分子克隆常用的DNA聚合酶.pptx

分子克隆 安普利试剂研发部 胡师凯主要内容n（一）.基本概念n（二）.分子克隆技术的基本过程n 1.1.概述概述n 2.2.分子克隆中常用工具酶分子克隆中常用工具酶n 3.3.基因克隆常用载体基因克隆常用载体n 4.4.目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备n 5.5.目的基因的体外重组目的基因的体外重组n 6.6.重组子导人宿主细胞重组子导人宿主细胞n 7.7.阳性重组子的筛选和鉴定阳性重组子的筛选和鉴定（一）（一）.基本概念基本概念:1.分子克隆：是在体外对分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。2.Dalton，bp，nt道尔顿道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。（千道尔顿）来表示。碱基对（碱基对（bp）basepair，1kb就是就是1000个碱基个碱基对；对；nt核苷酸核苷酸nucleotide。（一）（一）.基本概念基本概念n3.保护碱基保护碱基n在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序引物时，人为的在酶切位点序列的列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。基，用来提高将来酶切时的活性。n（一）（一）基本概念基本概念 4.T-A克隆：克隆：利用利用Taq酶在酶在PCR产物产物3末端有加上一末端有加上一个个A的特性，使得的特性，使得Taq酶的酶的PCR产物或经产物或经过过Taq酶加酶加A的的PCR产物，和一个人工加产物，和一个人工加上一个上一个3末端具有末端具有1个个T的载体进行连接，的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。提高目的基因和载体的连接效率。（一）（一）基本概念基本概念n5.RNA酶酶H活性：活性：n降解杂合在降解杂合在DNA链上的链上的RNA的磷酸二的磷酸二酯键。可消化酯键。可消化mRNA。n6.载体：载体：n是指能在连接酶作用下和外源是指能在连接酶作用下和外源DNA片片段或基因连接，并运送段或基因连接，并运送DNA分子进入受分子进入受体细胞的体细胞的DNA分子。分子。（一）（一）基本概念基本概念n7.质粒质粒(plasmid)n 细菌染色体外细菌染色体外的遗传物质，为环形闭的遗传物质，为环形闭合的双股合的双股DNA，存在于细胞质中，质粒，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。细菌的遗传变异有关。（一）（一）基本概念基本概念n8.F因子n 又称致育因子或性因子。是又称致育因子或性因子。是E.coli等等细菌中决定性别的质粒，约等于细菌中决定性别的质粒，约等于2%核染核染色体色体DNA的小型共价闭合环状的小型共价闭合环状DNA（cccDNA通过共价键结合形成的封闭环通过共价键结合形成的封闭环状状DNA分子。）分子。）。分子量为。分子量为6.2107 Da，94.5Kb。其中有。其中有1/3的基因（的基因（tra区）与接合作用有关。区）与接合作用有关。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程n 1.概述概述n（1）.分：得到目的基因分：得到目的基因n（2）.切：将目的基因和载体用适当的限切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。制性内切酶切割。n（3）.接：将目的基因和载体连接，形成接：将目的基因和载体连接，形成重组子。重组子。n（4）.转：将重组子转到适当的宿主细胞转：将重组子转到适当的宿主细胞中。中。n（5）.筛：筛选出含有正确重组子的宿主筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。细胞，扩增。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程2.分子克隆中常用工具酶分子克隆中常用工具酶分子克隆中对分子克隆中对DNA、RNA分子的操作常分子的操作常涉及到一系列酶促反应，这些酶是进行基涉及到一系列酶促反应，这些酶是进行基因克隆时必备的基本工具。因克隆时必备的基本工具。分类分类（1）.使核酸降解的核酸酶类：使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶。