仪器分析紫外—可见分光光度法.pptx

仪仪 器器 分分 析析学学 习习 内内 容容（第（第 69 周）周）紫外紫外-可见分光光度法（第可见分光光度法（第3 3章）章）分子发光分析法（第分子发光分析法（第5 5章）章）红外光谱法（第红外光谱法（第4 4章）章）分子分子?光谱光谱第第3 3章章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法ultraviolet and visible spectrophotometry（UV-Vis）3.1 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱3.2 光的吸收定律光的吸收定律3.3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计3.4 分析条件的选择分析条件的选择3.5 紫外紫外-可见吸收光谱法的应用可见吸收光谱法的应用基本概念基本概念spectrum：复色光被色散系统分光后按照波长或复色光被色散系统分光后按照波长或频率的大小依次排列的图像。频率的大小依次排列的图像。spectrumspectroscopic analysis：利用利用物质的光谱物质的光谱进行定性、定量和结构进行定性、定量和结构分析的方法。分析的方法。(是以光与物质的是以光与物质的相互作用相互作用为基础建立起来的仪器分析方法。为基础建立起来的仪器分析方法。)基本概念基本概念 250 500 基本概念基本概念 UV-Vis：利用某些物质利用某些物质分子分子对对200200800nm800nm 光谱区域内辐射能的光谱区域内辐射能的吸收吸收来研究物来研究物 质的质的性质性质、结构结构和和含量含量的方法。的方法。UV-VisUV-Vis主要反映共轭体系和芳香族化合物的结构特征。主要反映共轭体系和芳香族化合物的结构特征。3.1 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱(基本原理基本原理)500 250邻甲苯胺紫外邻甲苯胺紫外-可见吸收光谱图可见吸收光谱图3.1 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱光的基本性质；光的基本性质；物质对光的选择性吸收；物质对光的选择性吸收；分子吸收光谱的形成；有机化合物的分子吸收光谱的形成；有机化合物的紫外紫外-可见光谱；无机化合物的紫外可见光谱；无机化合物的紫外-可见光谱；可见光谱；紫外紫外-可见光谱中的常用术语；可见光谱中的常用术语；影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素 光的基本性质光的基本性质光是一种电磁波，具有波光是一种电磁波，具有波 粒二象性。粒二象性。E h c/波长越长，光量子能量越小，反之能量越大。波长越长，光量子能量越小，反之能量越大。E=hc/举例：举例：白光白光硫酸铜溶液硫酸铜溶液？色的光被吸收？色的光被吸收呈呈蓝色蓝色互补色光：如果两种颜色的光按一定比例混合后互补色光：如果两种颜色的光按一定比例混合后 可成为白色光，这两种光称互补色光。可成为白色光，这两种光称互补色光。（黄色）（黄色）物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 /nm 颜色颜色 互补光互补光 400-450紫紫黄绿黄绿 450-480蓝蓝黄黄 480-490绿蓝绿蓝橙橙 490-500蓝绿蓝绿红红 500-560绿绿红紫红紫 560-580黄绿黄绿紫紫 580-610黄黄蓝蓝 610-650橙橙绿蓝绿蓝 650-760红红蓝绿蓝绿物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收l是物质与是物质与辐射能辐射能相互作用的一种形式。相互作用的一种形式。l只有当入射光的能量（只有当入射光的能量（E）与吸光物质）与吸光物质分子从分子从基态基态跃迁到某一跃迁到某一激发态激发态所需能量所需能量（E）相等相等时才会被吸收。时才会被吸收。激发态激发态 E1 E=E 基基 态态 E0跃迁几率越大，物质的跃迁几率越大，物质的摩尔吸光系数摩尔吸光系数越大。越大。3.1.1 紫外紫外-可见分子吸收光谱的形成可见分子吸收光谱的形成 UV-Vis 是分子吸收光谱，它的产生可以是分子吸收光谱，它的产生可以 看做是看做是分子对紫外分子对紫外-可见光光子选择性可见光光子选择性俘获俘获 的过程，的过程，本质上是分子内价电子跃迁的结果。本质上是分子内价电子跃迁的结果。