氨基酸发酵工艺学要点.doc

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氨基酸发酵工艺学要点
2淀粉生产的流程
原料→清理→浸泡→粗碎→胚的分离→磨碎→分离纤维→分离蛋白质→清洗→离心分离→干燥→淀粉
13在谷氨酸发酵中如何控制细胞膜渗透性。
①生物素亚适量②添加表面活性剂、 高级饱和脂肪酸或青霉素③选育温度敏感突变株、 油酸缺陷型或甘油缺陷型突变株
15谷氨酸生产菌的育种思路
( 1) .切断或减弱支路代谢( 2) 解除自身的反馈抑制(3).增加前体物的合成 (4).提高细胞膜的渗透性 (5).强化能量代谢(6).利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株
16现有谷氨酸生产菌主要有哪四个菌属。
棒状杆菌属、 短杆菌属、 小杆菌属及节杆菌属中的细菌
17谷氨酸发酵生产菌的主要生化特点。
现有谷氨酸生产菌的主要特征:( 1) 细胞形态短杆形、 棒形; ( 2) 革兰氏阳性菌, 无鞭毛, 无芽孢, 不能运动; ( 3) 需氧型微生物; ( 4) 生物素缺陷型; ( 5) 脲酶强阳性; ( 6) 不分解淀粉、 纤维素、 油脂、 酪蛋白、 明胶等; ( 7) 发酵中菌体发生明显形态变化, 同时细胞膜渗透性改变; ( 8) 二氧化碳固定反应酶系强; ( 9) 异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱, 乙醛酸循环弱; ( 10) α-酮戊二酸氧化能力微弱; ( 11) 柠檬酸合成酶、 乌头酸酶、 异柠檬酸脱氢酶、 谷氨酸脱氢酶活性强; ( 12) 具有向环境泄露谷氨酸的能力; ( 13) 不分解利用谷氨酸, 并能耐高谷氨酸, 产谷氨酸8%以上; (14)还原性辅酶II进入呼吸链能力弱( 15)
利用醋酸不能利用石蜡
22氨基酸生产菌菌种的来源有哪些。
( 1) 向菌种保藏机构索取有关的菌株, 从中筛选所需菌株。
( 2) 由自然界采集样品, 如土壤、 水、 动植物体等, 从中进行分离筛选。
( 3) 从一些发酵制品中分离目的菌株。
27谷氨酸发酵培养基包括哪些主要营养成分。
碳源 谷氨酸产生菌均不能利用淀粉, 只能利用葡萄糖、 果糖、 蔗糖、 麦芽糖。谷氨酸产量随糖浓度的增加而增加
氮源 无机氮源: (1)尿素(2) 液氨(3)氨水 有机氮源:主要是蛋白质、 胨、 氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常见玉米浆、 麸皮水解液、 豆饼水解液和糖蜜等。
无机盐 磷酸盐 硫酸镁 钾盐 微量元素
生长因子1) 生物素 (2) 维生素B1
29影响发酵产率的因素有哪些。
培养基 碳源 氮源 无机盐 生长因子
温度( 首先影响酶的活性, 其次影响生物合成的途径, 还影响发酵液的物理性质)
PH( 影响酶的活性, 影响细胞膜所带电荷, 影响培养基某些营养物质和中间代谢物的离解, 影响微生物对这些物质的利用, PH改变一起菌体代谢途径的改变使代谢产物发生变化)
供氧对谷氨酸发酵的影响(谷氨酸生成期需大量的氧)
CO2对发酵的影响( 一般控制在13%左右, CO2含量判断发酵过程是否正常( 1) 提前发现噬菌体感染 在一般规律通风下 CO2迅速下跌说明污染噬菌体, 菌体一死立即停止呼吸, 不在放CO2( 2) 帮助发现染菌感染 在正常规律通风条件下, CO2连续上升, 说明感染杂菌, 须及早采取措施)
30谷氨酸发酵过程调节pH值的方法
流加尿素、 液氨、 添加碳酸钙法。
31谷氨酸发酵不同阶段对PH的要求: 前期pH7.3、 中期pH7.2 、 后期pH7.0 放罐pH6.8
32谷氨酸发酵时,出现泡沫过多,一般是什么原因,该怎样处理?
原因P92原因 (1)水解糖质量不好(2)染菌;
处理方法(1)改进水解糖质量(2)按染菌处理
33谷氨酸发酵过程, 菌体生长缓慢或不长的原因及解决方法?
原因(1)感染噬菌体 (2)培养基贫乏(3)菌种老化 (4)前期风量过大,或初尿过多抑制生长
处理(1)按感染噬菌体处理(2)补料,并停搅拌(3)换种、 补种(4)停搅拌、 小通风
34谷氨酸发酵过程, 耗糖快,pH偏低, 产酸低原因及解决方法
原因(1) 培养基丰富,生物素过量 (2) pH低,流尿不及时(3) 通风不足,空气短路,搅拌转速低(4) 感染杂菌
处理方法(1)提高风量,提高pH(2)及时流尿,提高pH(3)提高风量,提高pH(4)按染菌处理
35谷氨酸生产菌最适生长温度为? 发酵谷氨酸最适发酵温度? 最适合生长pH为? P101 P84
谷氨酸产生菌: 最适生长温度30~34℃ 最适产酸温度35~37℃ 最是适生长PH为6.5~8.0
36发酵过程中CO2迅速下降, 说明污染噬菌体, CO2连续上升, 说明污染杂菌
37消泡方法有哪几种?