核酸内切酶、核酸外切酶。（2）.催化核酸合成的酶类：催化核酸合成的酶类：DNA聚聚合合酶酶，RNA聚聚合合酶酶，连连接接酶酶，逆逆转转录酶。录酶。（3）.核酸修饰酶类；核酸修饰酶类；甲基化酶，激酶，基团转移酶，甲基化酶，激酶，基团转移酶，磷酸酶等。磷酸酶等。（1）.使核酸降解的核酸酶类：使核酸降解的核酸酶类：.限制性核酸内切酶概念的提出及背景：限制性核酸内切酶概念的提出及背景：20世世纪纪30年年代代初初，微微生生物物学学家家发发现现，微微生生物物的的噬噬菌菌体体不不能能交交叉叉感感染染。如如E.coliK株株的的噬噬菌菌体体只只能能感感染染E.coliK株株，不不能能感感染染其其他他株株，反反之之亦亦然然。这这种种现现象象成成为为限限制制现现象。象。但但某某些些被被菌菌体体限限制制的的噬噬菌菌体体群群中中，有有少少数数能能幸幸存存下下来来，并并在在菌菌体体中中繁繁殖殖，这这种种现现象象称为称为修饰现象。修饰现象。n 是由细菌自己产生的一种能识别双链是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。化所保护。.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE)的定义的定义.限制性核酸内切酶的分类：限制性核酸内切酶的分类：按按照照限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶对对辅辅助助因因子子的的需需求求与与否否，以以及及切切割割DNA链链的的特特点点，将将已已发发现现的的限限制制性性内内切切酶酶分分为为3种种类类型型：I、型。型。型型限限制制性性内内切切酶酶实实际际应应用用价价值值最最大大，这这是是因为：因为：型型酶酶只只具具有有限限制制性性活活性性，无无甲甲基基化化修修饰饰活性；活性；对对DNA的的切切割割要要求求严严格格的的序序列列作作为为靶靶位位点点，切割精确；切割精确；此类酶作用时只需要此类酶作用时只需要Mg2+参与。无需参与。无需ATP。因因此此型型限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是基基因因工工程程中中剪剪切切DNA分分子子的的常常用用工工具具酶酶，被被誉誉为为分分子子生生物物学家的手术刀。学家的手术刀。限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名目目 前前 已已 广广 泛泛 采采 用用 H O Smith和和 DNathams于于1973年年提提出出的的命命名名系系统统：限限制制性性内内切切酶酶第第一一个个大大写写字字母母来来自自细细菌菌的的属属名名(genus)，第第二二、三三个个小小写写字字母母来来自自种种名名(species)，第第四四个个字字母母代代表表菌菌株株(strain)：如如果果从从一一种种菌菌株株中中发发现现了了多多种种限限制制酶酶，则则根根据据发发现现和和分分离离的的顺顺序序用用罗罗马马字字母母表表示示。例例如如从从流流感感嗜嗜血血杆杆菌菌D株株中中分分离离到到的的限限制制酶酶分分别别表表示示为为HindI、，EcoRI。.限制性内切酶的作用特点：限制性内切酶的作用特点：n有有严严格格的的识识别别、切切割割的的DNA序序列列，并并以以内内切切的的方方式式水水解解双双链链DNA分分子子中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键，产产生生的的DNA片片段段5端为端为P，3端为端为OH。n识别序列一般为识别序列一般为46个碱基对，个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成并以切割序列的正中作为轴心，成180反向重复反向重复(inverted repeat)。这种结构也称为回文结构这种结构也称为回文结构(palindrom)。切割后产生切割后产生平头或粘性末端平头或粘性末端。型型RE酶只需酶只需Mg2+，不需不需ATP。限制性内切酶限制性内切酶(Restriction Endonuclease).限制性内切酶使用时的注意事项限制性内切酶使用时的注意事项n.要求较纯的底物要求较纯的底物DNA。n.Mg2+和和Tris-HCl缓缓冲冲体体系系，并并且且大大多多数数内内切酶活性切酶活性pH范围在范围在7276之间；之间；n.同同时时反反应应体体系系中中不不能能含含有有酚酚、氯氯仿仿、乙乙醚醚、SDS以及大于以及大于10mmolL的的EDTA；n.