、电线着火不可用泡沫灭火器灭火。 1.4 实验记录与实验报告1.4.1 实验记录 详细、准确、如实地作好实验记录是极为重要的，记录如果有误，会使整个实验失败，这也是培养学生实验能力和严谨的科学作风的一个重要方面。 每位同学必须准备一个实验记录本，实验前认真预习实验，看懂实验原理和操作方法，在记录本上写好实验预习报告， 包括详细的实验操作步骤(可以用流程图表示)和数据记录表格等。 记录本上要编好页数，不得撕缺和涂改，写错时可以划去重写。不得用铅笔记录，只能用钢笔和园珠笔。记录本的左页作计算和草稿用，右页用作预习报告和实验记录。同组的两位同学合做同一实验时，两人必须都有相同、完整的记录。 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据，条理清楚，字迹端正，切不可潦草以致日后无法辨认。实验记录必须公正客观，不可夹杂主观因素。 实验中要记录的各种数据，都应事先在记录本上设计好各种记录格式和表格，以免实验中由于忙乱而遗漏测量和记录，造成不可挽回的损失。 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其重量等；试剂的规格、化学式、分子量、试剂的浓度等，都应记录清楚。二人一组的实验，必须每人都作记录。1.4.2 实验报告 实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对有关生物化学与分子生物学原理和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。实验报告的格式应为： 实验目的； 实验原理； 仪器和试剂； 实验步骤； 数据处理； 结果讨论。 每个实验报告都要按照上述要求来写，实验报告的写作水平也是衡量学生实验成绩的一个重要方面。实验报告必须独立完成，严禁抄袭。写实验报告要用实验报告专用纸，以便教师批阅，不要用练习本和其他片页纸。 为了使实验结果能够重复，必须详细记录实验现象的所有细节，例如，若实验中生成沉淀，那麽沉淀的真实颜色是什麽，是白色、淡黄色或是其他？沉淀的量是多还是少，是胶状还是颗粒状？什麽时候形成沉淀，立即生成还是缓慢生成，热时生成还是冷却时生成？在科学研究中，仔细地观察，特别注意那些未预先想到的实验现象是十分重要的，这些观察常常引起意外的发现，报告并注意分析实验中的真实发现，对学生将是非常重要的科学研究训练。 实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键，各种实验数据都要尽可能整理成表格并作图表示之，以便比较，一目了然。实验作图尤其要严格要求，必须使用坐标纸，每个图都要有明显的标题，坐标轴的名称要清楚完整，要注明合适的单位，坐标轴的分度数字要与有效数字相符，并尽可能简明，若数字太大，可以化简，并在坐标轴的单位上乘以10的方次。实验点要使用专门设计的符号，如：、等，符号的大小要与实验数据的误差相符。不要用“、”和“”小园点。有时也可用两端有小横线的垂直线段来表示实验点，其线段的长度与实验误差相符。通常横轴是自变量，往往知道的很准确，纵轴是应变量，是测量的数据。曲线要用曲线板或曲线尺画成光滑连续的曲线，各实验点均匀分布在曲线上和曲线两边，且曲线不可超越最后一个实验点。两条以上的曲线和符号应有说明。 实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。目录第一部分生物化学实验9实验一 氨基酸纸层析9实验二 蛋白质浓度测定（凯氏定氮法）12实验三 福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度16实验四 酵母RNA的提取及组分鉴定18实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质20实验六 酶促反应的影响因素22试验七 碱法提取质粒DNA25实验八 Vc含量测定-2,6-二氯酚靛酚滴定法29实验九 过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定32分子生物学实验部分35实验一 哺乳动物基因组DNA提取35实验二 PCR基因扩增38实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA40实验四、感受态细胞的制备43实验五 基因重组45主 要 参 考 文 献48第一部分生物化学实验实验一 氨基酸纸层析一、实验目的 通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。二、实验原理层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。图1 氨基酸纸层析示意图层析的种类：根据原理分为：a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d离子交换层析 根据支持物分为： a纸层析 b柱层析 c薄层层析d凝胶过滤层析分配层析的原理：各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数，称为分配系数（KD）。KD= 物质在流动相里的浓度 物质在固定相里的浓度纸层析:分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf）值或迁移率表示：Rf = 色斑中心至上样原点中心的距离 溶剂前缘至上样原点中心的距离载体：滤纸固定相：滤纸吸附的水流动相：水饱和苯酚（或丁醇）极性：谷氨酸丙氨酸脯氨酸对于水饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。三、实验材料 仪器 层析缸； 层析滤纸； 电吹风机； 喷雾器； 毛细管。 试剂 氨基酸标准液（6mg/mL）； 氨基酸混合液（6mg/mL) 展层剂：水饱和苯酚（或丁醇）溶液。 显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液四、操作步骤1、层析滤纸的准备 用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。2、点样(少量多次) 用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.3cm，干燥后再点样，重复3次。3、展层将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。4、显色滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干后放在80烘箱中显色。图2 氨基酸纸层析操作图五、结果与分析用铅笔描出色斑轮廓，找出中心点。如果斑点形状不规则或出现明显的“拖尾”，则圈出 颜色集中均匀的部分。 计算各色斑的Rf值,对照标准样品，确定混合样品中氨基酸六、思考题： 1、Rf值的概念、如何计算Rf值以及影响该值的各种因素。 2、纸层析分离氨基酸的原理 3、分析造成色斑拖尾现象的原因。