消泡的方法( 1) 物理消泡 改变温度( 2) 机械消泡: 消泡器( 3) 化学消泡 加消泡剂 天然油脂类 高碳醇脂肪酸和脂类 聚醚类
39噬菌体侵染的异常现象 P114
”二高三低”即pH高、 残糖高、 OD值低、 温度低、 谷氨酸产量低
(1)二级种子污染噬菌体
二级种子0-3h感染噬菌体, 泡沫大, pH高, 种子基本不生长; 6h以后感染噬菌体, 泡沫多, pH偏高, 种子生长较差, 轻度感染或后期感染长看不出异常变化, 可用快速检测法, 半小时之内就能确定是否污染噬菌体。8~9小时感染, OD值不长, pH上升, 泡沫增大, 耗糖慢, 不产酸等噬菌体污染现象
(2)发酵前期污染噬菌体
①吸光度开始上升后下降, 甚至4~8h内OD值下跌到零以下
②pH逐渐上升, 升到8.0以上, 不再下降, CO2迅速下降OD值下跌pH上升等
③耗糖缓慢或停止, 也有时会出现睡眠病现象, 发酵缓慢, 周期长, 提取困难
④产生大量泡沫, 发酵液黏度大, 甚至呈现黏胶状, 可拔丝, 发酵液发红, 发灰, 有刺激性气味
⑤谷氨酸产量甚少
⑥镜检时可发现菌体数量显著减少, 菌体不规则, 缺乏八字排列, 发圆
⑦平板检查有噬菌体斑, 摇瓶检查发酵液清稀,
⑧二次种子营养要求逐渐加多种龄延长
⑨送往提取车间的发酵液发红, 发灰, 有刺激性气味, 黏度大, 泡沫大
⑩精制中和时色素深, 泡沫大, 碱加不进去, 过滤困难
(3)发酵后期污染噬菌体
对产酸影响不大, 甚至有时竟有提高产酸的趋势
40染菌的分析
( 1) 从染菌时间分析:
早期: 培养基灭菌不彻底、 种子带菌等;
中后期: 设备渗漏、 空气系统。
( 2) 从染菌类型分析:
耐热的芽孢杆菌: 灭菌不彻底, 净化空气带菌, 设备渗漏;
无芽孢的球菌、 酵母等: 设备渗漏。
( 3) 从染菌幅度分析:
个别罐: 料液或设备灭菌不彻底;
大面积罐: 空气系统、 种子、 公用设备存在染菌。
41发酵染菌的预防措施。
1．空气的净化( 1) 减少滤前空气的尘粒( 2) 减少滤前空气的油水含量( 3) 保证压缩空气的温度( 4) 妥善装填过滤介质( 5) 选用高效滤材( 6) 保持一定的气流速度
2.培养基和设备的灭菌( 1) 合理调配培养基( 2) 保证灭菌温度和时间( 3) 保证设备无积污和渗漏( 4) 保证流动蒸汽质量( 5) 减少泡沫( 6) 正确进行空气保压
3.发酵设备的安装( 1) 防止轴封渗漏( 2) 合理安装罐内设备( 3) 合理安装管路( 4) 阀门的连接( 5) 管路的布置( 6) 管路的试漏( 7) 管路的吹洗
4.培养物的移接( 1) 严格进行斜面和摇瓶菌种的无菌操作( 2) 严格进行种子罐的无菌操作
42污染噬菌体后的挽救措施
( 1) 并罐法( 2) 菌种轮换或使用抗性菌株( 3) 放罐重消法( 4) 罐内灭噬菌体法
43提炼的概念P127
将谷氨酸生产菌在发酵过程中积累的L-谷氨酸从发酵液中提取出来, 再进一步中和, 除铁、 脱色、 加工精制成谷氨酸单钠盐( 俗称味精) 的过程称为谷氨酸的提炼
44生产上选择谷氨酸提取工艺的原则是: 工艺简单、 操作方便、 所用原材料价格低廉, 来源丰富、 提取收率高、 产品纯度高、 劳动强度小、 尽量不造成或减少环境污染。
45谷氨酸提取的主要方法有哪几种?
