15蛋白质组学二剖析.pptx

第十五讲第十五讲 蛋白质组学（二）蛋白质组学（二）第一节第一节 概概 述述第二节第二节 蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术一、二维凝胶电泳技术一、二维凝胶电泳技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术三、酵母双杂交体系三、酵母双杂交体系三、酵母双杂交体系三、酵母双杂交体系四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术第三节第三节第三节第三节 蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势第二节第二节 蛋白质组学研究技术蛋白质组学研究技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术二、质谱技术1 1、概述：概述：质谱技术质谱技术按照离子的核质比（按照离子的核质比（m/zm/z）对离子进行分离并鉴定的方法）对离子进行分离并鉴定的方法。质谱技术诞生于质谱技术诞生于2020世纪初，一直应用于世纪初，一直应用于有机小分子有机小分子领域领域直到直到2020世纪世纪8080年代年代才渐渐进入到才渐渐进入到生物大分子生物大分子领域。领域。质谱技术在蛋白质组研究中的作用质谱技术在蛋白质组研究中的作用在蛋白质组学研究中，在蛋白质组学研究中，蛋白质鉴定蛋白质鉴定是是最关键最关键的一环。的一环。质谱技术是质谱技术是蛋白质鉴定的蛋白质鉴定的主流技术，主流技术，蛋白质组研究的蛋白质组研究的主要支撑主要支撑技术技术。对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定确定蛋白质或多肽的蛋白质或多肽的分子质量分子质量。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质研究。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质研究。2 2、质谱仪的工作原理、质谱仪的工作原理基本原理基本原理分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分离，根据不同离子质荷比分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分离，根据不同离子质荷比(m/z)(m/z)的差异，对离子进行分的差异，对离子进行分离并确定分子质量。离并确定分子质量。质谱仪组成：质谱仪组成：进样装置、进样装置、离子化源离子化源、质量分析器质量分析器、离子检测器和数据分析等离子检测器和数据分析等离子化源离子化源和和质量分析器质量分析器是两个核心部件是两个核心部件质谱仪分类：根据两个质谱仪分类：根据两个中心部件中心部件可以分为可以分为电啧雾电啧雾(ESI)(ESI)快原子轰击质谱快原子轰击质谱(FAB)(FAB)飞机时间质谱飞机时间质谱 四极杆质谱四极杆质谱工作原理工作原理不同不同离子源离子源和和质量分析器质量分析器相匹配相匹配基本确定了质谱仪的工作原理和方式。基本确定了质谱仪的工作原理和方式。如：如：ESIESI离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配如：基质辅助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，（如：基质辅助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，（MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）。）。质量分析器质量分析器离子化源离子化源2 2、常用生物质谱的类型和特点、常用生物质谱的类型和特点（1 1）电喷雾质谱仪（）电喷雾质谱仪（ESI-MSESI-MS）l电喷雾离子化电喷雾离子化(elcctrospray ionization ESI)(elcctrospray ionization ESI)：一种一种“软电离软电离”方式方式将样品溶解，以将样品溶解，以液相方式液相方式通过毛细管到达通过毛细管到达喷口喷口，在，在喷口高电压喷口高电压作用下形作用下形成成带电荷的微滴带电荷的微滴，微滴溶剂蒸发，微滴，微滴溶剂蒸发，微滴表面的电荷密度表面的电荷密度随随半径减小半径减小而而增增加加，到达某一临界点时，样品将，到达某一临界点时，样品将以离子方式以离子方式从从液滴表面蒸发液滴表面蒸发，进入气相，进入气相，实现实现样品的离子化。样品的离子化。ESI过程图解过程图解（引自理查德（引自理查德J.