七、操作注意事项 1、点样量要适当，点样要均匀； 2、尽可能不要用手去触摸滤纸有效面； 3、层析时间根据层析系统的具体情况而定，使分配系数相近的氨基酸分开； 4、喷茚三酮时要均匀、适量，不可过多。实验二 蛋白质浓度测定（凯氏定氮法）一、实验目的： 1、学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术； 2、学会使用凯氏定氮仪。二、 实验原理：生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16，测出含氮量则可推知蛋白含量。消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。甘氨酸的消化过程可表示如下：CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH32NH3+H2SO4 (NH4)2SO4浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。本法适用于0.2 2.0 mg的氮量测定。三、实验试剂： 1、浓硫酸 200mL 2、粉末硫酸钾硫酸铜混合物 16g K2S04与CuS045H20以 3：1配比研磨混合 3、30氢氧化钠溶液 1 000 mL 4、2硼酸溶液 5 000 mL 5、标准盐酸溶液 (约001 molL) 6、混合指示剂(田氏指示剂) 由50mL01甲烯蓝乙醇溶液与200mL01甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 7、市售标准面粉和富强粉 各2g四、 器材：凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、50ml容量瓶、3ml微量滴定管、分析天平、烘箱、电炉、100ml蒸馏烧瓶、小玻璃珠五、操作方法1、样品处理 原因: 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示()。方法:一般样品烘干的温度都采用105，因为非游离的水都不能在100以下烘干。在称量瓶中称一定量磨细的样品(如0.1 g左右的干燥面粉)，然后置于105的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。2、消化取4个100mL凯氏烧瓶 标号。各加l颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04CuS04?5H2O)200 mg，消化液（浓硫酸）5 mL。在3及4号瓶中各加0.1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放漏斗，在通风橱内的电炉上消化。(注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。)当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。 定容：冷却后，加蒸馏水约10 mL。(注意慢加，随加随摇)。然后将瓶中溶物倾人50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。 图1 改良型凯氏定氮仪蒸馏器的洗涤（1）.接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(先关闭进水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜),用酒精灯将其加热烧开。（2）.水的自动喷出：将蒸馏水由加样室加入反应室，将酒精灯移开片刻，打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，如此反复清洗3-5次。（3）.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。3、蒸馏过程：准备: 50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2硼酸溶液和12滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。加样:用移液管取5 mL消化液，细心地加入反应室，随后加入30NaOH溶液5mL，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。蒸馏:关闭自由夹,打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约23分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。 如此35次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。4、滴定全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。 5、计算总氮量=C(V1-V2)0.014/w 消化液量(ml) / 滴定消耗用液量(ml)c为标准盐酸溶液摩尔浓度； V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数； w为样品重量(g)；若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，样品中蛋白质含量()二总氮量625六、思考题1、何谓消化？如何判断消化终点？2、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？3、固体样品为什么要烘干？4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？5、如何证明蒸馏器洗涤干净？6、本实验应如何避免误差？实验三 福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度一、实验目的 学习利用呈色反应原理测定蛋白质浓度。二、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定三、实验材料1.牛清蛋白片；2.722分光光度计；3.试管8 ；4.移液管0.50ml4、0.10ml2、0.20ml2、5.0ml1. 试剂1.Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml 0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO45H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。临用时按甲：乙=50：1混合使用。（一日内有效）2.Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15min，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，