分子的分子的价电子价电子在吸收电磁辐射并跃迁到高能在吸收电磁辐射并跃迁到高能级后所产生的吸收光谱，通常被称为级后所产生的吸收光谱，通常被称为电子光谱电子光谱，由于其波长范围是在光谱的由于其波长范围是在光谱的紫外和紫外和可见区可见区，所以，所以电子光谱又叫电子光谱又叫紫外紫外/可见光谱可见光谱。紫外可见光谱的产生紫外可见光谱的产生3.1.1 紫外紫外-可见分子吸收光谱的形成可见分子吸收光谱的形成 分子内部运动分子内部运动价电子运动价电子运动 Ee核的振动核的振动 Ev分子绕其重心的转动分子绕其重心的转动 Er E=Ee+Ev+Er Ee Ev Er带状光谱带状光谱线光谱线光谱化合物的紫外化合物的紫外-可见光谱决定于分子的可见光谱决定于分子的结构结构和和分子轨道上分子轨道上电子电子的性质。的性质。300400500600700/nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350化合物分子的特征吸收波长（化合物分子的特征吸收波长（maxmax）决定于）决定于分子的分子的激发态激发态与与基态基态之间的能量差。之间的能量差。3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 O：n C H H H H *n 与紫外与紫外-可见吸收光谱产生有关的电子：可见吸收光谱产生有关的电子：有机化合物分子内电子跃迁类型有机化合物分子内电子跃迁类型 *n *n *分子的分子的电子能级电子能级跃跃迁迁*n E3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱（1）*跃迁：发生在远紫外区，实际应用跃迁：发生在远紫外区，实际应用价值不大。价值不大。例：甲烷例：甲烷max125nm.（2）n n *跃迁：含有未共享电子对的取代基跃迁：含有未共享电子对的取代基 都可能发生这一跃迁，所需能量取决于都可能发生这一跃迁，所需能量取决于n 电子所电子所属原子的性质。属原子的性质。例：碘甲烷例：碘甲烷max259nm.1.饱和有机化合物饱和有机化合物3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 *跃迁可发生在任何具有跃迁可发生在任何具有不饱和键不饱和键的的 有机化合物分子中。有机化合物分子中。特征是特征是较大，较大，为强吸收（为强吸收（K K带，共轭作用得名带，共轭作用得名）。）。n *跃迁发生在含有跃迁发生在含有杂原子双键杂原子双键的不饱的不饱 和有机化合物中，和有机化合物中，吸收强度弱（吸收强度弱（R R 带，杂原子不饱和基团得名带，杂原子不饱和基团得名）。）。2.不饱和脂肪族化合物不饱和脂肪族化合物3.1.2 有机化合物的紫外有机化合物的紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱3.芳香族化合物芳香族化合物E1和和E2是由苯环中的是由苯环中的 *跃迁产生，跃迁产生，B带由苯得名，是芳香带由苯得名，是芳香族化合物特征吸收带。族化合物特征吸收带。3.1.3 无机化合物的紫外无机化合物的紫外-可见光谱可见光谱1.电荷转移光谱电荷转移光谱 电荷转移光谱电荷转移光谱：某些无机配合物和有机物可产：某些无机配合物和有机物可产 生此类光谱生此类光谱,实质是分子内氧化还原过程；实质是分子内氧化还原过程；其特点是摩尔吸光系数大其特点是摩尔吸光系数大(104)，用于定量分用于定量分 析可获得较高的检测灵敏度。析可获得较高的检测灵敏度。3.1.3 无机化合物的紫外无机化合物的紫外-可见光谱可见光谱 2.配位体场吸收光谱配位体场吸收光谱 102,位于可见光区，较少用于定量分析，位于可见光区，较少用于定量分析，可用于研究配合物的结构及无机配合物可用于研究配合物的结构及无机配合物键合理论。键合理论。3.1.4 紫外紫外-可见光谱中的常用术语（可见光谱中的常用术语（P P2525自学）自学）吸收峰吸收峰谷谷肩峰肩峰末端吸收末端吸收吸收峰吸收峰 是指分子中产生吸收带的主要官能团；吸收带是指分子中产生吸收带的主要官能团；吸收带的的max210nm,属于属于*、n*等跃迁类型。等跃迁类型。生色团为不饱和基团：生色团为不饱和基团：C=CC=C、N=N-N=N-、C=OC=O、C=SC=S、-NO-NO2 2等；生色团吸收带的位置受相邻取代基或溶剂等；生色团吸收带的位置受相邻取代基或溶剂效应的影响，吸收峰向长波或短波移动。效应的影响，吸收峰向长波或短波移动。生色团生色团(chromophore)助色团助色团(auxochrome)是指分子中一些带有非成键电子的是指分子中一些带有非成键电子的杂原子饱杂原子饱和基团和基团,本身在紫外本身在紫外-可见光区不产生吸收，但是可见光区不产生吸收，但是当它与生色团连接后，使生色团的吸收带向长波当它与生色团连接后，使生色团的吸收带向长波移动，且吸收强度增强。