辛普森辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南蛋白质与蛋白质组学实验指南,2006）ESI 离子化过程离子化过程l特点：特点：ESI-MS ESI-MS 是一种典型的是一种典型的“软离子软离子”方式方式没有直接的外界能量作用于分子，分子结构破坏较少。没有直接的外界能量作用于分子，分子结构破坏较少。可以监测可以监测大分子质量大分子质量的的分子分子l电喷雾质谱可形成电喷雾质谱可形成多电荷多电荷离子，离子，l在在较小的较小的m/zm/z范围范围内可以监测到大分子质量的分子。内可以监测到大分子质量的分子。测定分子质量范围测定分子质量范围l可测定分子质量可测定分子质量1010,0100 Da,0100 Da以下的蛋白以下的蛋白l最高达最高达1515,01OO Da,01OO Da马心肌红蛋白马心肌红蛋白(分子质量分子质量16951.5 Da)的的假想假想ESI质量图谱质量图谱 （引自理查德（引自理查德J.辛普森辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南蛋白质与蛋白质组学实验指南,2006）带不同电荷蛋白质的带不同电荷蛋白质的（理想）（理想）质谱图。质谱图。l常见的以电喷雾为离子化方式的常见的以电喷雾为离子化方式的质谱仪质谱仪：电喷雾电喷雾-三级四极杆质谱三级四极杆质谱(ESI-Q-MS)(ESI-Q-MS)电喷雾电喷雾-三级四极杆飞行时间质谱三级四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)(ESI-Q-TOF-MS)电喷雾电喷雾-傅里叶回旋傅里叶回旋共振质谱共振质谱(ESI-FTUCR-MS)(ESI-FTUCR-MS)液相色谱液相色谱-电喷雾质谱电喷雾质谱(LC-MS)(LC-MS)u液质联用液质联用(LC-MS)(LC-MS)：电喷雾质谱采用电喷雾质谱采用液相方式液相方式进样，可与液相色谱联用。进样，可与液相色谱联用。蛋白质或多肽经蛋白质或多肽经HPLCHPLC分离，直接进入质谱仪进行分子质量测定。分离，直接进入质谱仪进行分子质量测定。T11：lycopene LC-ESI-MS测定类胡萝卜素测定类胡萝卜素l四级杆分析器四级杆分析器结构结构l四级场（见下图）四级场（见下图）原理：原理：l在一定的在一定的VdcVdc和和VrfVrf下，只有下，只有一定质量一定质量的的离子离子通过四级场，到达检测器通过四级场，到达检测器l在一定在一定VdcVdc和和VrfVrf下，改变下，改变VrfVrf可实现扫描可实现扫描特点：扫描速度快，灵敏度高特点：扫描速度快，灵敏度高u四根棒状电极，形成四级场四根棒状电极，形成四级场u1、3棒棒+(Vdc+Vrf)u2、4棒棒(Vdc+Vrf)l 时间飞行质谱分析时间飞行质谱分析（Time of Flight Analyze）特点特点仪器仪器结构简单结构简单，不需要不需要磁场、电场磁场、电场等；等；扫描扫描速度快速度快，可在，可在10-5s内观察到内观察到整段图谱整段图谱；无聚焦狭缝无聚焦狭缝，灵敏度很高；，灵敏度很高；可用于可用于大分子的分析大分子的分析（几十万原子量单位），（几十万原子量单位），在生命科学中用途很广；在生命科学中用途很广；(2)(2)基质辅助激光解吸离子化质谱基质辅助激光解吸离子化质谱lMALDI MALDI（matrix-assisted laser desorption ionizationmatrix-assisted laser desorption ionization）将样品将样品包埋包埋在固体基质中，基质吸收在固体基质中，基质吸收激光激光提供的能量而蒸发，提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，携带部分样品分子进入气相，将一部分能量传递给样品分子使其将一部分能量传递给样品分子使其离子化离子化。l激光解吸激光解吸基质基质的重要性的重要性早期早期激光解吸离子化激光解吸离子化没有基质辅助没有基质辅助，激光能量直接作用于被分析，激光能量直接作用于被分析物，使分子碎裂，产生物，使分子碎裂，产生大量碎片大量碎片，而，而不易得到分子离子不易得到分子离子。1988年，年，Tanaka等采用等采用可吸收激光的基质可吸收激光的基质（如甘油）（如甘油）包埋被分析包埋被分析物物，避免激光避免激光对分子结构的破坏，测定蛋白分子质量为对分子结构的破坏，测定蛋白分子质量为35kDa进一步采用进一步采用固体基质使样品固体基质使样品分散得更均匀，分散得更均匀，离子化效果离子化效果更好更好。通常采用的通常采用的激光束激光束波长为波长为337nm，样品的，样品的电离过程电离过程是由是由基质介导的基质介导的，基质对分析的灵敏度、分辨率和精确度有很大影响。基质对分析的灵敏度、分辨率和精确度有很大影响。常用的基质常用的基质有有（对于蛋白质和多肽样品）对于蛋白质和多肽样品）芥子酸芥子酸(SA)、d-氰基氰基-4羟肉桂酸（羟肉桂酸（CHCA）、）、2,5-二羟基苯甲酸（二羟基苯甲酸（DHB）等。）