5疾病产生的分子基础.pptx

疾病产生的分子基础疾病产生的分子基础 Molecular Basis of Diseases Fundationsundations 张宝张宝2014.10.14目 录2一、基因结构、表达异常与疾病发生一、基因结构、表达异常与疾病发生二、基因结构和表达与疾病的研究策略二、基因结构和表达与疾病的研究策略三、三、HGP与疾病相关基因的研究与疾病相关基因的研究四、生物信息学主要研究领域四、生物信息学主要研究领域一、基因结构、表达异常与疾病一、基因结构、表达异常与疾病人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、心脑血管、高血压等的发生发展涉及到有关蛋白质及其复合物蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用的异常。人体内人体内蛋白质蛋白质分子分子结构和结构和功能功能的的异常异常是疾病发生发展是疾病发生发展的主要原因的主要原因 。一、基因结构、表达异常与疾病一、基因结构、表达异常与疾病 细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常基因表达的异常都和疾病发生有关。研究显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。一、基因结构、表达异常与疾病一、基因结构、表达异常与疾病 基因或染色体片段，在精子或卵细胞形成过程中，会因某种结构修饰而不能表达，称为基因基因印迹印迹。生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活基因失活是一种重要的调节方式。基因印迹的印迹的异常异常会导致多种遗传性疾病。6一、一、基因结构、表达异常与疾病发生基因结构、表达异常与疾病发生（二）细胞间信号异常（二）细胞间信号异常（三）细胞内因素（三）细胞内因素（一）基因的结构改变（一）基因的结构改变基因结构示意图81.1.基因突变的多种类型（1 1）点突变点突变是单个碱基的改变（2 2）缺失缺失是一个或多个核苷酸的丢失（3 3）插入插入是一个或多个核苷酸的增加（4 4）倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转（5 5）基因突变还分为配子突变配子突变与体细胞突变体细胞突变（6 6）动态突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变 （一）基因结构改变（一）基因结构改变 定义：定义：DNA一级结构发生改变一级结构发生改变，改变了基因结构。，改变了基因结构。1.基因突变基因突变的类型的类型（1 1）点突变：在基因一级结构的某个位点上，）点突变：在基因一级结构的某个位点上，一种碱基被另一种碱基一种碱基被另一种碱基取代；取代；转换（转换（transitiontransition）颠换颠换（transversiontransversion）1.基因突变的类型（2 2）缺失（）缺失（delelationdelelation）是一个或多个核苷酸的丢失，一个或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变；（3 3）插入（）插入（insertioninsertion）；）；1.基因突变的类型（4 4）倒位倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列重组，使一段DNA序列的方向倒转；（5 5）配子配子突变突变与体细胞体细胞突变；突变；（6 6）动态动态突变突变指串联重复拷 贝数随世代的传递而改变。2.2.基因突变引起的遗传效应基因突变引起的遗传效应a.同义突变(consense mutation)b.错义突变 (missense mutation)c.无义突变(nonsense mutation)d.终止密码子突变或延长突变e.起始密码子突变(initiation codon mutation)f.非编码序列点突变(point mutation in noncoding sequence)14同义突变同义突变 、错义突变、无义突变、延长突变、错义突变、无义突变、延长突变、起始密码子突变、非编码序列点突变起始密码子突变、非编码序列点突变3.3.基因突变影响不均一核基因突变影响不均一核RNA(RNA(hnRNAhnRNA)的剪接的剪接 基因突变发生在 hnRNA 一级结构特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，产生异常的蛋白产物，改变生物性状。血红蛋白结构血红蛋白结构血红蛋白是由4条肽链（两个和两个链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。4.结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病血红蛋白分子一级结构上的轻微差别；正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。血红蛋白病血红蛋白病镰刀形细胞贫血症镰刀形细胞贫血症血红蛋白病类型血红蛋白病类型异常血红蛋白：珠蛋白结构异常血红蛋白：珠蛋白结构(质质)变异，导致贫血。变异，导致贫血。地中海贫血：珠蛋白合成地中海贫血：珠蛋白合成(量量)减少，又称珠蛋白合成减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。障碍性贫血。基因突变类型基因突变类型异常异常Hb氨基酸变化氨基酸变化临床特征临床特征 错义突变错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG)不稳定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG)镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA)不稳定Hb病 无义突变无义突变 Hb Mckees Rocks 145Tyr终止(UAUUAA)不稳定Hb病 终止密码突变终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA-地贫 (延长：142Gln-173UAA)密码子缺失密码子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不稳定Hb病 密码子插入密码子插入 Hb Grady 118与119间插入3个氨基酸 无明显症状 移码突变移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA-不稳定Hb病 -158UAA(Thr)5.5.