对离子强度的要求分为对离子强度的要求分为3个级别，个级别，n 高盐高盐(100mmolL NaCl)，n 中盐中盐(50mmolL NaCl)，n 低盐低盐(010mmolL NaCl)。n.在在酶酶反反应应缓缓冲冲体体系系中中均均添添加加有有二二硫硫苏苏糖糖醇醇或或-巯巯基基乙乙醇醇，以以稳稳定酶活性防止氧化。定酶活性防止氧化。n.在具体试验操作时应在低温或在具体试验操作时应在低温或冰浴条件下完成。冰浴条件下完成。2.分子克隆中常用工具酶分子克隆中常用工具酶n（2）.催化核酸合成的酶类：催化核酸合成的酶类：n分子克隆常用的分子克隆常用的DNA聚合酶：聚合酶：n依赖依赖DNA的大肠杆菌的大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I。nKlenow片段。片段。nT4噬菌体噬菌体DNA聚合酶。聚合酶。nT7噬菌体噬菌体DNA聚合酶。聚合酶。n经修饰的经修饰的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶。（测序酶）聚合酶。（测序酶）n耐热耐热DNA聚合酶。聚合酶。n依赖依赖RNA 的的DNA聚合酶。（逆转录酶）聚合酶。（逆转录酶）DNA聚合酶聚合酶I：nDNA聚聚合合酶酶I是是Kornberg从从大大肠肠杆杆菌菌中中发发现现的的第第一一个个DNA聚聚合合酶酶，商商品品名名称称为为kornberg酶酶，分分子子量量109KD。此此酶酶是是一一个个多多功功能能酶酶，包包括括3种酶活性：种酶活性：n 5-3聚聚合合酶酶活活性性：催催化化单单核核苷苷酸酸聚聚合合到到DNA的的3-OH末端，使末端，使DNA链从链从5-3延伸；延伸；n 5-3外外切切酶酶活活性性：即即从从游游离离的的5末末端端降降解解双双链链DNA或单链或单链DNA成为单核苷酸成为单核苷酸n 3-5外切酶活性。外切酶活性。n另外该酶还具有另外该酶还具有RNA酶酶H活性。活性。DNA聚合酶聚合酶I作用条件：作用条件：n4种种dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、Mg2+n DNA作作为为模模板板，单单链链DNA或或有有缺口的双链缺口的双链DNA均可；均可；n 需需要要具具有有游游离离3-OH的的引引物物或或缺口的缺口的3末端末端.TaqDNA聚合酶聚合酶nTaqDNA聚聚合合酶酶是是一一种种依依赖赖DNA的的单单亚亚基基耐耐热热DNA聚聚合合酶酶，分分子子量量约约为为94KD。该该酶酶最最初初由由极极端端嗜嗜热热水水生生菌菌Thermus aquaticus中中提提取取并并纯纯化化，目目前前已已能能通通过基因工程方式大量生产。过基因工程方式大量生产。TaqDNA聚合酶的应用聚合酶的应用nTaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，中，能以能以DNA为模板，从结合在模板上的引物为模板，从结合在模板上的引物出发，以出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，为原料，按碱基配对方式，从从5-3方向合成新的方向合成新的DNA链。链。TaqDNA聚合酶在聚合酶在7075时具有最佳的生物活性时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。同，随着温度的降低，酶活性明显下降。同时此酶缺乏时此酶缺乏3-5外切酶活性，因而无校正外切酶活性，因而无校正功能。功能。.DNA连接酶：n催化双链催化双链DNA中相邻碱基的中相邻碱基的5磷酸磷酸和和3羟基间磷酸二酯键形成的酶，称羟基间磷酸二酯键形成的酶，称为为DNA连接酶连接酶(DNA ligase)。DNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种：nT4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 大肠杆菌的大肠杆菌的DNA连接酶连接酶T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶nT4DNA连连接接酶酶最最早早是是从从T4噬噬菌菌体体感感染染的的大大肠肠杆杆菌菌中中发发现现并并分分离离的的，分子量分子量68kDa。特点：nA.催化双链催化双链DNA平头末端或黏性末端相平头末端或黏性末端相邻核酸的邻核酸的5-P和和3-OH连接反应。连接反应。nB.催化双链催化双链RNA和杂交双链和杂交双链RNA/DNA连接，但不能催化单链核酸的连接。