移动，且吸收强度增强。-OH-OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-SH-SH、-Cl-Cl、-Br-Br、-I-I 等等 溶剂效应溶剂效应体系体系pHpH的影响的影响 3.1.5 影响紫外影响紫外-可见光谱的因素可见光谱的因素共轭效应共轭效应立体化学效应立体化学效应分子结构分子结构分析条件分析条件核心是对分子核心是对分子中电子共轭结中电子共轭结构的影响构的影响UV-Vis主要反映共轭体系和主要反映共轭体系和芳香族化合物的结构特征芳香族化合物的结构特征3.1.5 影响紫外影响紫外-可见光谱的因素可见光谱的因素1.共轭效应：共轭的共轭效应：共轭的电子在整个共轭体电子在整个共轭体系内流动，属于系内流动，属于共轭基共轭基链上全部原子所链上全部原子所有，所以它们受到的束缚力较小，只要有，所以它们受到的束缚力较小，只要受到能量较低的辐射即可被激发。受到能量较低的辐射即可被激发。共轭体系越长，最大吸收波长越向长波方向移共轭体系越长，最大吸收波长越向长波方向移动，吸收强度也增强。动，吸收强度也增强。3.1.5 影响紫外影响紫外-可见光谱的因素可见光谱的因素2.立体化学效应立体化学效应空间位阻空间位阻跨环效应跨环效应3.1.5 影响紫外影响紫外-可见光谱的因素可见光谱的因素物质以气态存在时的吸物质以气态存在时的吸收光谱收光谱 精细结构；精细结构；物质在极性溶剂中的吸物质在极性溶剂中的吸收光谱收光谱 溶剂化。溶剂化。3.溶剂效应溶剂效应溶剂对吸收峰的位置、强度及光谱形状均有影响溶剂对吸收峰的位置、强度及光谱形状均有影响溶剂效应溶剂效应 （1 1）溶剂极性对）溶剂极性对 *跃迁的影响跃迁的影响 *能能 量量E非非 E极极水水 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙酮丙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 二氯甲烷二氯甲烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 己烷己烷 石油醚石油醚溶剂效应溶剂效应 （2）溶剂极性对溶剂极性对 n *跃迁的影响跃迁的影响能能 量量*n E非非*nE极极（a a）苯酚的）苯酚的UVUV光谱图光谱图 （b b）苯胺的）苯胺的UVUV光谱图光谱图 4.体系体系 pH pH 值对吸收带的影响值对吸收带的影响小小 结：结：UV-Vis涉及分子外层电子的能级跃迁；光涉及分子外层电子的能级跃迁；光 谱区域在谱区域在 200800nm；有机、无机化合物紫外有机、无机化合物紫外-可见光区电子跃迁可见光区电子跃迁 的类型；的类型；影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素。可见吸收光谱的因素。UV-Vis法是分子光谱分析法，利用的是法是分子光谱分析法，利用的是 分子对外来辐射的吸收特性；分子对外来辐射的吸收特性；课后练习课后练习1.1.何为何为生色团生色团、助色团？、助色团？2.2.紫外吸收光谱法中，极性溶剂为什么会使紫外吸收光谱法中，极性溶剂为什么会使 *跃迁的吸收峰长移，却使跃迁的吸收峰长移，却使 *跃迁的吸收峰短移？跃迁的吸收峰短移？3.3.课后题课后题1 1、2 2（P50P50）本节参考书本节参考书 1.分析化学分析化学，人民卫生出版社，参考，人民卫生出版社，参考“紫外紫外-可见分光光度法的基本原理和概念可见分光光度法的基本原理和概念”的相关内容。的相关内容。2.仪器分析，复旦大学出版社，参考第二章仪器分析，复旦大学出版社，参考第二章 “紫外紫外-可见吸收光谱法可见吸收光谱法”的相关内容的相关内容。3.无机化学，高等教育出版社，参考无机化学，高等教育出版社，参考“化学化学键与分子结构键与分子结构”的内容。的内容。复复 习习紫外紫外-可见吸收光谱的形成；可见吸收光谱的形成；有机物、无机物的紫外有机物、无机物的紫外-可见吸收光谱；可见吸收光谱；影响紫外影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素本次课内容本次课内容3.2 Lambert-Beers Law3.3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计3.2 Lambert-Beers Law （分光光度法定量分析的基础）（分光光度法定量分析的基础）选定波长的入射光选定波长的入射光待测溶液待测溶液 A？