常常见单基因病：见单基因病：疾病名称疾病名称发病频率发病频率()遗传方式遗传方式致病基因致病基因典型症状典型症状血友病血友病A0.1X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血血友病血友病B0.03X连锁连锁凝血因子凝血因子不规则出血不规则出血杜氏肌营养不良杜氏肌营养不良0.3X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩贝氏肌营养不良贝氏肌营养不良0.05X连锁连锁肌营养因子肌营养因子肌萎缩肌萎缩脆性脆性X综合征综合征0.5X连锁连锁FMR1智力障碍智力障碍舞蹈病舞蹈病0.5常染色体显性常染色体显性舞蹈病因子舞蹈病因子痴呆痴呆神经纤维神经纤维0.4常染色体显性常染色体显性NF-1,2癌变癌变珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血0.05常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇贫血贫血镰刀细胞贫血镰刀细胞贫血0.1常染色体隐性常染色体隐性珠蛋白基因珠蛋白基因贫血贫血,局部缺血局部缺血苯丙酮酸尿苯丙酮酸尿0.1常染色体隐性常染色体隐性苯丙氨酸羟基化酶苯丙氨酸羟基化酶无苯丙酮酸代谢能力无苯丙酮酸代谢能力囊性纤维化囊性纤维化0.4常染色体隐性常染色体隐性CFTR进行性肺损伤及其他进行性肺损伤及其他囊性纤维化病囊囊 性性 纤纤 维维 化化 病病 囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。Gene therapy of CF 将重组 CFTCR基因 cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR基因的表达，纠正Cl转运缺陷，减少黏液分泌。（二）细胞间信号异常 -导致基因表达变化引起疾病人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。甲胎蛋白（AFP）接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。（三）细胞内因素导致基因表达异常引起疾病二、二、基因结构和表达与疾病的研究策略基因结构和表达与疾病的研究策略1通过结构分析确定基因变异 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot分型法、Mass Array分型法2基因表达水平分析 差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析3通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、RNAi技术、基因诱导超表达281 1通过通过结构分析结构分析确定基因变异确定基因变异 PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序法、TaqMan探针法SNP分型、SNaPshot法、Mass Array法（1）单链构象多态性(PCR-SSCP)PCR产物变性后，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象立体构象，其构象直接影响泳动速率，单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。29PCR产物用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳上分辨。不同等位基因经切割后产生不同长度的不同长度的DNADNA片段片段条带。30（2）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)RFLP-Restriction Fragment Length Polyhmorphism（3）直接测序法Sanger法-双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸，ddNTP及荧光标记的四个碱基，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测，获得DNA碱基序列。323334（4）TaqMan探针法SNP分型针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物引物和TaqMan探针探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5-端和3-端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团和一个淬灭淬灭荧光基团荧光基团。存在PCR产物时，产生适合于核酸外切酶核酸外切酶活性的底物，从而将探针5-端连接的荧光分子荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。（5）SNaPshot法35测序酶、四种荧光标记ddNTP、5-端不同长度延伸引物和PCR产物模板，引物延伸一个碱基即终止，经检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。通常用于通常用于10-30个个SNP位点分析位点分析(6)Mass Array法36MassEXTEND单碱基延伸反应，紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以ddNTP替代dNTP，使探针仅在使探针仅在SNP位点处延伸位点处延伸一个碱基即终止。一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪即可检测出这种分子分子量量差异，从而实现SNP分型的目的。2 2基因基因表达表达水平分析水平分析37 差异显示、基因表达芯片、RNA-seq分析（1）差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction,DDRT-PCR)在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。