等。lMALDIMALDI主要特点主要特点离子电荷数离子电荷数通常为通常为1 12 2，不形成不形成复杂的多电荷图，对图谱解析比较清楚、简单。复杂的多电荷图，对图谱解析比较清楚、简单。如：如：乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶的的胰蛋白酶胰蛋白酶酶切肽图酶切肽图。固相进样方式固相进样方式，不受溶液性质的影响，对不受溶液性质的影响，对杂质的忍耐性杂质的忍耐性较好较好。生物样品制备时生物样品制备时在样品中引入去垢剂在样品中引入去垢剂效果更好。效果更好。(如尿素和如尿素和SDS)SDS)等等乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图乙醇脱氢酶的胰蛋白酶酶切肽图l常见质谱仪：常见质谱仪：基质辅助激光解吸离子化基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱飞行时间质谱MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MSMALDI-TOF/TOFMSMALDI-TOF/TOFMS基质辅助激光解吸离子化基质辅助激光解吸离子化三级四极三级四极飞行时间质谱飞行时间质谱MALDI-Q-TOF-MSMALDI-Q-TOF-MS3 3、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴定技术、肽质量指纹图谱与蛋白质鉴定技术肽质量指纹图谱肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting(peptide mass fingerprinting，PMF)PMF)蛋白质被酶切位点蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。水解后得到的肽片段质量图谱。l每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）都不同，l蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不相同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列各不相同，l肽混合物质量数亦具其肽混合物质量数亦具其特征性特征性，l经质谱分析得到是图谱称为经质谱分析得到是图谱称为指纹图谱指纹图谱，应用：应用：蛋白质鉴定蛋白质鉴定在蛋白质数据库中，寻找具有相似肽指纹图谱的蛋白质。在蛋白质数据库中，寻找具有相似肽指纹图谱的蛋白质。酶切蛋白质，质谱分析得到酶切蛋白质，质谱分析得到PMFPMF，检索数据库进行鉴定。，检索数据库进行鉴定。PMFPMF鉴定蛋白质基本路线鉴定蛋白质基本路线l蛋白质的肽谱的特点蛋白质的肽谱的特点肽谱测定仪器肽谱测定仪器：最有效的质谱仪：最有效的质谱仪：MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS灵敏度高，谱灵敏度高，谱峰简单峰简单，每个，每个谱峰代表一种肽段谱峰代表一种肽段。肽谱鉴定特点肽谱鉴定特点：若蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸若蛋白质翻译后修饰，或电泳过程中某些氨基酸被修饰被修饰（如半胱氨酸（如半胱氨酸烷基化烷基化、甲硫氨酸甲硫氨酸氧化氧化），），蛋白质蛋白质PMFPMF就会有一些质量数就会有一些质量数与理论值不符与理论值不符，PMFPMF鉴定的鉴定的不需要不需要将将全部肽质量数全部肽质量数都与都与理论值理论值相符。相符。PMFPMF方法可同时处理许多样品，是方法可同时处理许多样品，是大规模鉴定大规模鉴定的首选方法。的首选方法。举例举例：PMFPMF鉴定双向电泳分离蛋白质的实例，如下图（鉴定双向电泳分离蛋白质的实例，如下图（NextNext）：）：来源于人来源于人白血病细胞白血病细胞的蛋白质，的蛋白质，胰蛋白酶胰蛋白酶酶切，得到酶切，得到PMFPMF，经数据库检索鉴，经数据库检索鉴定为人定为人丙酮酸激酶丙酮酸激酶。图中标有图中标有“*”“*”峰：能与峰：能与数据库数据库中肽质量数中肽质量数理论值理论值相符的相符的。蛋白质的蛋白质的PMFPMF2D2D凝胶上蛋白点的凝胶上蛋白点的PMFPMF丙酮酸激酶丙酮酸激酶“*”与与数据库数据库相符相符人白血病细胞人白血病细胞 4 4、串联质谱技术、串联质谱技术l概念：概念：指用质谱作指用质谱作质量分离质量分离的质谱分析方法的质谱分析方法。也称质谱。也称质谱-质谱法，多级质谱法，二维质质谱法，多级质谱法，二维质谱法和序贯质谱法。谱法和序贯质谱法。