连接，但不能催化单链核酸的连接。nC.可修补在双链可修补在双链DNA、RNA或或DNA/RNA杂种分子中的单链切口杂种分子中的单链切口。大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶特点特点：nA.连接双链连接双链DNA中一条链上的缺口催化中一条链上的缺口催化nB.存在的互补粘性末端的存在的互补粘性末端的DNA片段需片段需 NAD+上述情况下可代替上述情况下可代替T4DNA连接酶，它产生连接酶，它产生 的背景低，准确性高。的背景低，准确性高。nC.连接平头末端连接平头末端DNA分子需聚乙二醇或分子需聚乙二醇或 Ficoll.反转录酶：反转录酶：n能能以以RNA为为模模板板合合成成DNA的的DNA聚聚合合 酶酶 称称 为为 反反 转转 录录 酶酶(reverse transcriptase，RT)，合合成成的的DNA产产物物称称为为互互补补DNA(complementary DNA，cDNA)。反转录酶的作用特点：反转录酶的作用特点：n反反转转录录酶酶以以单单链链RNA或或单单链链DNA为为模模板板，以以4种种dNTP及及游游离离3-OH为为引引物物，按按5-3方向合成方向合成DNA；n可可用用于于cDNA第第一一链链和和第第二二链链的的合合成成，同同时时逆逆转转录录酶酶有有5-3和和3-5RNA外外切切酶酶活活性性(3-5切切活活性性又又称称RNA酶酶H活活性性)，3-5RNA外外切切酶酶活活性性可可用用于于特特异异降降解解RNA/DNA杂交分子中杂交分子中RNA部分。部分。n此此酶酶缺缺乏乏起起校校正正作作用用的的3-5 DNA核核酸酸外外切切酶酶活活性性，催催化化的的聚聚合合DNA反应会产生一定的错配率。反应会产生一定的错配率。n常常用用的的逆逆转转录录酶酶有有禽禽类类成成骨骨细细胞胞性性白白 血血 病病 病病 毒毒(AMV)逆逆 转转 录录 酶酶 和和Moloney小小鼠鼠白白血血病病病病毒毒(M-MLV)逆转录酶逆转录酶。反转录酶的作用特点：反转录酶的作用特点：.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶末端转移酶)n末末端端脱脱氧氧核核苷苷酸酸转转移移酶酶(terminal deosynucleotidyl transferase）多多从从小小牛牛胸胸腺腺中中分分离离出出，催催化化多多个个脱脱氧核苷酸依次加到氧核苷酸依次加到DNA 3末端。末端。末端脱氧核苷酸转移酶的作用：末端脱氧核苷酸转移酶的作用：n末端转移酶常用于给载体或末端转移酶常用于给载体或cDNA加上互补的多聚尾巴，构加上互补的多聚尾巴，构建人工粘性末端；也用于建人工粘性末端；也用于DNA分分子子3端标记。端标记。.碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：n碱碱性性磷磷酸酸酶酶(alkalinephosphatase)来来源源于于大大肠肠杆杆菌菌和和牛牛小小肠肠，能能水水解解DNA、RNA以以及及脱脱氧氧核核糖糖三三磷磷酸酸(dNTP)上上的的5磷酸根。磷酸根。碱性磷酸酶应用：碱性磷酸酶应用：在分子克隆的连接反应中预先处理载体在分子克隆的连接反应中预先处理载体DNA片段，以去除片段，以去除5-P，防止载体重新，防止载体重新自体连接，以提高重组效率；自体连接，以提高重组效率；用用32P标记标记5末端时，用此酶去除末端时，用此酶去除5-P，再用激酶对再用激酶对5末端进行同位素标记；末端进行同位素标记；作为化学发光物测定或其他检测系统的作为化学发光物测定或其他检测系统的指示酶。指示酶。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程 3.3.基因克隆常用载体基因克隆常用载体n目前用于基因克隆的载体种类繁多，目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体物病毒载体等等 载体必须具备以下基本条件：载体必须具备以下基本条件：n.载载体体必必须须有有自自我我的的复复制制子子，能能借借助助宿宿主主细细胞胞的的复复制制和和调调控控系系统统对对携携带带的的目目的的基因进行复制和增殖。基因进行复制和增殖。n.载载体体分分子子必必须须具具备备多多种种限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别位位点点(多多克克隆隆位位点点)，易易于于外外源源DNA分子与载体连接及重组。分子与载体连接及重组。n.