1.等电点法2.离子交换法3.金属盐法4.离子交换膜电渗析法
46谷氨酸等电点法提取最后调PH为? 3.0~3.2锌盐法提取谷氨酸最后调PH为? 一步锌盐法 2.4 等电点锌盐法2.8
47影响谷氨酸结晶的因素。
①菌体② Glu的含量③温度( 温度越低, 溶解度越小, 有利于结晶) ④加酸速度及放罐pH( 操作时一定要缓慢, 控制pH缓慢下降) ⑤起晶方式( 自然起晶和加晶种起晶) ⑥搅拌( 是液体不断翻动从而达到溶液温度和pH均匀一致) ⑦残糖( 在结晶时, 这些残唐会沉淀析出, 这不但增大谷氨酸浓度, 容易以β-型晶体析出) ⑧其它副产物⑨杂菌和噬菌体⑩糖液质量⑾发酵液放罐pH( 发酵后期pH偏碱或偏酸, 对谷氨酸结晶非常不利)
48Glu结晶有哪几种晶形, 俗称的轻质谷氨酸属于哪种晶形。
β-型晶体和α-型晶体 俗称的轻质谷氨酸属于β-型晶体 α-型晶体理想结晶 避免形成β-型晶体
50离子交换树脂与这些离子的交换能力各不相同, 这主要取决于该离子的相对浓度, 以及该离子对交换树脂的亲和力。
强酸性阳离子交换树脂对谷氨酸发酵液中各种离子亲和力大小Ca2+>Mg2+>K+>NH4+>Na+>Ala>Leu>Glu>Asp
51离子交换树脂的离交过程有五步, 非别为? P145
（1） 溶液中谷氨酸离子经过溶液向树脂表面扩散
（2） 谷氨酸离子穿过树脂表面向树脂内部扩散
（3） 谷氨酸离子与树脂上活性基团的可交换离子氢离子进行离子交换
（4） 交换下来的氢离子从树脂内部像树脂表面扩散
（5） 氢离子从树脂表面扩散到溶液中
52结柱的定义及离子交换树脂提取谷氨酸时, 产生结柱现象的原因及防止方法。
原因: ( 1) 上柱液谷氨酸含量高( 2) 洗脱剂浓度高( 3) 树脂破碎或菌体等杂质干扰
防止方法: ( 1) 调换破碎树脂( 2) 控制洗脱剂浓度( 3) 上柱完毕, 自来水反洗除菌体( 4) 结柱后, 必须彻底 处理树脂
53洗脱谷氨酸时, 能够用NaOH或NaCl作为洗脱剂, 也可混合使用。
55谷氨酸发酵废液的主要成分。P199
（1） 无机盐, 如钾离子, 铵离子镁离子, 还有残糖, 色素等
（2） 菌体, 蛋白质等固形物质悬浮物, 其中湿菌体含量为50~80/L
（3） 微量的微生物代谢副产物, 有机酸类, 有乳酸, 琥珀酸等,
（4） 残糖10g/L一下
57味精的生理作用
(1)合成其它氨基酸( 2) 作为脑组织的能源( 3) 降低血液中氨中毒( 4) 转化为糖
58谷氨酸中和时中和剂的选择与用量。
生产上要求使用含盐分少的碳酸钠或固体氢氧化钠进行中和
中和时纯碱用量: 1mol碳酸钠可中和2mol谷氨酸, 即106g碳酸钠可中和147*2=294g谷氨酸即每种中和100g谷氨酸需要36.1g碳酸钠, 才能达到谷氨酸完全中和
59谷氨酸中和液中色素的来源
淀粉制糖、 培养基灭菌、 发酵液浓缩等。
60谷氨酸中和液脱色方法有哪几种。活性炭脱色、 树脂脱色
62制取谷氨酸钠需要活性炭脱色,脱色的好坏与活性炭的再生好坏直接相关,再生时需用NaOH和HCL处理的目的是什么? 氢氧化钠解吸附在炭中的色素, 4%的氢氧化钠 盐酸解吸附在炭中的铁离子4%的盐酸P179~180
63谷氨酸中和液中铁离子的来源及存在形式。
1.铁离子的来源 原辅材料不纯、 设备腐蚀而游离出来较多的铁离子等
2.铁的存在形式 Fe2+、 Fe3+
64当前国内除铁、 锌离子的方法 .硫化钠法 .树脂除铁
65结晶的过程分三个阶段, 分别为: 形成过饱和溶液、 晶核的形成、 晶体的长大
66起晶的概念及方法。
晶核的形成叫做起晶
起晶方法 自然起晶 刺激起晶 晶种起晶
67饱和溶液、 过饱和溶液和过饱和系数概念。P185
饱和溶液:晶体的溶解和析出处于平衡状态, 溶解速度=晶析速度 晶体大小基本不变, 溶液浓度不变
过饱和溶液: 晶体从溶液中析出, 晶析速度>溶解速度, 自然形成新晶核, 而且晶粒能长大之至溶液降至饱和溶液
过饱和系数: 过饱和溶液中溶质的浓度同温度同条件下饱和溶液中溶质的浓度之比
68工业上谷氨酸溶液浓缩得方法主要有? 常压蒸发 减压蒸发
69饱和曲线和过饱和曲线将图分为三个区域, 分别为: ? 析晶操作一般要求在那个区域? P186
稳定区 ( 不饱和溶液) 亚稳定区( 饱和溶液) 不稳定区( 过饱和溶液) 析晶操作一般要求在不稳定区( )
70味精结晶的具体操作过程可分为: 浓缩、 起晶、 整晶、 育晶、 养晶等几个阶段。
71养晶的作用。( 1) 溶解伪晶( 2) 调节浓度
72味精干燥方法有: 箱式烘房、 真空箱式干燥、 气流干燥、 传送带式干燥、 震动床式干燥。
73味精溶解后浑浊的原因及解决措施
( 1) 产生原因①硫化钠过量②消泡剂过量 ③含有DL-谷氨酸钠 ④原材料质量差
( 2) 解决措施①中和、 结晶操作规范 ②控制硫化钠质量和用量③控制消泡剂用量 ④控制原材料质量
74味精带有颜色的原因及解决措施
产生原因
味精发黄 料液脱色不彻底, 带有色素; 味精分离不干, 母液带入味精, 使色素增加; 味精干燥温度过高或过长, 引起焦化变质; 洗活性炭中残留谷氨酸钠时, 将被吸附的色素解析出来; 烘盘布清洗不干净, 出现底层发黄