c被被测测组组分分的的含含量量透射光透射光T3.2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers Law IrI0ItIa I0=Ia+It+Ir (1)3.2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers Law I0=Ia+It+Ir （1）I0=Ia+It （2）T=It/I0 （3）A=-lgT （4）如果在多组分溶液中，各组分间不存在相互作用，测得如果在多组分溶液中，各组分间不存在相互作用，测得的吸光度具有加和性。这一性质是分光光度法测定混合组分的吸光度具有加和性。这一性质是分光光度法测定混合组分的依据。的依据。3.2.1 3.2.2 T,A,Lambert-Beers LawLambert 定律描述了定律描述了A与与 l 的关系的关系 A=klBeer定律描述了定律描述了A与与 c 的关系的关系 A=kc 实验证明，溶液对光的吸收程度实验证明，溶液对光的吸收程度(A A)与与c、l、有关。有关。Lambert-Beers Law 当入射光当入射光波长波长一定时，溶液对光的一定时，溶液对光的吸收吸收程度程度只与只与溶液浓度溶液浓度和和液层厚度液层厚度有关。有关。A=k c l=-lgT=lgI0/It (5)(5)上式说明上式说明T与与c,l 之间是指数函数的关系，当之间是指数函数的关系，当c增加一倍时，增加一倍时，T降至降至T2；而；而A与与c,l 之间是简单的之间是简单的正比关系。正比关系。3.2.3 吸光系数吸光系数-kn摩尔吸光系数摩尔吸光系数n吸光系数吸光系数n百分吸光系数百分吸光系数K值物理意义：数值上等于吸光物质在单位浓值物理意义：数值上等于吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度值。度和单位厚度时的吸光度值。在给定在给定波长、溶剂和温度波长、溶剂和温度等条件下，等条件下，K是物是物质特征常数，表明物质对某一特定波长光的吸质特征常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。收能力。12摩尔吸光系数（摩尔吸光系数（）当当 l 以以 cm 表示，表示，c 以以 mol/L 表示表示时，时，k 值称为摩尔吸光系数，用值称为摩尔吸光系数，用表表示。单位是示。单位是 Lmol-1cm-1。A=l c摩尔吸光系数与灵敏度摩尔吸光系数与灵敏度是吸光物质分子的一个是吸光物质分子的一个特征常数特征常数，可作为估可作为估量定量分析方法灵敏度的指标。量定量分析方法灵敏度的指标。越大，改变越大，改变浓度而引起的吸光度的改变就越显著，测定的浓度而引起的吸光度的改变就越显著，测定的灵敏度也就越高。灵敏度也就越高。提高摩尔吸光系数的方法提高摩尔吸光系数的方法分子结构分子结构测量条件测量条件吸光系数（吸光系数（a）当当 c 以以 g/L 表示时，表示时，k 值称吸光系数，单值称吸光系数，单位是：位是：Lg-1cm 1 。A=a l c A1cm1%(百分吸光系数百分吸光系数)一种吸光物质的百分浓度为一种吸光物质的百分浓度为1%（g/100ml）的溶液的溶液在在 1cm 吸收池中的吸光度。吸收池中的吸光度。A=a1cm 1%l ca1cm 1%=10 a=10/M （6）例例 题题用紫外用紫外-可见分光光度法测定可见分光光度法测定Fe ，有下述两种，有下述两种方法。方法。A法：法：a=1.97 X 10 2 Lg-1c-1;B法法:=4.10 X 103 Lmolc-1.问：何种方法灵敏度高？问：何种方法灵敏度高？3.2.4 偏离偏离 Lambert-Beer Law 的因素的因素偏离偏离Lambert-Beer Law 的因素主要与的因素主要与样品样品（化学因素）（化学因素）和和仪器（光学因素）仪器（光学因素）有关。有关。A=k c l1.1.与测定样品溶液有关的因素与测定样品溶液有关的因素A=klc当c不变时不变时 A与与l之间的线性关之间的线性关系普遍存在系普遍存在A=klc当l不变时不变时c 0.01M 时时,A与与c的的线性关系会发生偏差。线性关系会发生偏差。吸收定律是一个有限的定律吸收定律是一个有限的定律(1)浓度浓度为什么在为什么在 c 0.01M 时时,A与与c的线性关系的线性关系会发生偏差？会发生偏差？当c 0.01M 时时当c 0.01M 时时比尔定律在低浓度时正确，高浓度时受限。比尔定律在低浓度时正确，高浓度时受限。1.1.邻近质点彼此电荷分布邻近质点彼此电荷分布2.2.各组分之间的相互作用各组分之间的相互作用分子间的相互作用可分子间的相互作用可忽略不计忽略不计(2)溶溶 剂剂 由于待测物与溶剂发生缔合、离解及溶剂化反由于待测物与溶剂发生缔合、离解及溶剂化反 应，应，产生的生成物与待测物具有不同的吸收光谱，出产生的生成物与待测物具有不同的吸收光谱，出现现化学偏离化学偏离。