载载体体及及宿宿主主细细胞胞应应具具有有多多个个利利于于选选择择和和筛筛选选的的遗遗传传表表型型或或标标志志，包包括括抗抗药药性性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等。载体必须具备以下基本条件：载体必须具备以下基本条件：n.载载体体必必须须有有足足够够的的容容量量以以容容纳纳外外源源DNA片片段段，同同时时载载体体分分子子应应具具有有拷拷贝贝数数高高、易易与与宿宿主主细细胞胞的的DNA分分子分离并易提取、抗剪切力强等特点。子分离并易提取、抗剪切力强等特点。n.表达型载体还应具备与宿主细胞表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的相适应的启动子、前导序列、增强子启动子、前导序列、增强子等调控元件等调控元件。.质粒质粒载体：载体：.质粒质粒载体：载体：n 质粒是细菌染色体外的遗传单位，是一质粒是细菌染色体外的遗传单位，是一种双链环状的种双链环状的DNA分子，大小在分子，大小在1200kb之间。质粒自身含有复制起始之间。质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子制子(replicon)，能利用细菌的酶系统，能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。进行独立的复制及转录。质粒的特点：质粒的特点：n.分分子子较较小小，一一般般约约数数kb左左右右，比比较较稳稳定，具有较高的拷贝数。定，具有较高的拷贝数。n.含含有有高高效效的的复复制制子子，能能在在细细菌菌的的蛋蛋白白质质合合成成受受阻阻，染染色色质质DNA合合成成停停止止时时，利利用用细细菌菌的的酶酶系系统统进进行行质质粒粒自自身身的的复复制制。因因此此在在实实验验中中常常利利用用氯氯霉霉素素以以阻阻止止细细菌菌蛋蛋白白质质的的合合成成，而而使使质质粒粒的的拷拷贝贝数数增增加加至数千。至数千。n.质粒具有多种遗传选择标记，包括各质粒具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。种抗药基因或营养代谢基因等。遗传选择标记：遗传选择标记：n氨苄青霉素抗性氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因基因：n 此基因编码此基因编码内酰胺酶，该酶能内酰胺酶，该酶能水解氨苄青霉素水解氨苄青霉素内酰胺环，使之内酰胺环，使之失效而使细菌产生耐药。失效而使细菌产生耐药。n四环素抗性四环素抗性(tetracycline resistance，tetr)基因基因：该基因编：该基因编码一种膜相关蛋白以阻止四环素进入码一种膜相关蛋白以阻止四环素进入细胞。细胞。n不同的质粒具有不同的抗药基因，质不同的质粒具有不同的抗药基因，质粒的粒的ampr、tetr基因若被外源基因插基因若被外源基因插入而失活，就失去了耐药性，因此抗入而失活，就失去了耐药性，因此抗药基因常作为基因工程的筛选标志。药基因常作为基因工程的筛选标志。遗传选择标记：遗传选择标记：n大肠杆菌大肠杆菌LacZ基因基因：n LacZ基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基团色基团X与半乳糖以糖苷键结合成的无色化合物与半乳糖以糖苷键结合成的无色化合物X-gal。用含有。用含有X-gal的培养基培养细菌时，在的培养基培养细菌时，在细菌的乳糖操纵子细菌的乳糖操纵子(Lac operon)诱导物异丙基诱导物异丙基硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside，IPTG)的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解的作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落变为蓝色；如果，菌落变为蓝色；如果LacZ基因被外源基因被外源DNA分子插入而遭到破坏，则不能生成相应的半乳糖分子插入而遭到破坏，则不能生成相应的半乳糖苷酶，菌落为白色。通过观察菌落的颜色，能方苷酶，菌落为白色。通过观察菌落的颜色，能方便地进行基因克隆的筛选工作。便地进行基因克隆的筛选工作。遗传选择标记遗传选择标记n蓝白斑试验（蓝白斑试验（IPTG-X gal IPTG-X gal 试验）试验）n乳糖乳糖:乳糖操纵子的天然诱导物乳糖操纵子的天然诱导物.nIPTG:IPTG:乳糖类似物异丙基乳糖类似物异丙基-D-D-硫代半硫代半乳糖苷乳糖苷,有更强的诱导作用有更强的诱导作用(诱导剂诱导剂)。