味精发红 母液除铁不干净; 母液接触铁器或味精将诶出铁器; 活性炭再生不完全, 铁离子没清除彻底
味精发灰发青 发灰: 活性炭带入味精中 发青: 硫化钠过量
味精久放变黄 料液除铁不彻底, 带入成品; 谷氨酸含残糖高, 带入成品
解决措施 加强脱色操作; 加强结晶操作, 合理控制参数; 加强分离操作; 采用振动式干燥器; 采用树脂除铁; 提高谷氨酸质量; 控制好硫化钠用量
75味精发臭的原因及解决措施
产生原因: 室内卫生差, 母液染菌变质, 带入味精; 活性炭渣子和洗水没及时处理, 导致杂菌繁殖; 母液存放时间长或存放母液的容器长时间没用清洗, 杂菌繁殖; 全中和操作时泡沫溢出, 回收时带入杂菌; 湿谷氨酸堆放时间长, 长菌霉变
解决措施 搞好环境卫生; 母液和湿谷氨酸及时处理; 设备及时清洗
76强力味精是哪些呈味核苷酸按不同比例与谷氨酸钠混合制成的添加了
5′-鸟苷酸、 5′-肌苷酸, 或两者的混合物
77脱敏作用定义
经特定处理后, 不丧失酶活性而失去对变构效应物的敏感性, 称脱敏作用
78酶活性的控制方法
终产物的抑制或激活; 辅酶水平的活性调节; 酶原的活化; 潜在酶的活化
79氨基酸发酵代谢控制中, 酶活性调节的类型有哪些? P226
变构效应 共价修饰寡聚酶的解聚、 蛋白质水解激活等
氨基酸生产方法
蛋白质水解、 抽提法
　　以豆粕为原料, 采用酸水解大豆蛋白的方法来获取氨基酸。如早期的味精生产方法。现在有用废蛋白质原料如动物毛发等水解法转为复合氨基酸。
化学合成法
　　该方法是20世纪50年代随着石油化工工业的发展而兴起, 是利用有机合成和化学工程相结合来生产氨基酸。当前DL－蛋氨酸、 甘氨酸、 DL－丙氨酸等就采用此方法生产。
微生物发酵法
　　是借助微生物具有自身合成所需氨基酸的能力, 经过对菌株的筛选、 诱变处理及代谢过程的调节来达到合成某种氨基酸的目的。当前60％以上的氨基酸是采用生物发酵法进行生产的, 其中产量最大的是谷氨酸, 其次是赖氨酸。
酶法
利用微生物中特定的酶作为催化剂, 由底物经过酶催化生成所需的产品。当前应用酶法生产的氨基酸有10多种, 如L－丙氨酸、 L－色氨酸、 L－丝氨酸等。
谷氨酸采用发酵法, 多以淀粉为原料, 少数用糖蜜
存在问题:
菌种性能: 中国平均产酸水平为5%－6%, 日本为10%－12%, 日本糖酸转化率在55%左右, 中国45%左右
工艺过程控制: 中国采用低糖中糖发酵工艺, 日本采用高糖发酵并实行流加糖工艺, 同时提高罐压, 保证溶氧的供给从而提高了生产率。日本普遍对温度、 压力、 空气流量、 pH、 溶解氧采用计算机控制。
消耗: 中国谷氨酸发酵粮耗平均在3t左右, 国外为2t左右。水、 电、 汽消耗也较国外高
生产规模: 日本最大单罐体积达500m3,中国仅200m3,多数厂为50m3,小的人有20m3
每立方米发酵罐年产量, 日本为20t, 中国为5－8t
污染: 国外已普遍地对味精废液进行综合利用, 中国在培养单细胞蛋白方面已取得成功, 但应用不广。
生产方法主要是发酵法和酶法。发酵法是以糖蜜、 淀粉为原料经微生物直接发酵而制得赖氨酸。酶法是以某些化工产品为原料, 经酶转化而制得赖氨酸。
赖氨酸总产量的65%、 蛋氨酸的63%和苏氨酸的55%均为亚太地区国家所消费。
谷氨酸生产菌株形态及生理共性
细胞为球形、 棒形或短杆形
革兰氏染色阳性, 无芽孢, 无鞭毛, 不能运动
都是需氧型 微生物
都是生物素缺陷型微生物
发酵中菌体发生明显的形态变化, 同时发生细胞膜渗透性的变化
国内谷氨酸生产主要菌株
天津短杆菌 (T613)及其突变株
钝齿棒杆菌(AS1.542)用其突变株
北京棒杆菌(AS1.299)及其突变株
北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征
(1) 形态特征
短杆至小棒状, 有时微弯曲, 两端钝圆, 不分枝, 呈多种形态。
单个、 成对及”V”字形排列。
G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征
(1) 形态特征
短杆至棒状, 有时微弯曲, 两端钝圆, 不分枝。
单个、 成对及”V”字形排列。
折断分裂。
G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
天津短杆菌(T613)的形态和生理特征
(1) 形态特征
典型的短杆状, 有时微弯曲, 两端稍钝圆, 不分枝。
单个、 成对及”V”字形排列。
折断分裂。
G+。不运动。无芽孢。
北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆菌(B9)的比较

天津短杆菌(T613)与钝齿杆菌(B9)的比较

当前味精行业采用的主要菌株
钝齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866是中国味精行业生产上的重要菌种。
二者融合子F263.
谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化
细胞壁 à 细胞形态 + 生物素 à 细胞壁
选育细胞膜渗透性好的突变株
抗VP类衍生物
选育对溶菌酶敏感突变株
选育二氨基庚二酸缺陷突变株
选育温度敏感突变株
生物素: 是脂肪合成中关键酶—乙酰CoA羧化酶的辅助因子, 生物素限量时, 就会抑制脂肪酸的合成, 从而导致膜结构的不完整。青霉素
诱变育种的基本过程:
选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验
出发菌株:
(1)要有一定的目标产物的生产能力
(2)对诱变剂敏感
(3)生产性能好, 如生长快、 营养要求低、 产孢子多且早, 最好是生产上自然选育的菌株。
生物素减少1à草酰乙酸减少à乙酸减少à关闭DCA 2à琥珀酸氧化酶的能力低à 积累琥珀酸, 阻遏异柠檬酸裂解酶, 关闭DCA环。
黄色短杆菌中:
进入分解途径的情况: 1 PEP浓度低( 减弱亲和力) ; 2 TCA中间产物浓度高( 反馈抑制, 防止草酰乙酸过剩。
固定CO2的情况: 1 乙酰CoA浓度增加, 与F16P共同激活PEP羧化酶; 2 乙酰CoA氧化, 产生的ATP抑制丙酮酸激酶。
氨的导入1α-酮戊二酸还原氨基化 2冬氨酸或丙氨酸经过氨基转移作用将氨基转给α-酮戊二酸 3谷氨酸合成酶途径: 谷氨酸合成酶对NH4+亲和力更强, 不受谷氨酸反馈抑制, 当NH4+浓度低时循此途径。
1选育强化CO2固定反应的突变株 选育在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长快、 大的菌株 选育对氟丙酮酸敏感突变株 选育丙酮酸缺陷、 天冬氨酸缺陷突变株4强化丙酮酸羧化酶基因
2选育减弱乙醛酸循环的突变株
选育对琥珀酸敏感突变株
选育不利用乙酸的突变株
经过基因工程技术使异柠檬酸裂解酶活力降低
3选育强化TCA中柠檬酸至α-酮戊二酸代谢的突变株
选育柠檬酸合成酶强的突变株
选育抗氟乙酸、 氟化钠、 氮丝氨酸和氟柠檬酸的突变株
4选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株
选育抗酮基丙二酸抗性突变株
选育耐高谷氨酸的突变株
选育抗谷氨酸结构类似物突变株
选育抗谷氨酰胺突变株
5选育强化能量代谢的突变株
选育抗呼吸抑制剂的突变株
选育抗ADP磷酸化抑制剂突变株
选育抗抑制能量代谢的抗生素突变株
6选育减弱HMP后段酶活的突变株
选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株
选育抗嘌呤、 嘧啶类似物的突变株
选育抗核苷酸类抗生素突变株
谷氨酸菌种的扩大培养
斜面菌种
斜面培养基必须有利于菌种生长而不产酸, 要求斜面菌种绝对纯, 培养条件有利于菌种繁殖, 培养基以多含有机氮不含或少含糖为原则。
斜面菌种不宜多次移接, 一般只移接三次。经常进行菌种分离纯化, 提供新的菌株供生产使用。
一级种子培养
一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体, 培养基组成应少含糖分, 多含有机氮。培养条件有利于长菌。
二级种子培养
影响种子质量的主要因素
培养基组成
培养基的营养易于被菌体直接吸收和利用, 营养成分要适当地丰富和完全, 氮源和维生素含量较高, 碳源含量少, 能够使菌丝粗壮并具有较强的活力。另一方面, 种子培养基应尽可能与发酵培养基接近, 以适合发酵的需要。
温度 pH 溶解氧浓度 前期需氧量少, 后期需氧量多 接种量 种龄
谷氨酸代谢途径
菌体代谢调节异常化
在累积谷氨酸时需限制培养基中生物素的添加量
菌体形态有显著差异
生产发酵条件控制是关键
在最适条件下, 谷氨酸产生菌可把60%以上的葡萄糖转化为谷氨酸, 而只有极少量副产物。
培养条件不适宜, 得大量菌体或转换为乳酸、 琥珀酸、 α－酮戊二酸等。
发酵培养基对谷氨酸发酵的影响
斜面菌种的培养
目的: 纯菌生长繁殖
措施: 多含有机氮, 不含或少含糖
一级种子培养
目的: 大量繁殖活力强的菌体