(3)光散射的影响光散射的影响当试样是胶体或有悬浮物时，入射光通过溶液后，当试样是胶体或有悬浮物时，入射光通过溶液后，有一部分光因散射而损失，使吸光度增大，对有一部分光因散射而损失，使吸光度增大，对Beer Law 产生产生正偏差正偏差。2.与仪器有关的因素与仪器有关的因素Lambert-Beer Law只适用于只适用于单色光单色光。单色光：是由单色器从连续光谱中分离出的一小单色光：是由单色器从连续光谱中分离出的一小段波长范围的段波长范围的复合光复合光，不是绝对的单色光不是绝对的单色光，有可，有可能造成对比尔定律的偏移。能造成对比尔定律的偏移。谱带宽度（谱带宽度（band width）：指具有某一波长范围）：指具有某一波长范围 的光谱带，常用半峰宽来表示。的光谱带，常用半峰宽来表示。谱带宽度对吸收定律的影响谱带宽度对吸收定律的影响 相同谱带宽度的情况下，选择哪一个谱带宽度相同谱带宽度的情况下，选择哪一个谱带宽度（波长）作为测定波长？（波长）作为测定波长？实验证明：选用一束吸光度随波长变化不大实验证明：选用一束吸光度随波长变化不大的复合光作为入射光进行测定（的复合光作为入射光进行测定（吸光物质最大吸吸光物质最大吸收波长收波长）。由于在此范围内，吸光物质的）。由于在此范围内，吸光物质的吸光系吸光系数变化不大数变化不大，对比尔定律造成的偏离较小，并能，对比尔定律造成的偏离较小，并能保证测定有较高的灵敏度。保证测定有较高的灵敏度。谱带宽度对吸收定律的影响谱带宽度对吸收定律的影响 图示：图示：AAc c谱带谱带A谱带谱带B谱带谱带A谱带谱带BA1A23.3 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计UV-Vis spectrophotometer3.3.1 仪器主要部件及作用仪器主要部件及作用3.3.2 常用分光光度计类型及功能简介常用分光光度计类型及功能简介3.3.3 分光光度计的校正分光光度计的校正3.3.1 主要部件及作用主要部件及作用0.575光源光源单色单色器器吸收吸收池池检测检测器器显显示示3.3.2 分光光度计类型简介分光光度计类型简介1.单波长分光光度计单波长分光光度计单光束分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计双光束分光光度计2.双波长分光光度计双波长分光光度计1.单波长分光光度计单波长分光光度计 单光束分光光度计单光束分光光度计 特点：只有一条光束特点：只有一条光束 单光束分光光度计单光束分光光度计 不足：不足：要求光源和检测系统必须要有较高的稳定性；每要求光源和检测系统必须要有较高的稳定性；每更换一个测定波长，都要用空白溶液重新校准。更换一个测定波长，都要用空白溶液重新校准。实验：芦丁含量测定；差示法测定样品中高含量实验：芦丁含量测定；差示法测定样品中高含量镍。镍。752752型紫外型紫外-可见分光光度计可见分光光度计 单波长单波长双光束双光束分光光度计分光光度计 特点：在同一台仪器中使用两个特点：在同一台仪器中使用两个完全相同完全相同的光束。的光束。双光束分光光度计双光束分光光度计优点：可自动扫描样品溶液吸收光谱；优点：可自动扫描样品溶液吸收光谱；消除光源消除光源强度不稳引入的误差；强度不稳引入的误差；仪器开机后无须预热可仪器开机后无须预热可直接测样；能减小放大器增益的漂移。直接测样；能减小放大器增益的漂移。岛津岛津 UV3101 UV3101 型型 吸光度测定吸光度测定 光谱扫描光谱扫描 时间光谱扫描时间光谱扫描功功能能双波长分光光度计双波长分光光度计 特点特点：可将两种不同波长的可将两种不同波长的光交替通过同一样品光交替通过同一样品 溶液，得到这两个波溶液，得到这两个波长下的吸光信号，再长下的吸光信号，再通过适当的信号转换通过适当的信号转换系统转换为它们之间系统转换为它们之间的吸光度差的吸光度差 A A。A=AA=A11 A A22 双波长分光光度计双波长分光光度计 优点：优点：不需要参比溶液；能够不需要参比溶液；能够减少背景吸收和干扰吸减少背景吸收和干扰吸收以及光源电压变化产收以及光源电压变化产生的影响；可用于相互生的影响；可用于相互有干扰的多组分混合物有干扰的多组分混合物的分析。的分析。岛津岛津 UV300 UV300 型型3.3.3 分光光度计的校正分光光度计的校正波长校正：检查仪波长校正：检查仪器的波长刻度与实器的波长刻度与实际波长是否能较好际波长是否能较好的保持一致。用镨的保持一致。用镨钕玻璃或钬玻璃钕玻璃或钬玻璃3.3.3 分光光度计的校正分光光度计的校正吸光度校正：在实际工作中，有时需对仪器的吸光度校正：在实际工作中，有时需对仪器的吸光度标度进行检查和校正。吸光度标度进行检查和校正。