nLacZLacZ基因基因:编码半乳糖苷酶编码半乳糖苷酶 (表达检测剂表达检测剂)nX-gal X-gal 蓝色吲哚产物蓝色吲哚产物.几种常见的质粒载体：n pBR322n pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长粒，全长4363bp，由，由3种野生质粒成分构建而种野生质粒成分构建而成，含有成，含有Ampr和和Tetr两个抗药基因标记，一个两个抗药基因标记，一个复制起始点复制起始点(ori)，复制子为，复制子为Col EI。其中。其中ori来来自自pM9，Ampr来自来自pRSF2124，Tetr来自来自pSCl01。在。在Ampr和和Tetr基因中共含有基因中共含有8个限制个限制性酶切位点，以供外源性酶切位点，以供外源DNA片段的插入。其中片段的插入。其中在在Ampr 基因中的单一酶切位点有基因中的单一酶切位点有PstI、Pvu等；在等；在Tetr基因中的位点有基因中的位点有BamHI、Hind、SalI等。等。.几种常见的质粒载体：n pUC18/pUC19 pUC18/pUC19npUCpUC系列质粒是由大肠杆菌系列质粒是由大肠杆菌pBRpBR质粒和质粒和M13M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点，复制子为始点，复制子为Col EICol EI。pUCpUC系列质粒带系列质粒带有一段大肠杆菌有一段大肠杆菌LacLac操纵子操纵子DNADNA片段，能编片段，能编码码-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的与大肠杆菌的galgal-基因互补。基因互补。n当当pUCpUC质粒转化到质粒转化到galgal-的宿主菌后，的宿主菌后，在含有诱导物在含有诱导物IPTGIPTG和生色底物和生色底物X-galX-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNADNA片段克隆到片段克隆到pUCpUC的的LacLac基因区域时，基因区域时，造成造成LacLac基因失活，在含有基因失活，在含有IPTGIPTG、X-X-galgal的培养基上将生成白色菌落。的培养基上将生成白色菌落。其他其他载体：载体：nM13噬菌株载体：噬菌株载体：nM13噬菌体是一种丝状噬菌体，全长噬菌体是一种丝状噬菌体，全长为为6407bp，呈闭合环状并以正链单，呈闭合环状并以正链单链链DNA(singlestranded DNA，ssDNA)形式存在于噬菌体颗粒内。形式存在于噬菌体颗粒内。M13只感染具有只感染具有F因子的雄性大肠杆因子的雄性大肠杆菌。菌。nM13感染大肠杆菌（感染大肠杆菌（ssDNAssDNA）n 酶酶 nRFDNA(双链复制型双链复制型)（可用作基因克隆可用作基因克隆n 的载体的载体）nRFDNA拷贝数达到拷贝数达到100200个后个后 n只合成单链正链只合成单链正链DNA n包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢包装成为成熟的噬菌体颗粒并从细菌体内溢出。出。M13噬菌株载体：噬菌株载体：特点：特点：.对外源对外源DNA的插入无长度的限制的插入无长度的限制 RF DNA作克隆。作克隆。.常用载体常用载体M13mp18/M13mp19.蓝白斑鉴定蓝白斑鉴定（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程n4.4.目的基因的分离与制备目的基因的分离与制备n、人工合成基因、人工合成基因n、应用聚合酶链反应获取目的基因、应用聚合酶链反应获取目的基因、人工合成基因：、人工合成基因：n知道目的基因的结构与核苷酸序列及知道目的基因的结构与核苷酸序列及其他相关的基因信息。其他相关的基因信息。n对于短片段对于短片段(2030bp)的合成效率的合成效率较高，对于较长的基因片段的合成，较高，对于较长的基因片段的合成，必须先按照已知的必须先按照已知的DNA序列将其划序列将其划分为较短的片段，由合成仪逐一合成分为较短的片段，由合成仪逐一合成再拼接成大片段。再拼接成大片段。、应用聚合酶链反应获取目的基因、应用聚合酶链反应获取目的基因 n.选选择择不不同同的的DNA分分子子为为模模板板，通通过过PCR扩扩增增以以获获取取包包括括外外显显子子、内内含含子子以以及及相应调控元件的完整基因片段；相应调控元件的完整基因片段；n.