转基因植物产品检测实验室一览.doc

转基因植物产品检测实验室一览

序号
仪器名称
用途
参考品牌型号与配置
大大致预算
1
高速冷冻离心机
生物样品的高速分离（冷冻保持样品生活活性）。
德国eppendorf；美国Thermo；德国Sigma；德国Herolab。
50000
120000
2
定性PCR扩增仪
微量基因片段（DNA/RNA）的扩增
德国Peqlab、美国ABI、德国eppendorf、美国Bio-rad。
50000
110000
定量CR扩增仪（荧光定量PCR）
扩增的同时对基因片段做定量检测。
美国ABI、德国eppendorf、美国Bio-rad。
250000
780000
3
PCR专用工作台
保证PCR时的无污染。（或建设标准的PCR层流实验室）
德国Peqlab。
（国产超净台也可替代。）
10000
34000
4
电泳槽、电泳仪
基因片段扩增之后跑凝胶。
德国Peqlab、美国Bio-rad。或北京六一。
15000
40000
5
凝胶成像系统
对凝胶进行分子量、等定性分析
法国VL，美国Bio-rad、或国产。
350000
150000
6
紫外透射仪

国产
6000
15000
7
制冰机

国产
20000
35000
8
CO2培养箱

美国Tehrmo。美国shellab
20000
50000
9
液氮罐

国产。
4000
10000
10
超纯水

美国millipore；美国Tehrmo。
40000
76000
双蒸馏水发生器

国产
4000
18000
11
分子生物常用耗材与试剂

5000
10000
12
转基因专用试剂

5000
10000
其他设备：
细胞融合仪、核酸提取仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪磁力搅拌机杂交仪、-30℃低温冰箱、超低温冰箱、漩涡混合器、超声波细胞粉碎仪、自动恒温酶标。

7 操作步骤
7.1 抽样
参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样。
7.2 制样
参照 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样（按照GB 5491中四分法制备样品进行送检）。
7.3 DNA模板的制备
a 称取200-400 mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的1.5 ml离心管中。
b 加入1ml预冷至4 ℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13 000 r/min离心机，4 ℃离心15 min，弃去上清液。
c 加入600 μl 预热到65 ℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65 ℃的水浴锅中裂解40 min。
d 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清液转至另一离心管中，加入5 μl RNase A （10 mg/ml），37 ℃ 水浴30 min。
e 分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。
f 用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10 体积3M乙酸钠（pH 5.6），-20 ℃ 放置2-3 h，充分沉淀DNA。
g 13 000 r/min，4 ℃ 离心15 min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50 μl TE（pH8.0）溶解DNA。
h 把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20 ℃备用。
注意：
I 1 g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200 μg。
II DNA的OD260/OD280的比值应在1.8左右，且OD260的值应在曲线的最高峰。
7.4 PCR反应
7.4.1 试样的PCR反应
在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再加约50 μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。
在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（Sad1基因、nos终止子、CaMV35S启动子：94℃,30 s；56℃,30 s；72℃,30s；cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因：94℃,1 min；56℃, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。
表1 PCR反应体系
试剂
终浓度
单样品体积
ddH2O

31.25
10×PCR 缓冲液
1×
5 µl
25 mM MgCl2
2.5 mM
5 µl
10 mM dNTPs
0.2 mM
1 µl
10 µM Primer 1
0.5 µM
2.5 µl
10 µM Primer 2
0.5 µM
2.5 µl
5 U/µl Taq 酶
0.025 U/µl
0.25 µl
100 ng/µl DNA 模板
5 ng/µl
2.5 µl
总体积

50 µl

7.4.2 对照的PCR反应
在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。
阴性对照是指用非转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照是指用转基因抗虫棉花材料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；空白对照是指用无菌重蒸水作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分与7.4.1相同。
7.5 PCR产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为2%（w/v）的溶液，然后按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 µL溴化乙锭溶液的比例，加入溴化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物（需和上样缓冲液混合，10 µL-20µL），其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳，按2 V/cm 的电压电泳15-30 min。
7.6 凝胶成像分析（照相）
电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。如果通过PCR结果能够明确判定试样是或不是转基因抗虫棉，则样品检测结束；如果不能明确判定，则进行以下试验，见7.7、7.8和7.9。
7.7 PCR产物的回收
将100 µl PCR反应液与上样缓冲液混合后，加入配制好的含2%（w/v）琼脂糖凝胶的泳道中，在其中的一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳。其余步骤按PCR产物回收试剂盒说明进行。
7.8 PCR产物的酶切鉴定
CaMV35S启动子扩增产物为195 bp，可以被限制性内切酶XmnⅠ切成大小为80 bp和115 bp的两个片段。取15 µL回收的PCR产物放入反应管中，加入1 µL的限制性内切酶XmnⅠ，再加入2 µL反应酶切反应缓冲液，加水2 µL配成20 µL反应体系，在37℃恒温水浴保温反应3小时。将20 µL反应液与上样缓冲液混合后加入配制好的2.5%（w/v）琼脂糖凝胶的一个泳道中，按7.5和7.6的步骤操作进行分析。
7.9 PCR产物的克隆和测序
对PCR产物片段按PCR产物回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收，连接到T-easy载体上，进行序列测定，并对测序结果进行比对和分析。

8 结果分析与表述
如果阳性对照的PCR反应中， Sad1内标准基因、CaMV35S启动子、nos终止子以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因基因这四个序列都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出Sad1基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。
在PCR反应体系正常工作的前提下，检测结果通常有以下几种情况：
（1）在试样PCR反应中，只要Sad1内标准基因以及cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因抗虫基因都得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明该样品为阳性结果，检出cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ac与cry1Ab融合基因。
（2）如果在试样和阴性对照的PCR反应中，仅有Sad1内标准基因片段得到扩增，表明该样品为阴性结果，未检出转基因成分。
（3）在试样PCR反应中， Sad1内标准基因得到了扩增，CaMV35S启动子、nos终止子或其中一种序列也得到了扩增， 且扩增片段大小与预期片段大小一致，但cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ac与cry1Ab融合基因都没有得到扩增，表明该样品为阳性结果，检出转基因成分。此时，要求研发者提供相应的靶基因序列以便进行进一步验证。

转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定
对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析.结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII.
作 者： 叶长明魏祥东陈东红蓝崇钰朱利民 
作者单位：叶长明,魏祥东,陈东红,蓝崇钰(中山大学基因工程教育部重点实验室,生物防治国家重点实验室,广州,510275)朱利民(香港中文大学生物系,香港沙田)

国家转基因植物检测与监测中心（华东）项目实验仪器设备（二）招标公告
采购内容： （共四个组包）
组包一　
实时荧光定量PCR仪     1台
基因扩增仪             1台
高速冷冻离心机         １台
双向电泳仪             1台
紫外分光光度计          1台
组包二　
高速台式离心机           1台
组包三、  
微量移液器（单道）       30支
移液枪(8通道)           　 3支
组包四、 
人工气候箱                1台
自动高压蒸汽灭菌锅        1台

4