用用 K2CrO4 标准溶液标准溶液吸收池校正：在吸收池吸收池校正：在吸收池A内装入试样溶液，内装入试样溶液，B内内装入参比溶液，测吸光度；洗净、调换两种溶装入参比溶液，测吸光度；洗净、调换两种溶液，再测吸光度。前后两次测得吸光度差值应液，再测吸光度。前后两次测得吸光度差值应小于小于1%。临床检验常用临床检验常用分子光谱仪分子光谱仪 酶标仪、全自动生化分析仪、尿液分析酶标仪、全自动生化分析仪、尿液分析仪、血红蛋白测定仪：专用分光光度计，工仪、血红蛋白测定仪：专用分光光度计，工作原理均遵循朗伯作原理均遵循朗伯-比尔定律，采用比色法进比尔定律，采用比色法进行分析，仪器的核心都有一个行分析，仪器的核心都有一个“分光光度计分光光度计”。知识拓展知识拓展酶标仪酶标仪是一台变相的专用分光光度计；是酶联免疫吸附是一台变相的专用分光光度计；是酶联免疫吸附实验专用仪器；利用比色法来分析抗原或抗体的实验专用仪器；利用比色法来分析抗原或抗体的含量。含量。如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗体的检测。如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗体的检测。全自动生化分析仪全自动生化分析仪 主要采用比色法进行分析，工作波长在主要采用比色法进行分析，工作波长在 340800nm之间；之间；通过对人体血液中脂类、酶类、蛋白通过对人体血液中脂类、酶类、蛋白质、胆红素等的分析来测定各种生化指标；质、胆红素等的分析来测定各种生化指标；是临床是临床最常用的检验仪器之一。最常用的检验仪器之一。尿液分析仪尿液分析仪 是检测尿液中某些化学成分（是检测尿液中某些化学成分（尿蛋白、葡萄尿蛋白、葡萄糖、胆红素等糖、胆红素等）含量的专用自动化仪器；是反射）含量的专用自动化仪器；是反射光比色计，采用球面积分仪接受双波长反射光，光比色计，采用球面积分仪接受双波长反射光，检测试纸带颜色变化进行定量分析。检测试纸带颜色变化进行定量分析。血红蛋白测定仪血红蛋白测定仪 用光电器件测透射光强度，并与已定标的血色用光电器件测透射光强度，并与已定标的血色素值相比较，即可得出血红蛋白含量；本质是一台素值相比较，即可得出血红蛋白含量；本质是一台专用比色计。专用比色计。小小 结结Lambert-Beers Law 的数学表达式，吸光系数，的数学表达式，吸光系数，偏离定律的因素；偏离定律的因素；紫外紫外-可见分光光度计各类型仪器特点。可见分光光度计各类型仪器特点。习题：课后习题：课后3、5、9、15（P50）本节课参考书本节课参考书1.仪器分析复旦大学出版社仪器分析复旦大学出版社2.最新仪器分析技术全书化学工业出版社最新仪器分析技术全书化学工业出版社3.分析化学分析化学人民卫生出版社人民卫生出版社4.全国临床检验操作规程全国临床检验操作规程东南大学出版社东南大学出版社复复 习习Lambert-Beers Law，吸光系数，偏离定律的因，吸光系数，偏离定律的因素；素；紫外紫外-可见分光光度计的主要部件，主要类型。可见分光光度计的主要部件，主要类型。本次课内容本次课内容3.4 分析条件的选择分析条件的选择 3.5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用3.4 分析条件的选择分析条件的选择 3.4.1 仪器测量条件的选择仪器测量条件的选择 3.4.2 反应条件的选择反应条件的选择 3.4.3 参比溶液的选择参比溶液的选择 3.4.4 干扰及消除方法干扰及消除方法 3.4 分析条件的选择分析条件的选择提高方法的提高方法的灵敏度、准确度灵敏度、准确度仪器测量条件仪器测量条件 试样反应条件试样反应条件参比溶液参比溶液干扰及消除干扰及消除 3.4.1 仪器测量条件仪器测量条件 入射光波长的选择入射光波长的选择杂散光的影响杂散光的影响透光率读数的影响透光率读数的影响（选择合适的吸光度范围）（选择合适的吸光度范围）入射光波长的选择入射光波长的选择应用应用“最大吸收原则最大吸收原则”，在此波长（，在此波长（max）下）下测定，吸光系数大，灵敏度高。测定，吸光系数大，灵敏度高。当最大吸收峰峰形比较尖锐时，可选吸收稍低、当最大吸收峰峰形比较尖锐时，可选吸收稍低、峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。当有干扰物存在时，可根据当有干扰物存在时，可根据“吸收尽可能大，干吸收尽可能大，干扰尽可能小的原则扰尽可能小的原则”选择入射光波长。选择入射光波长。