还还可可以以用用RNA分分子子为为模模板板，通通过过逆逆转转录录PCR扩扩增增生生成成cDNA以以获获得得大大量量的的不不含含内内含含子子及及调调控控序序列列，只只含含有有结结构构基基因因的的DNA片段。片段。n.通通过过PCR技技术术获获取取的的DNA片片段段可可直直接接用用于于后后续续的的基基因因克克隆隆、探探针针制制备备、cDNA文库的建立等众多的分子生物学研究中。文库的建立等众多的分子生物学研究中。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程n5.5.目的基因的体外重组目的基因的体外重组 n DNA分子的体外重组分子的体外重组:是是DNA分分子之间的连接过程。这是一个子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应连接酶催化的生物化学反应。几种常用的几种常用的DNA分子连接方法分子连接方法 n粘性末端连接法粘性末端连接法(cohesive end ligation)n平头末端连接法平头末端连接法(blunt end ligation)n人工接头法人工接头法(artifical linker)n同源多聚尾序同源多聚尾序(homopolymeric tails)连接法连接法 粘性末端连接法粘性末端连接法(cohesive end ligation)n 这种方法适用于插入片段和载体分这种方法适用于插入片段和载体分子具有相同的粘性末端子具有相同的粘性末端(cohesive end)，相同的粘性末端在，相同的粘性末端在DNA连接连接酶的作用下很容易重新连接在一起。酶的作用下很容易重新连接在一起。II类限制酶一般识别长度为类限制酶一般识别长度为4个或个或6个呈二个呈二重对称的核苷酸特异序列重对称的核苷酸特异序列粘性末端连接法存在以下几点缺陷粘性末端连接法存在以下几点缺陷：n高背景，即存在一定数量的载体自身高背景，即存在一定数量的载体自身环化分子环化分子 n双向插入双向插入。可采用可采用定向克隆定向克隆方式，即方式，即对载体和插入片段均使用两种内切酶进行对载体和插入片段均使用两种内切酶进行处理处理。n多拷贝插入，将造成表达困难。适当多拷贝插入，将造成表达困难。适当调整插入片段与载体分子的比例能减少多调整插入片段与载体分子的比例能减少多拷贝插入的产生，一般采用拷贝插入的产生，一般采用2：1(插入片插入片段摩尔数：载体摩尔数段摩尔数：载体摩尔数)n粘性末端连接法粘性末端连接法注意事项：注意事项：n.去除去除5端磷酸基团以防止载体自端磷酸基团以防止载体自身环化连接。身环化连接。n.对于双向插入应采用内切酶图谱对于双向插入应采用内切酶图谱对阳性重组子进行筛选；对阳性重组子进行筛选；n.对于多拷贝插入问题应加对于多拷贝插入问题应加T4DNA连接酶浓度、降低连接酶浓度、降低ATP浓度、载体去浓度、载体去磷酸化等措施以尽量减少其可能性。磷酸化等措施以尽量减少其可能性。平头末端连接法平头末端连接法(blunt end ligation)n平头结构，在平头结构，在T4DNA连接酶的作用连接酶的作用下同样能进行连接。但是这种连接下同样能进行连接。但是这种连接方式的效率较低方式的效率较低。这时应适当增加。这时应适当增加酶量，提高反应中底物的浓度并延酶量，提高反应中底物的浓度并延长反应时间。长反应时间。人工接头法人工接头法(artifical linker)n人工接头主要用于在人工接头主要用于在DNA分子的平分子的平头末端上添加新的内切酶位点以产生头末端上添加新的内切酶位点以产生粘性末端，以提高连接效率。粘性末端，以提高连接效率。n人工接头大小一般为人工接头大小一般为812个碱基对。个碱基对。同源多聚尾序同源多聚尾序(homopolymeric tails)连接法连接法 n末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）能催）能催化脱氧核苷酸逐个添加到单、双链化脱氧核苷酸逐个添加到单、双链DNA分子的分子的3-OH末端上末端上。n目的目的DNA分子与载体分子可通过多分子与载体分子可通过多聚尾巴的同源互补连接在一起。聚尾巴的同源互补连接在一起。n末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的最）的最适底物是具有适底物是具有3端突出的双链端突出的双链DNA。定向克隆：定向克隆：n定向克隆是指将外源定向克隆是指将外源DNA片段定向片段定向插入到载体中的方法。插入到载体中的方法。n要做到定向插入则要求载体要做到定向插入则要求载体DNA分分子的两端不能互补，同时外源子的两端不能互补，同时外源DNA分子的末端是不相互补的粘性末端，分子的末端是不相互补的粘性末端，或者一端为粘性末端，另一端为平头或者一端为粘性末端，另一端为平头末端。