原理原理：利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3端引物端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物。这些引物由1112个 T 及两个其它的碱基组成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。5端引物：5端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。用 3锚定引物和 5随机引物进行扩增，可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。（2）表达芯片基因表达谱芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探针，固化在芯片上；将待测样品（处理组）与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。424344(3)RNA-SeqRNA-seq即转录组测序即转录组测序技术，就是把技术，就是把mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA等或者等或者其中一些用高通量测序其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出技术把它们的序列测出来，分析它们的表达水来，分析它们的表达水平。平。45463通过通过功能学功能学研究确定致病基因研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、RNAi技术、基因诱导超表达（1）转基因技术 指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。48显微注射法：显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。49 反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合到宿主细胞的染色体上。50 体细胞核移植，把体细胞核移入去核卵母细胞中，使其发生再程序化并发育为新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。也叫克隆动物。（2）基因敲除技术）基因敲除技术定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。应用应用DNA同源重组原理进行基因敲除。同源重组原理进行基因敲除。利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除RNA干扰也可以引起基因敲除干扰也可以引起基因敲除 利用基因同源重组进行基因敲除 同源重组同源重组(homologous recombination)(homologous recombination)，又称基因重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。52利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除基因捕获法基因捕获法 利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。What is RNAi?RNA干扰（RNA interference，RNAi）内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。转录后基因表达抑制现象的发现转录后基因表达抑制现象的发现CHS GeneCHS Gene矮牵牛花矮牵牛花(Jorgensen,R,1990)RNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi)RNAi 是将一段双链的RNA 序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制基因敲除技术与诺贝尔奖 三位在基因敲除技术敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授 （5 5）基因诱导超表达技术）基因诱导超表达技术 将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。三、三、HGP与疾病相关基因的研究与疾病相关基因的研究随随着着人人类类基基因因组组草草图图测测定定的的完完成成，宣宣告告了了“后后基基因因组组时时代代”的的到到来来。功功能能基基因因组组学学成成为为研研究究的的重重心心，蛋蛋白白质质组组学学的的研研究究受受到到了了空空前前的的关关注注，也也为为疾疾病病相相关关基基因因的克隆创造了条件。的克隆创造了条件。同同一一种种细细胞胞或或组组织织，处处于于不不同同的的状状态态（生生理理与与病病理理等等），发发育育的的不不同同阶阶段段，受受到到外外界界的的不不同同影影响响时时，都都可可能能使使细细胞胞中中蛋蛋白白质质的的情情况况产产生生相相应应的的变变化化，从从而而产产生生不不同同的的蛋蛋白白质质组组。蛋蛋白白质质组组学学关关注注和研究的就是这些变化。和研究的就是这些变化。研究蛋白质与疾病相互关系的方法研究蛋白质与疾病相互关系的方法ELISAELISA免疫印迹免疫印迹免疫沉淀免疫沉淀蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析毛细管电泳毛细管电泳四、生物信息学主要研究领域四、生物信息学主要研究领域 建立和管理各种生物信息数据库建立和管理各种生物信息数据库核酸序列数据库核酸序列数据库三维结构数据库三维结构数据库 基因组序列信息的提取和分析基因组序列信息的提取和分析序列比对（序列比对（Alignment）和结构比对）和结构比对蛋白质结构预测蛋白质结构预测蛋白质编码基因的计算机辅助识别蛋白质编码基因的计算机辅助识别非编码区分析和非编码区分析和DNA语言研究语言研究 分子进化和比较基因组学分子进化和比较基因组学 、遗传密码的起源、遗传密码的起源 序列重叠群（序列重叠群（Contigs）的装配）的装配 生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计 DNADNA芯片和微阵列的发展芯片和微阵列的发展