杂散光的影响杂散光的影响 设杂散光强度为设杂散光强度为 Is,测得吸光度为：测得吸光度为：A测测=lgI0+IsIt+IsIt I0 ，I0+Is It+Is I0/It即即A测测 A ，令令 Is/I0=S,有：有：Is=S I0杂散光：指仪器内部通过非预定途径照射杂散光：指仪器内部通过非预定途径照射 到检测器上的额外的光辐射。到检测器上的额外的光辐射。杂散光的影响杂散光的影响A测测=lgI0+S I0It I0/I0+S I0=lg1+ST+S例：当 S=1.0%,T=10%，求，求A测测？当 S=0,T=10%，求求A？当当S小于小于0.01%，可忽略杂散光的影响。，可忽略杂散光的影响。n任何分光光度计都有一定的测量任何分光光度计都有一定的测量误差误差。（这一误差来源于光源、检测器、显示系统）（这一误差来源于光源、检测器、显示系统）n这一测量误差的这一测量误差的总和总和最终表现在透光率读数最终表现在透光率读数T T 上，上，设为设为T T。透光率读数的影响透光率读数的影响 对同一台仪器来说对同一台仪器来说 ，T T 是一常数。但是一常数。但由于由于 A=-lgT ，所以在不同的透光率读数范，所以在不同的透光率读数范围内，同样大小的围内，同样大小的 T T 所引起的吸光度误差所引起的吸光度误差 A A 是不同的。是不同的。透光率读数的影响透光率读数的影响 根据朗伯根据朗伯-比尔定律：比尔定律：A 与与 c c 成正比关系成正比关系 因此，因此，A 与与 c 也成正比关系。也成正比关系。A=K c （T、A 、c 均为绝对误差均为绝对误差 ）测量结果的误差通常用相对误差来表示：测量结果的误差通常用相对误差来表示：c/c 透光率读数的影响透光率读数的影响c/c 与与 A、T 的关系的关系 A=-lgTA=-lgT=l c c （1 1）(-0.434/T)dT=(-0.434/T)dT=l dc dc （2 2）将（将（2 2）式代入）式代入朗伯朗伯-比尔比尔定律，整理后得：定律，整理后得：0.434 0.434 （3 3）T TlgTlgT c/c c/c=T T c/cc/c与与 T T 的关系的关系 c/cc/c 36.8%T c/c=c/c=0.4340.434 T TlgTlgT T T 0.434 Amin结结 论论1.c/c 取决于透光率取决于透光率T和透光率测量误差和透光率测量误差T的大的大小小;当当 T=36.8%时时(或或A=0.434)，c/c最小。最小。2.当当 T 读数在读数在 70%10%,即即 A 读数读数0.15 1.0 范围时范围时,c/c 较小较小(5%)，并且变化不大。，并且变化不大。3.4.2 反应条件的选择反应条件的选择 显色反应显色反应：使待测物与显色剂作用，生成有颜：使待测物与显色剂作用，生成有颜色的化合物，色的化合物，颜色深浅与待测物浓度相关颜色深浅与待测物浓度相关，在在一定范围内呈直线关系。一定范围内呈直线关系。目的目的：使被测组分在所选择反应条件下能有：使被测组分在所选择反应条件下能有效地转变为适于吸光度测定的化合物形态。效地转变为适于吸光度测定的化合物形态。显色反应需满足以下要求显色反应需满足以下要求n反应有较高的选择性，生成物在紫外反应有较高的选择性，生成物在紫外-可见可见光区有较强吸光能力。光区有较强吸光能力。n生成物组成恒定、稳定性好，生成物组成恒定、稳定性好，与被测物之间与被测物之间必须有确定的定量关系必须有确定的定量关系，显色条件易于控制。，显色条件易于控制。n对照性要好，显色剂与生成物的最大吸收波对照性要好，显色剂与生成物的最大吸收波长差别要在长差别要在 60 nm 60 nm 以上。以上。反应条件的选择反应条件的选择（影响显色反应的因素影响显色反应的因素）显色反应显色反应：M +nR MRn 1.显色剂用量显色剂用量：作吸光度随显色剂浓度变化：作吸光度随显色剂浓度变化曲线，选恒定吸光度值时的显色剂用量。曲线，选恒定吸光度值时的显色剂用量。2.同时还需考虑显色反应的灵敏度、稳定性同时还需考虑显色反应的灵敏度、稳定性和反应的选择性。和反应的选择性。反应条件的选择（影响显色反应的因素）反应条件的选择（影响显色反应的因素）2.溶液酸度的影响溶液酸度的影响：介质酸度直接影响显色：介质酸度直接影响显色剂离解程度，从而影响显色反应的完全程剂离解程度，从而影响显色反应的完全程度。度。固定溶液中待测组分与显色剂的浓度，固定溶液中待测组分与显色剂的浓度，改变溶液酸度（改变溶液酸度（pHpH值），测定溶液值），测定溶液A A与与 pH pH 的关系曲线，找出最适的关系曲线，找出最适 pH pH 范围。范围。反应条件的选择（影响显色反应的因素）反应条件的选择（影响显色反应的因素）3.3.其他问题其他问题反应的时间、温度、放置的时间等。反应的时间、温度、放置的时间等。此外，加显色剂和试剂的顺序与实验成败此外，加显色剂和试剂的顺序与实验成败有重要关系！有重要关系！反应条件的控制反应条件的控制须通过实验确定显色反应最适宜条件。