措施: 少含糖分, 多含有机氮, 培养条件有利于长菌。
二级种子培养
目的: 获得发酵所需的足够数量的菌体
为发酵培养基的配制原则
供给菌体生长繁殖和谷氨酸生产所需要的适量的营养和能源
原料来源丰富, 价格便宜, 发酵周期短, 对产物提取无妨碍等
碳 源
当前采用的谷氨酸产生菌均不能利用淀粉, 只能利用葡萄糖、 果糖、 蔗糖和麦芽糖等, 有些能利用醋酸、 乙醇、 正烷烃。
常采用淀粉水解糖, 要求淀粉水解完全, 但要避免水解时间过长。不同淀粉原料中生物素含量不同, 会影响生物素含量。
糖浓度对发酵的影响
一定范围内glu产量随糖浓度增大而增大
糖浓度过高时, 渗透压增大, 对菌体生长和发酵不利, 当工艺配合不当时, 转化率低
糖浓度过高时, 氧溶解阻力大, 影响供氧效率。
发酵糖浓度选择
一般控制在125－150g/L, 产酸55－70g/L
采用一次高糖发酵工艺( 糖浓度170－190g/L) , 产酸可达80g/L。由于渗透压大, 影响菌体生长, 使发酵周期长, 产酸不易稳定。
流加低浓度糖发酵工艺
氮源是合成菌体蛋白质、 核酸和生成谷氨酸的氮来源, 在发酵过程中一部分氨用于调节pH值, 形成谷氨酸铵盐。
谷氨酸发酵氮源( 碳氮比为100: 15－30) 比其它发酵工业( 碳氮比为100: 0.2－2.0) 高。
当碳氮比在100: 11以上才开始累积谷氨酸, 在谷氨酸发酵中, 用于合成菌体的氮　仅占总耗用氮的3－8%, 而30－80%用于合成从谷氨酸。
在实际生产中用尿素或氨水作氮源时, 由于一部分氨用于调pH,一些分解而逸出, 使实际用量增大, 培养基中糖浓度的140g/L,总尿用量为38.5g/L, 碳氮比为100: 32.8。
不同发酵阶段对氮源的要求
在长菌阶段, NH4＋过量会抑制菌体生长。
在产酸阶段, NH4＋不足会积累α－酮戊二酸。
氮源种类及添加方式
氮源分类
有机氮( 蛋白质、 胨、 氨基酸等, 谷氨酸发酵的有机氮源常见玉米浆、 麸皮水解液、 米糠水解液、 豆饼水解液和糖蜜等)
无机氮( 尿素、 液氨、 氨水、 碳酸氢铵、 硫酸铵、 氯化铵和硝酸铵等)
菌体利用无机氮比有机氮快速, 铵盐、 尿素、 氨水等比硝基氮优越, 因为硝基氮需先经过还原才能被利用。
添加方式:
铵盐、 液氨等可采取流加方法, 液氨作用快, 采取连续流加, 尿素少量多次分批流加。
用硫酸铵等生理酸性盐为氮源时, 由于铵离子被利用而残留SO42-等酸根, 使PH下降, 需在培养基中加入碳酸钙以自动中和pH。但添加碳酸钙易形成污染, 生产上一般不用此法。
无机盐
功能
构成菌体成分、 酶的组成成分、 酶的激活剂或抑制剂、 调节培养基渗透压、 调节pH和氧化还原电位等。
微生物对无机盐的需要量很少, 但无机盐对菌体生长和代谢产物的生成影响很大
微生物所需要的无机盐
硫酸盐、 磷酸盐、 氯化物和含钾、 钠、 镁、 铁的化合物
微量元素: 如铜、 锰、 锌、 钴、 钼、 碘、 溴等
1. 磷酸盐
功能
蛋白质和核酸的组成成分, ATP、 ADP是重要的能量传递者, 参与一系列代谢反应
缓冲作用
需要量: 0.005－0.01mol/L.需三水磷酸氢二钾1-1.5g/L,十二水磷酸氢二钠1.7-2.0g/L
来源:
磷酸盐。
玉米浆、 糖蜜、 淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。
磷量对谷氨酸发酵影响: 磷浓度过高时, 菌体的代谢转向合成缬氨酸, 磷含量过低时, 菌体生长不好。
2. 硫酸镁
功能
叶绿素的组成成分。
镁离子是许多重要的酶( 如己糖磷酸化酶、 异柠檬酸脱氢酶、 羧化酶等) 的激活剂。如果镁离子太少会基质的氧化速度降低, 谷氨酸生成量降低。
G+对镁离子最低要求量是25ppm。G-为4－5ppm, 添加七水硫酸镁0.25-1g/L时, 镁离子浓度为25-90mg/Kg
硫是含硫氨基酸的组成成分, 构成酶的活性基团。培养基中的硫酸镁供应的硫已充分, 不需另加。
3. 钾盐
许多酶的激活剂,钾盐少长菌体, 钾盐足够产谷氨酸。
谷氨酸发酵产物生成期需要的钾盐比菌体生长期高。
菌体生长期需硫酸钾量约为0.1g/L,谷氨酸生成期需硫酸钾量为0.2－1.0g/L.