如：磁分析器如：磁分析器-静电分析器静电分析器-磁分析器的串联磁分析器的串联 l特点：自动化程度、敏感性，高通量分析特点：自动化程度、敏感性，高通量分析l如：二维色谱如：二维色谱串联质谱串联质谱(2D-HPLC/MS)优点：可优点：可大规模分离鉴定蛋白质大规模分离鉴定蛋白质，在鉴定，在鉴定膜蛋白、低丰度膜蛋白、低丰度的蛋白质及大分子蛋白的蛋白质及大分子蛋白质等方面显示出质等方面显示出独特的优势，独特的优势，缺点：串联质谱技术得到的缺点：串联质谱技术得到的肽序列图谱肽序列图谱相对相对复杂复杂，从图谱进行，从图谱进行完整的序列完整的序列分析分析难难度度较大。较大。l如：如：肽序列标签肽序列标签技术技术(peptide sequence tag，PST)肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的肽序列标签就是指分子量小，不影响介导蛋白活性的已知序列的多肽标签已知序列的多肽标签。已知氨基酸序列已知氨基酸序列亲和标签亲和标签+离子质量（离子质量（2H）+蛋白质结合部位三者构成蛋白质结合部位三者构成PSTPST和蛋白质结合，酶切，亲和分离，和蛋白质结合，酶切，亲和分离，质谱分析质谱分析，数据库检索鉴定蛋白质的方法。，数据库检索鉴定蛋白质的方法。解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。解决了肽谱分析的难题，灵敏度提高。三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术三、酵母双杂交技术1、概念：、概念：l依据生物体依据生物体转录激活转录激活过程，在酵母细胞内建立的研究蛋白质与蛋过程，在酵母细胞内建立的研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的白质之间相互作用的有效体系和方法有效体系和方法。l1989年，年，Fields等正式建立了酵母双杂交等正式建立了酵母双杂交(veast two-hybrid)体系，体系，又称为又称为“相互作用陷阱相互作用陷阱”。2、酵母双杂交的原理：、酵母双杂交的原理：依据生物体转录激活过程建立的，先理解依据生物体转录激活过程建立的，先理解u转录激活因子的激活过程转录激活因子的激活过程l转录激活因子的结构特点转录激活因子的结构特点真核生物的真核生物的位点特异性位点特异性转录激活因子转录激活因子具有两个独立的结构域具有两个独立的结构域两个独立的结构域，各具功能，互不影响两个独立的结构域，各具功能，互不影响DNA结合结构域结合结构域(DNA bindingdomain，BD)转录激活结构域转录激活结构域(transcriptional activation domain，AD)激活因子激活因子必须必须同时含有同时含有这两个结构域，否则无激活功能这两个结构域，否则无激活功能l激活因子对基因表达的激活激活因子对基因表达的激活不同来源不同来源激活因子激活因子的的BD区和区和AD区区结合结合后后AD和和BD两种结构域的上游活化序列相互接近两种结构域的上游活化序列相互接近特异性地激活特异性地激活BD结合的基因结合的基因，激活转录过程，基因表达，激活转录过程，基因表达u依据这一原理，建立了酵母双杂交体系依据这一原理，建立了酵母双杂交体系转录激活因子的结构和转录的激活转录激活因子的结构和转录的激活2、酵母双杂交的原理：、酵母双杂交的原理：研究研究“X蛋白蛋白”和和“Y蛋白蛋白”是否发生相互作用？是否发生相互作用？l将蛋白质将蛋白质X的基因与特异的的基因与特异的BD基因融合，成为基因融合，成为“诱饵诱饵”蛋白蛋白l蛋白质蛋白质Y基因与特异的基因与特异的AD基因融合为基因融合为“猎物猎物”蛋白蛋白l编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时编码两种结构域的基因在细胞核内同时表达时l若蛋白质若蛋白质X和和Y之间存在相互作用，之间存在相互作用，报道基因报道基因表达。表达。l若蛋白质若蛋白质X和和Y之间不存在相互作用，之间不存在相互作用，报道基因报道基因不表达。不表达。酵母双杂交系统原理示意图酵母双杂交系统原理示意图3、酵母双杂交系统的组成和特点酵母双杂交系统的组成和特点（1）三个部分组成）三个部分组成BD融合融合的蛋白表达载体的蛋白表达载体，表达的蛋白称，表达的蛋白称诱饵蛋白诱饵蛋白AD融合融合的蛋白表达载体的蛋白表达载体，表达的蛋白称，表达的蛋白称靶蛋白靶蛋白有一个或多个报告基因的宿主菌株有一个或多个报告基因的宿主菌株常见报道基因常见报道基因E.coli LacZ基因，蓝白菌落筛选基因，蓝白菌落筛选营养缺陷型筛选营养缺陷型筛选发光蛋白的基因（发光蛋白的基因（GFP）操作程序：操作程序：克隆诱饵蛋白基因克隆诱饵蛋白基因克隆靶蛋白基因克隆靶蛋白基因构建构建BDBD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称诱饵蛋白构建构建ADAD融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白融合的蛋白表达载体，以表达的蛋白称靶蛋白载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞载体导入含有一个或多个报告基因的宿主细胞细胞培养，观察报告基因的表达情况细胞培养，观察报告基因的表达情况判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用情况判定诱饵蛋白与靶蛋白的作用情况（2）为何构建酵母双杂交系统）为何构建酵母双杂交系统酵母细胞便于转化，结果酵母细胞便于转化，结果易于筛选易于筛选；选择性好选择性好。