须通过实验确定显色反应最适宜条件。对于已建立的比色方法，不应随意更改条件。对于已建立的比色方法，不应随意更改条件。需要改变条件，或新建方法中要考察某一条件对需要改变条件，或新建方法中要考察某一条件对显色的影响时，可通过实验描绘吸光度显色的影响时，可通过实验描绘吸光度-条件曲条件曲线，或不同条件下的吸光度线，或不同条件下的吸光度-浓度曲线，从中选浓度曲线，从中选定适宜条件。定适宜条件。3.4.3 参比溶液的选择参比溶液的选择溶剂参比：待测试样组成简单，共存组分少且对测溶剂参比：待测试样组成简单，共存组分少且对测 定波长几乎无吸收，可用溶剂做参比。定波长几乎无吸收，可用溶剂做参比。试剂参比试剂参比：在不加样品的条件下，加入所需试剂：在不加样品的条件下，加入所需试剂 和溶剂。和溶剂。试样参比：除不含显色剂以外，其余成分都含有。试样参比：除不含显色剂以外，其余成分都含有。平行操作参比：不含待测组分。平行操作参比：不含待测组分。3.4.4 干扰及消除方法干扰及消除方法 干扰物的影响：干扰物的影响：n干扰物本身有颜色或与显色剂形成有色化干扰物本身有颜色或与显色剂形成有色化合物；合物；n在显色条件下，干扰物水解，析出沉淀使在显色条件下，干扰物水解，析出沉淀使溶液浑浊；溶液浑浊；n与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行。使显色反应不能进行。3.4.4 干扰及消除方法干扰及消除方法 消除方法：消除方法：控制酸度，提高反应的选择性；控制酸度，提高反应的选择性；选择适当的掩蔽剂，但不能与待测离选择适当的掩蔽剂，但不能与待测离子作用；子作用；与待测物生成惰性配合物；与待测物生成惰性配合物；选择适当的测量波长；选择适当的测量波长；分离。分离。3.5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用 紫外紫外-可见吸收光谱适用于不饱和有机可见吸收光谱适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。断未知物的骨架结构。利用紫外利用紫外-可见吸收光谱进行化合物的定性可见吸收光谱进行化合物的定性鉴别，一般采用鉴别，一般采用比较吸收光谱特征的方法。比较吸收光谱特征的方法。3.5.1 定性定性分析（鉴别）分析（鉴别）3.5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用3.5.1.定性分析定性分析1.对比吸收光谱特征数据：对比吸收光谱特征数据：max,max,或或A1cm1%3.5.1.定性分析定性分析2.对比吸光度的比值对比吸光度的比值 有多个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处有多个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度的比值作为鉴别依据。测得吸光度的比值作为鉴别依据。例：中国药典规定，例：中国药典规定，VitB12 在在361nm与与278nm吸吸光度的比值应为光度的比值应为1.701.88，361nm与与550 nm吸吸光度的比值应为光度的比值应为3.15 3.45.3.5.1.定性分析定性分析3.对比吸收光谱的一致性对比吸收光谱的一致性 将试样与已知标准品配成相同浓度的溶液，将试样与已知标准品配成相同浓度的溶液，在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一在同一条件下分别描绘吸收光谱，核对其一致性。致性。例：醋酸可的松、醋酸氢化可的松与醋酸泼尼例：醋酸可的松、醋酸氢化可的松与醋酸泼尼松三者有几乎完全相同的松三者有几乎完全相同的max,（240nm）、）、（1.57104）和）和A1cm 1%（390），），但它们的光但它们的光谱曲线有差别，据此可得到鉴别。谱曲线有差别，据此可得到鉴别。3.5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用4.4.纯度检查纯度检查 杂质检查杂质检查杂质的限量检测杂质的限量检测3.5 紫外紫外-可见吸收光谱的应用可见吸收光谱的应用3.5.2 结构分析结构分析用于判别顺反异构用于判别顺反异构体和互变异构体（可体和互变异构体（可以确定一些化合物的以确定一些化合物的构型和构象）。构型和构象）。3.5.3 定量分析定量分析1.单组分定量方法单组分定量方法 单组分：单组分：样品溶液中含一种组分，或者在混合物溶液样品溶液中含一种组分，或者在混合物溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收中