微量元素
微量元素是指微生物需要量十分微小, 但又不可完全没有的元素
锰是某些酶的激活剂, 羧化反应必须锰, 如谷氨酸生物合成途径中, 草酰琥珀酸脱羧生成α-酮戊二酸是在锰存在下完成的。
铁是细胞色素氧化酶、 过氧化氢酶的成分, 还是另外一些酶的激活剂。
汞、 铜离子具有明显毒性, 抑制菌体生长和谷氨酸生成, 因此必须避免有害离子的污染。
温度对谷氨酸发酵的影响
酶活
改变生物合成途径, 使代谢产物发生变化
改变发酵液物理性质
影响菌种对营养物的分解与吸收
不同微生物的最适生长温度不同
同一种微生物, 菌体生长和产物合成的最适温度不一定相同
pH对谷氨酸发酵的影响
酶的活性
影响微生物细胞膜所带电荷, 改变细胞膜的渗透性
影响物质分解速率, 影响微生物对培养基物质的吸收利用
改变菌体代谢途径, 使代谢产物发生变化。
例如 中性和微碱条件下积累谷氨酸, 在酸性条件下形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。
谷氨酸发酵pH的控制
菌种( 一般pH6.5-8.0)
黄色短杆菌672为PH7.0-7.5
AS1.299为pH6.0-7.5
T6-13为PH7.0-8.0。
发酵阶段
前期7.3左右
偏低, 菌体生长旺盛, 消耗营养物质快, 菌体正常代谢, 繁殖菌体而不产谷氨酸。
过高, 抑制菌体生长, 糖代谢缓慢, 发酵时间延长。
中期pH7.2左右, 发酵后期pH7.0, 在将近放罐时, 为了后工序提取谷氨酸, pH6.5-6.8为好。
发酵过程pH值调节方法
添加碳酸钙法 (适用于采用酸性铵盐作为氮源的工艺)
尿素流加法(小试或中试)
优点:尿素的分解、 利用及pH值的变化具有一定规律性, 易控制。
依据
时期
外观表现
菌种
避免波动, 力求稳定。
液氨或氨水添加法(主流)
作用快而明显
易于实现连续自动流加。
供氧对谷氨酸发酵的影响
临界溶解氧浓度
好气微生物对培养液中溶解氧浓度的最低要求, 在某一浓度以下, 微生物的呼吸速率随溶解氧降低而显著下降, 此溶解氧浓度称为临界溶解氧浓度。
在临界氧浓度以下, 氧成为微生物的限制性基质, 微生物的耗氧速率符合Michaelis-Menfen方程。
从微生物生理学考察发酵供氧问题
氨基酸代谢氧的重要性:
经过好气性能量代谢产生菌体生长和氨基酸生物合成的所需的ATP
氨基酸生物合成过程中产生的还原性辅酶需氧来氧化。
各种氨基酸生物合成时需要的ATP与产生的还原性辅酶的量不同, 以此数据为基准, 推断氨基酸发酵通风量很有意义。
v 不同的代谢途径产生不同数量的NAD(P)H, 再氧化所需要的溶氧量不同。供氧大小是与产物的生物合成途径有关。
第一类包括谷氨酸、 谷氨酰胺、 精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸, 它们在菌体呼吸充分的条件下, 产量才最大, 如果供氧不足, 氨基酸合成就会受到强烈的抑制, 大量积累乳酸和琥珀酸。这类氨基酸经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成的, 产生的NADH量最多。
第二类包括异亮氨酸、 赖氨酸、 苏氨酸和天冬氨酸等天冬氨酸系氨基酸, 供氧充分可得最高产量, 但供氧受限, 产量受影响并不明显; 其合成途径是产生NADH的乙醛酸循环或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统, 产生的NADH量不多, 因而与供氧量关系不明显。
第三类有亮氨酸、 缬氨酸和苯丙氨酸 , 不经过TCA循环, NADH产量很少, 过量供氧, 反而起到抑制作用。肌苷发酵也有类似的结果。
不同发酵阶段的供氧需求P96
在菌体生长期, 供氧不足时, 菌体生长受到抑制, 积累乳酸, 菌体收率少; 但过高氧水平会造成浪费, 抑制菌体生长, 在高氧水平下生长的菌体不能有效地合成谷氨酸。
谷氨酸生成期, 在细胞最大呼吸速率时, 谷氨酸产酸量最大。因此, 在谷氨酸生成期要求充分供氧, 以满足最大呼吸的需氧量。
供氧与其它发酵工艺条件的关系
培养基营养丰富, 糖浓度高, 生物素含量高, 需氧量大。
培养基浓度大, 氧的传递阻力大, 需要增加供氧。
生物素浓度浓度增加, 耗糖速度增大, 需要增加供氧。