内源性酵母蛋白质极少与内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞哺乳细胞靶蛋白结合，靶蛋白结合，避免了对文库编码蛋白质的干扰。避免了对文库编码蛋白质的干扰。（3）酵母双杂交系统的发展）酵母双杂交系统的发展反向双杂交体系：反向双杂交体系：用于用于鉴定影响鉴定影响蛋白质间相互作用的化合物，蛋白质间相互作用的化合物，在药物研究开发方面具有十分重要的应用价值。在药物研究开发方面具有十分重要的应用价值。三杂交体系：三杂交体系：对双杂交体系的一个有益补充，对双杂交体系的一个有益补充，用于研究用于研究多种蛋白质多种蛋白质之间的相互作用。之间的相互作用。（4）双杂交系统的优势？）双杂交系统的优势？l融合体蛋白质之间的相互作用融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞在真核酵母细胞内进行。内进行。蛋白质能蛋白质能保持天然保持天然的的折叠状态折叠状态，类似人体的类似人体的生理状态。生理状态。证实蛋白质间的相互作用证实蛋白质间的相互作用更接近于更接近于体内的体内的真实水平真实水平。正是其他正是其他体外生化检验体外生化检验方法所缺乏的。方法所缺乏的。l筛选筛选cDNA文库中编码的文库中编码的，与与已知蛋白质特异作用的，已知蛋白质特异作用的，成分成分。揭示许多揭示许多已知蛋白质已知蛋白质之间的之间的未知作用未知作用。有助于有助于发现（许多）发现（许多）新基因新基因。l双杂交系统检测到的相互作用在双杂交系统检测到的相互作用在体内发生体内发生，不需要不需要纯化蛋白。纯化蛋白。l能检测到短暂的相互作用，广泛应用于能检测到短暂的相互作用，广泛应用于信号通路信号通路的研究。的研究。（5）酵母双杂交系统的局限性）酵母双杂交系统的局限性只研究只研究在在核内表达核内表达的蛋白质的相互作用的蛋白质的相互作用融合蛋白融合蛋白的的构建构建可能可能影响影响蛋白质本身的蛋白质本身的活性或折叠状态活性或折叠状态；如果特定的如果特定的翻译后修饰翻译后修饰在酵母细胞中在酵母细胞中不发生不发生，则，则不能检测不能检测到到修修饰后饰后蛋白质的相互作用；蛋白质的相互作用；许多许多蛋白质蛋白质与与BD融合融合，具有自激活效应具有自激活效应，导致导致假阳性结果。假阳性结果。四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术四、蛋白质芯片技术1、概念、概念l蛋白质芯片蛋白质芯片（protein chip）：又叫蛋白质：又叫蛋白质微阵列微阵列（protein microarray）是检测蛋白质之间是检测蛋白质之间相互作用相互作用的生物芯片。的生物芯片。将大量纯化的蛋白质有规则的固定到某种介质载体上，将大量纯化的蛋白质有规则的固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互作利用蛋白质与蛋白质，酶与底物，蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。用检测分析蛋白质的一种芯片。l蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术依据蛋白质之间的依据蛋白质之间的相互作用相互作用的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的原理，利用蛋白质芯片，对样品中存在的特定蛋白质分子进行的特定蛋白质分子进行高通量分析高通量分析检测的方法。检测的方法。是在蛋白质水平上，了解和研究，各种生命现象本质的重要方法。是在蛋白质水平上，了解和研究，各种生命现象本质的重要方法。蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图蛋白质芯片检测示意图2、基本原理、基本原理将各种将各种蛋白质（探针）蛋白质（探针）有序地有序地固定固定于载体上，于载体上，制备蛋白芯片制备蛋白芯片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。