末端。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程n6.重组子导入宿主细胞重组子导入宿主细胞 n体外重组生成的重组子必须导入到体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。增和表达。n宿主细胞分为两种：原核细胞和真宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。核细胞。n感受态细胞感受态细胞(competent cell):n 系指利用理化的方法人工诱导系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外细菌，使之处于易于吸收和容纳外源源DNA分子的状态，这时的细胞就分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。称为感受态细胞。n转化过程：转化过程：n.用冰预冷的用冰预冷的CaCl2处理细胞：即处理细胞：即用低渗用低渗CaCl2溶液在溶液在0时处理快速时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。生长的细胞，从而获得感受态细胞。n.此时细胞膨胀成球型，外源此时细胞膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗分子在此条件下易形成抗DNA酶的酶的羟基羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。钙磷酸复合物粘附于细胞表面。（二）（二）DNA进入细胞：进入细胞：n.通过热激作用促进细胞对通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。的吸收。n.然后将细胞接种于含相应抗生然后将细胞接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。态细菌将形成单菌落。n.挑选单菌落进行相应的筛选及挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。鉴定分析。（二）分子克隆的基本过程（二）分子克隆的基本过程n7.阳性重组子的筛选和鉴定阳性重组子的筛选和鉴定 n、根据遗传表型筛选、根据遗传表型筛选 n、应用限制性内切酶酶切分析筛选、应用限制性内切酶酶切分析筛选 n、核酸探针筛选、核酸探针筛选 n、PCR筛选筛选 n、菌落原位杂交技术、菌落原位杂交技术、根据遗传表型筛选、根据遗传表型筛选 n抗生素平板筛选抗生素平板筛选n 互补筛选互补筛选抗生素平板筛选抗生素平板筛选n 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗、抗四环素基因四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源等。如果外源DNA片段插入载体片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。n 但是除阳性重组子以外自身环但是除阳性重组子以外自身环化的载体、未酶解完全的载体以及化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。是阳性重组子的初步筛选。互补筛选：互补筛选：n利用利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的系列的质粒常采用质粒常采用 互补筛选。互补筛选。、应用限制性内切酶酶切分析筛选、应用限制性内切酶酶切分析筛选n 对对于于初初步步筛筛选选鉴鉴定定具具有有重重组组子子的的菌菌落落，应应小小量量培培养养后后，再再分分离离出出重重组组质质粒粒或或重重组组噬噬菌菌体体DNA，用用相相应应的的内内切切酶酶(1种种或或2种种)切切割割重重组组子子释释放放出出插插入入片片段段，对对于于可可能能存存在在双双向向插插入入的的重重组组子子还还要要内内切切酶酶消消化化鉴鉴定定插插入入方方向向，然然后后凝凝胶胶电电泳泳检检测测插入片段和载体的大小。插入片段和载体的大小。、PCR筛选：筛选：n PCR技术具有高度的灵敏度和特异技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳，可直接观增至数百万倍，通过电泳，可直接观察到产物的存在。察到产物的存在。