采用间断或连续测定排气中CO2浓度的方法调节通气量, 满足供氧需求。以13%为分界点。有利于发现噬菌体感染 发现杂菌污染
利用溶氧变化自动控制补糖速率, 间接控制供氧速率和pH值, 实现菌体生长、 溶氧和pH值三位一体的控制体系。
除控制补料速度外, 在工业上, 还可采用调节温度(降低培养温度可提高溶氧浓度)、 液化培养基、 中间补水、 添加表面活性剂等工艺措施, 来改进溶氧水平。
泡沫对发酵的影响
泡沫过多会引起大量逃出发酵液而造成浪费和污染
泡沫上升到罐顶时, 可能从轴封渗漏, 造成浪费和污染
泡沫过多就会降低发酵罐的装填系数, 降低设备利用率
泡沫过多影响通气搅拌效果
当泡沫稳定时, 代谢气体不能及时排出, 影响菌体的正常呼吸作用, 甚至使菌体自溶
形成: 气液两相共存(泡沫的分散相是空气和二氧化碳, 连续相是发酵液), 有能降低液体表面张力的物质存在。具体包括:
物质条件: 蛋白, 黏度增大可使之更稳定。
操作: 通气、 搅拌
泡沫的稳定性取决于
液体表面张力, 粘度。
泡沫表面积、 温度、 pH、 溶液浓度。
分类
表面泡沫
内部泡沫: 出现在粘稠的发酵液中, 当谷氨酸发酵感染杂菌和噬菌体等不正常发酵时就形成这种泡沫。
泡沫的消除方法
物理方法(经过改变温度使泡沫破裂)
机械消泡: 耗式消泡器, 离心式、 刮板式、 蝶片式
优点: 不城在发酵液中加其它物质
缺点: 不能从根本上消除引起泡沫稳定的原因, 消泡效果不如这消泡剂迅速可靠, 需一定的设备和消耗动力。
化学消泡:
优点: 消泡效果好, 作用快
缺 点: 需消泡剂 , 存在影响菌体生长或代谢产物积累的可能, 增加了染菌机会, 影响氧的传递。
消泡剂消泡的机理
破泡: 降低表面张力
抑泡: 抑泡剂分子优先被吸附, 除去发泡剂的吸附层, 使表面粘度局部地方显著降低。
选用原则:
消泡剂必须是表面活性剂, 具有较低的表面张力
消泡剂对气-液界面的铺展系数必须足够大, 具有一定亲水性
在水中的溶解度极小, 保持持久的消泡或抑泡作用
无毒
不干扰溶解氧、 pH等测定仪表使用, 不影响氧的传递
具有良好的热稳定性
来源方便, 价格便宜
常见的消泡剂
天然油脂(消泡活性差、 用量多, 一般为发酵液的0.1-0.2%).
种类: 花生油最好, 米糠油最差
新鲜程度: 油脂新鲜, 所含天然抗氧化剂多, 过氧化物少, 酸价低, 消泡能力强。
生物素含量
聚醚类
醇类(十八醇)
硅酮类
谷氨酸发酵过程中主要变化及中间代谢控制方法
以糖蜜为原料发酵生产谷氨酸, 可省去淀粉水解工艺, 降低成本, 节约能源,常采用大种量( 10%左右) 、 添加青霉素或表面活性剂, 低糖流加发酵, 有利于产酸和转化率的提高。
甜菜糖蜜添加吐温发酵工艺
工艺特点: 高生物素、 大接种量、 添加表面活性剂(吐温-60), 产谷氨酸高、 转化率高。
基本原理
发酵期间, 向发酵培养基中添加吐温-60, 高级饱和脂肪酸(C16-18)及其亲水醇酯类, 对脂肪酸的合成有拮抗作用, 控制磷脂合成, 形成不完全的细胞膜, 谷氨酸向膜外泄漏能力增强。
在生产过程中, 必须控制好添加吐温-60、 饱和脂肪酸等拮抗物质的时间与浓度, 一般在发酵阶段的对数生长期的早期(4-5h)添加。
发酵工艺控制要点
添加吐温-60的时间与添加量: 4.5h,添加0.2%
接种量:
接种量少, 菌体增殖缓慢, 吐温添加时间延长, 发酵周期长;
接种量过多, 菌体繁殖迅速, 营养消耗快, 产酸期缩短, 后期产酸速度不高。4%-5%
pH的控制: 整个发酵过程中pH不低于6.4,控制在6.5以上。若低于6.4产酸率、 产酸速率明显下降; 发酵后期, pH若高于7.0, OD值下降, 菌体发生自溶。
温度控制: WTH-1发酵过程中温度控制条件为: 0-12h, 30-33℃; 12-24h, 33-34℃; 24-36h, 34-35℃。发酵前期温度必须稳定, 否则菌体生长受影响。
风量控制: 采用梯形通风控制, 分3级或4级提风, 达最高风量后维持10h, 再分3级4级降风。生产过程中, 根据生产菌在发酵过程中的代谢特点及其变化, 由排气中CO2含量, 反馈控制通气强度, 实现排气中CO2含量恒定(13%左右)。
放罐处理: 添加吐温60发酵生产谷氨酸, 细胞有较好的渗透性, 残糖降至1.3%-1.4%时, 采用适当工艺条件,