利用蛋白与分子之间利用蛋白与分子之间相互作用相互作用的原理，用标记了特定荧光抗体的的原理，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分（蛋白质或其他成分（报告分子报告分子）与芯片作用，经漂洗将未能与芯）与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去。片上的蛋白质互补结合的成分洗去。利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质功能。用的关系，测定各种蛋白质功能。4、分类：根据用途的不同，可分为、分类：根据用途的不同，可分为l蛋白功能芯片：蛋白功能芯片：（用于研究）（用于研究）将天然将天然蛋白、酶或酶底物蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片固定在载体上制成芯片用于用于天然蛋白质活性天然蛋白质活性及及分子亲和性分子亲和性的的高通量高通量分析分析可用来进行蛋白可用来进行蛋白-蛋白、蛋白蛋白、蛋白-多肽、蛋白多肽、蛋白-小分子、蛋白小分子、蛋白-DNA-RNA结合以结合以及蛋白及蛋白-酶反应等研究。酶反应等研究。l蛋白检测芯片：蛋白检测芯片：（用于检验）（用于检验）将具有将具有高度亲和性高度亲和性的蛋白质或多肽（如单抗，小片段抗体，受体等）固定的蛋白质或多肽（如单抗，小片段抗体，受体等）固定在载体上，制备检测芯片。在载体上，制备检测芯片。用以用以识别复杂生物样品识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。中的抗原、目标多肽和蛋白等。5、操作关键环节、操作关键环节l蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备l报告分子（探针）的标记报告分子（探针）的标记l信号的检测及数据处理信号的检测及数据处理仪器和软件仪器和软件l蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备固相载体固相载体的选择和处理（膜载体和玻璃载体）；的选择和处理（膜载体和玻璃载体）；蛋白质靶标蛋白质靶标的处理；的处理；将蛋白质靶标点在固相载体上，并将其将蛋白质靶标点在固相载体上，并将其固定固定；蛋白质芯片的蛋白质芯片的封闭封闭。l报告分子（探针）的标记报告分子（探针）的标记荧光染料荧光染料酶酶融合表达融合表达红色荧光蛋白（红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（）和绿色荧光蛋白（GFP）与检测蛋白形成融合蛋白共表达与检测蛋白形成融合蛋白共表达l信号的检测及数据处理信号的检测及数据处理荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件（荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件（CCD）检测）检测酶标芯片：显色后用高精度的酶标芯片：显色后用高精度的CCD检测检测应用计算机软件对检测结果进行数据分析，得出结论。应用计算机软件对检测结果进行数据分析，得出结论。6、蛋白质芯片的特点、蛋白质芯片的特点l高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好大量蛋白质的快速、定性、定量大量蛋白质的快速、定性、定量（？）（？）分析分析使用简单，结果正确率较高使用简单，结果正确率较高只需少量标本只需少量标本采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强l其其不足不足在于：稳定性，操作复杂在于：稳定性，操作复杂7、蛋白质芯片的应用、蛋白质芯片的应用l基础研究基础研究蛋白质蛋白质DNA相互作用研究相互作用研究蛋白质蛋白质mRNA相互作用研究相互作用研究l临床：疾病诊断与疗效判定临床：疾病诊断与疗效判定需要的时间短、样品量少，需要的时间短、样品量少，给出大量的诊断和预后信息。给出大量的诊断和预后信息。l新药筛选与研制新药筛选与研制寻找药物的靶标，检查药物的毒副作用，寻找药物的靶标，检查药物的毒副作用，高通量筛选，缩短药物筛选时间高通量筛选，缩短药物筛选时间l环境监测及食品检测环境监测及食品检测诊断举例：诊断举例：l国内临床上应用较多的蛋白质芯片国内临床上应用较多的蛋白质芯片l（C-12）多种肿瘤标志物蛋白质芯）多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统片检测系统l主要是检测患者血清中的主要是检测患者血清中的肿瘤标志肿瘤标志物物含量及变化情况，含量及变化情况，l作为判断常见肿瘤的作为判断常见肿瘤的发生、发展、发生、发展、治疗效果治疗效果及其及其预后预后的监测指标。的监测指标。C-12多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤原理原理操作操作分析分析靶分子靶分子识别分子识别分子报告分子报告分子第三节第三节 蛋白质组学的应用和发展趋势蛋白质组学的应用和发展趋势l概述概述已应用到生命科学已应用到生命科学各个领域各个领域如：细胞生物学、神经生物学、临床蛋白质组学、药理蛋白质组学、毒理蛋如：细胞生物学、神经生物学、临床蛋白质组学、药理蛋白质组学、毒理蛋白质组学等。白质组学等。研究对象研究对象覆盖生物范围：原核微生物、真核微生物、植物和动物等覆盖生物范围：原核微生物、真核微生物、植物和动物等涉及各种重要的生物学现象：如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。涉及各种重要的生物学现象：如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。在临床上在临床上心脑血管病、肿瘤的心脑血管病、肿瘤的发生（机制）与发展发生（机制）与发展。毒理学、毒理学、细胞分化细胞分化与与胚胎发育等胚胎发育等基因基因调控调控机制。机制。重大疾病的发生与治疗、个体化诊断、肝脏疾病、早老性痴呆药学研究。重大疾病的发生与治疗、个体化诊断、肝脏疾病、早老性痴呆药学研究。环境与健康关系方面的研究等。全面分析地方病发病机理环境与健康关系方面的研究等。全面分析地方病发病机理了解了解了解了解 一、蛋白质组学与微生物一、蛋白质组学与微生物l总体概述：总体概述：为为适应适应基因组学和蛋白质组学的基因组学和蛋白质组学的发展发展，微生物蛋白质组学，微生物蛋白质组学应运而生应运而生。l微生物蛋白质组学研究集中在两个方面：微生物蛋白质组学研究集中在两个方面：各类模式微生物各类模式微生物，特别是，特别是典型的模式微生物典型的模式微生物（大肠杆菌和酵母菌）蛋白（大肠杆菌和酵母菌）蛋白质组学的研究，几乎涉及了质组学的研究，几乎涉及了蛋白质组学现有领域蛋白质组学现有领域的方方面面。的方方面面。尤其是物质代谢、能量代谢和信号途径分析等尤其是物质代谢、能量代谢和信号途径分析等病原微生物方面病原微生物方面：蛋白质组学研究，对于了解其：蛋白质组学研究，对于了解其毒性因子毒性因子、抗原抗原及及疫苗疫苗的制备非常重要。主要集中在以下几个层面：的制备非常重要。主要集中在以下几个层面：病原微生物，特别是病原微生物，特别是模式微生物模式微生物在在不同生长条件不同生长条件下的下的蛋白表达谱蛋白表达谱的研究；的研究；同一种病原微生物同一种病原微生物的的不同菌株不同菌株之间的之间的蛋白质组蛋白质组的的比较比较；同一种病原微生物同一种病原微生物的的不同生理状态不同生理状态的蛋白质组学研究；的蛋白质组学研究；病原微生物的病原微生物的“亚蛋白质组亚蛋白质组”分析；分析；宿主和微生物的相互关系宿主和微生物的相互关系，寻找新型疫苗的靶分子寻找新型疫苗的靶分子等。等。二、蛋白质组学与医学二、蛋白质组学与医学u疾病与蛋白质的关系疾病与蛋白质的关系疾病的发生、发展及预后疾病的发生、发展及预后和和正常生理过程正常生理过程，都与蛋白质的变化，都与蛋白质的变化有关。有关。对机体蛋白质的对机体蛋白质的性质和数量变化性质和数量变化的精确把握，的精确把握，是揭示是揭示机体生理机体生理变化，变化，疾病疾病的的病因病因、发病机制发病机制的重要手段。的重要手段。u蛋白质组学技术在疾病蛋白质组学技术在疾病 诊断和治疗诊断和治疗 中的应用中的应用对于疾病对于疾病生物生物标志物标志物的检测的检测具有不可替代的优势具有不可替代的优势.（高通量）（高通量）寻找寻找特异性蛋白质特异性蛋白质，用于疾病早期诊断。在出现临床症状之前，用于疾病早期诊断。在出现临床症状之前就采取相应的干预治疗手段。就采取相应的干预治疗手段。（早期诊断、早期治疗）（早期诊断、早期治疗）在肿瘤上的应用在肿瘤上的应用从正常组织演变到早期、中晚期癌的不同的病程阶段蛋白质组的改变，从正常组织演变到早期、中晚期癌的不同的病程阶段蛋白质组的改变，研究肿瘤研究肿瘤发生机制发生机制、标志物筛选标志物筛选和鉴定、和鉴定、肿瘤分类肿瘤分类、治疗效果治疗效果的评价，的评价，使肿瘤的诊断、分类和疗效评价，由使肿瘤的诊断、分类和疗效评价，由单一肿瘤标志单一肿瘤标志物发展成为物发展成为蛋白质谱蛋白质谱或基因谱或基因谱的改变来进行的改变来进行综合判断综合判断。（更客观准确）。（更客观准确）结肠癌标记物发现和应用结肠癌标记物发现和应用正常结肠和结肠癌组织的比较正常结肠和结肠癌组织的比较蛋白质组学蛋白质组学研究研究发现三种特异性发现三种特异性结肠癌标记物：结肠癌标记物：(S100 A8)、(S100 A9)和和(S100 All)用于结肠癌的早期筛查用于结肠癌的早期筛查乳腺癌标记物发现和应用乳腺癌标记物发现和应用组学研究发现：组学研究发现：核基质蛋白核基质蛋白66(NMP66)，28.3 kDa，用于大规模的用于大规模的乳腺癌早期诊断乳腺癌早期诊断临床试验。临床试验。与现有血清学标记物与现有血清学标记物CA15-3和和CA27-29的的特异性和敏感性特异性和敏感性相比，相比，更高更高。u在心血管疾病的应用在心血管疾病的应用扩张性心肌病扩张性心肌病的的治疗治疗是医学工作者面临的巨大挑战，是医学工作者面临的巨大挑战，病理机制病理机制不清楚不清楚通过蛋白质组分析有可能从蛋白质水平通过蛋白质组分析有可能从蛋白质水平阐述阐述其其病理机制病理机制。研究结果发现研究结果发现扩张性心肌病扩张性心肌病约约100种蛋白质种蛋白质表达水平下调表达水平下调这些蛋白质变化这些蛋白质变化可能在可能在发病机制发病机制中起着关键作用中起着关键作用 有待于深入有待于深入u在感染性疾病上的应用在感染性疾病上的应用许多致病微生物（如支原体、结核分枝杆菌）许多致病微生物（如支原体、结核分枝杆菌）全基因组测序全基因组测序工作工作已经完成。已经完成。蛋白质组分析有助于蛋白质组分析有助于鉴定鉴定该微生物产生的该微生物产生的全部蛋白质全部蛋白质寻找寻找新的新的诊断标记诊断标记、药物作用靶点药物作用靶点和和制备制备疫苗的抗原决定族疫苗的抗原决定族等等有望有望解决临床上解决临床上令人棘手的令人棘手的致病致病微生物耐药性微生物耐药性问题问题研制出研制出针对性的疫苗针对性的疫苗可进一步可进一步提高感染性疾病提高感染性疾病的的预防治疗效果预防治疗效果如：如：结核分枝杆菌结核分枝杆菌的蛋白质组研究的蛋白质组研究RosenkrandsRosenkrands等等筛选出一种新的蛋白质，用作筛选出一种新的蛋白质，用作诊断标记物诊断标记物，取得了满意的效果。，取得了满意的效果。三、蛋白质组学与药学三、蛋白质组学与药学l疾病的疾病的发生发生和药物治疗和药物治疗靶点靶点与很多蛋白有关与很多蛋白有关蛋白质组学在寻找蛋白质组学在寻找有效的有效的药物药物靶点靶点及及新药开发新药开发方面有广泛的应用。方面有广泛的应用。比较正常状态和疾病状态及药物治疗后细胞内蛋白质表达的差异比较正常状态和疾病状态及药物治疗后细胞内蛋白质表达的差异高通量药物筛选，有可能找到有效的药物靶点的药物。高通量药物筛选，有可能找到有效的药物靶点的药物。l蛋白质组学在蛋白质组学在药物作用药物作用方面的应用方面的应用加速了药物开发、鉴定及改进过程加速了药物开发、鉴定及改进过程例如，分析例如，分析降血脂降血脂药物（药物（洛伐他汀）洛伐他汀）的蛋白质的蛋白质表达差异表达差异分析药理作用机制分析药理作用机制表明表明洛伐他汀洛伐他汀影响了与影响了与胆固醇代谢相关胆固醇代谢相关的一些蛋白质的表达。的一些蛋白质的表达。l在药物在药物毒理学毒理学研究中的作用研究中的作用如：如：环孢素环孢素A，对小鼠对小鼠肾脏的毒性肾脏的毒性作用机制，的研究作用机制，的研究Steiner等通过二维凝胶电泳等通过二维凝胶电泳比较环孢素比较环孢素A，处理肾脏细胞（前，处理肾脏细胞（前后），蛋白质表达丰度变化，后），蛋白质表达丰度变化，结果发现：一个结果发现：一个28kDa的特异蛋白的特异蛋白(calbindin D)表达减少，表达减少，现已证明环孢素现已证明环孢素A的毒性与这种的毒性与这种参与钙离子结合参与钙离子结合及及转运的蛋白质转运的蛋白质减少有关。减少有关。靶点靶点靶点靶点新药新药新药新药 四、蛋白质组学研究中存在的问题及前景展望四、蛋白质组学研究中存在的问题及前景展望1、蛋白质组学研究中存在的问题、蛋白质组学研究中存在的问题l在方法学上在方法学上二维凝胶电泳二维凝胶电泳和和质谱分析质谱分析是是主流技术主流技术，但其分辨率、特异性、灵敏度及，但其分辨率、特异性、灵敏度及重复性重复性有待进一步提高有待进一步提高。（如：。（如：E.Coli，1100个蛋白点，微量蛋白？）个蛋白点，微量蛋白？）如：细胞内执行重要功能的蛋白质和细胞因子表达如：细胞内执行重要功能的蛋白质和细胞因子表达丰度丰度往往很低往往很低，用目，用目前的显色方法前的显色方法难以分辨难以分辨。如：对一些如：对一些高分子量高分子量、极酸极酸或或极碱性极碱性的蛋白质和的蛋白质和膜蛋白膜蛋白分离难度分离难度较大。较大。l现有染色方法：现有染色方法：考马斯亮蓝染色：操作简单、显色背景低，但显色所需时间较长、考马斯亮蓝染色：操作简单、显色背景低，但显色所需时间较长、灵敏灵敏度太低度太低低丰度蛋白难以显示；低丰度蛋白难以显示；银染：费用相对低廉且灵敏度较高，银染：费用相对低廉且灵敏度较高，但但不适于不适于胶内酶切及质谱分析胶内酶切及质谱分析，有，有待进一步的完善；待进一步的完善；荧光染色：灵敏度高、容易与下游的质谱鉴定衔接，线性动态范围超过荧光染色：灵敏度高、容易与下游的质谱鉴定衔接，线性动态范围超过了考马斯亮和银染，了考马斯亮和银染，但费用昂贵但费用昂贵，在一定程度上限制了它的应用范围。，在一定程度上限制了它的应用范围。l二维色谱技术二维色谱技术更有利于高通量和自动化更有利于高通量和自动化分析鉴定分析鉴定蛋白质。蛋白质。串联电喷雾质谱串联电喷雾质谱，进行蛋白质鉴定，进行蛋白质鉴定，但但分辨率分辨率和和重复性重复性有待提高有待提高。l同位素标记亲和标签同位素标记亲和标签(ICATICAT)技术技术精确精确分析分