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基因工程期末复习
第一章: 基因工程
1. 定义: 经过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身, 并具有明确应用目的的活动称为基因工程。
2. 基因工程研究的主要内容或步骤:
基因克隆的通用策略 : 涉及的过程可用分/合成、 切、 连、 转、 选、 鉴。
①从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA片段;
②在体外, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子;
③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞( 寄主细胞) , 并与之一起增殖;
④从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆;
⑤从筛选出来的受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用;
⑥将目的基因克隆到表示载体上, 导入寄主细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表示, 产生出人类所需要的物质。
3.三大元件: 载体、 质粒、 片段。
第二章: 分子克隆工具酶
1、 工具酶: 限制性核酸内切酶、 DNA连接酶、 DNA聚合酶、 DNA修饰酶、 核酸外切酶、 单链核酸内切酶。
2、 限制性内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。三种( Ⅰ型酶、 Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶)
3、 甲基化酶: 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员, 用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。三种( )
4、 回文结构: 双链DNA中含有的二个结构相同、 方向相反的序列称为反向重复序列, 每条单链以任一方向阅读时都是一样的。
5、 同裂酶( isoschizomers): 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶可能进行同样的切割, 产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。
6、 同尾酶( isocaudamer) : 指来源不同、 识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
7、 影响核酸内切酶活性的因素: ①DNA浓度②DNA的甲基化程度③酶切消化反应的温度( 大多数酶的标准反应温度37度) ④DNA的分子结构。
星星活性: 在极端非标准条件下, 限制酶能切割与识别序列相似的序列, 这个改变的特殊性称为星星活性( star activity)。
8、 Ｔ4连接酶: 该酶常从Ｔ4噬菌体的受感细胞中提取, 是由Ｔ4噬菌体基因组所编码的, 因此基因工程中常见的连接酶是Ｔ4连接酶。
9、 影响连接酶作用的因素
①反应温度: 连接缺口的温度: 37℃; 连接粘性末端的最佳温度: 4～15 ℃。
②Ｔ4DNA连接酶的用量: 平末端DNA分子的连接反应中, 最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接, 酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间。
③提高外源片断与载体的浓度的比值, ( 10～20倍) 。
10、 常见的连接方法: 同聚物加尾法、 衔接物法和接头连接法。
11、 DNA聚合酶: DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成( 在具备模板、 引物、 dNTP等的情况下) 及其相辅的活性。依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶Ⅰ(全酶); DNA聚合酶Ⅰ大片段 (klenow片段); 耐热DNA聚合酶(Taq 酶); 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶。
12、 DNA聚合酶Ⅰ活性: 三种酶活性①5’ →3’DNA聚合酶活性②5’ →3’③3’→5’ 核酸外切酶活性。
13、 逆转录酶: 以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。5’ →3’合成DNA, 无3’→5’外切活性。
第三章 分子克隆载体
1、 载体: 将外源DNA或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具。( 克隆载体、 表示载体)
来源: 质粒载体、 噬菌体载体、 人工染色体载体、 病毒载体。
二 .质粒: 染色体外的遗传因子, 能自我复制, 多数为双链闭环DNA, 大小1KB-200KB
外源DNA如超过10kb, 则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低。
三大特性: 自我复制、 克隆位点、 筛选标记( 其它如易分离纯化, 具有启动子)
1、 能独立于染色体而进行自主复制而且是高效的复制。
2、 要有尽可能多种限制酶的切割位点, 但每一种限制酶又要最少的切割位点( 多克隆位点 multiple cloning sites , MCS) 。
3、 有适合的标记, 易于选择。
表示性质粒载体: 按特殊设计构建的, 能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列, 在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。
主要包括: 大肠杆菌的启动子、 及操纵位点序列、 多克隆位点、 转录及转译信号、 质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。
1.构型: SC型共价闭合环形DNA( ccc DNA) 、 OC型开环DNA( ocDNA) 、 L 型线性DNA。
2.质粒DNA的复制类型: ( 拷贝数的多少) : 严谨型、 松弛型
质粒
复制子
拷贝数
pBR322
pMB1
15-20
pUC
pMB1
500-700
pACYC
P15A
10-212
pSC101
pSC101
-5
Co1E1
Co1E1
15-20
3.质粒的不相容性: 在同一个大肠杆菌细胞, 一般不能同时含有两种同一复制系统的质粒。也称为质粒的不相容性。
是指在没有选择压力的情况下, 两种亲源关系密切的不同质粒, 不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
质粒的不亲合性分子基础, 主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
4.质粒DNA的转移性: 在天然条件下, 很多天然质粒都能够经过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内, 这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。
5.改造天然质粒方法:
( 1) 加入合适的选择标记基因, 如两个以上, 易于用作选择。
( 2) 增加或减少合适的酶切位点, 便于重组。
( 3) 缩短长度, 切去不必要的片段, 提高导入效率, 增加装载量。
( 4) 改变复制子, 变严紧为松弛, 变少拷贝为多拷贝。
( 5) 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件; 方法就是重组。
6.质粒载体必须具备的基本条件:
( 1) 具有复制起点; ( replication origin) 自我增值的基本条件, 一般具一个复制子。
( 2) 具有筛选标签; 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
( 3) 具有若干限制酶切单一位点( MCS multiple cloning sites ) ;
( 4) 具有较小的分子量和较高的拷贝数。
7.质粒载体的选择记号: 抗菌素抗性( 氨苄青霉素抗性基因ampr、 四环素抗性基因tetr、 氯霉素抗性基因Cmr、 卡那霉素抗性基因kanr新霉素neor抗性基因)
8.α－互补: ①lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补
②宿主和载体各自编码的α片段和ω片段虽然没有酶活性, 可是当载体和宿主细胞同时表示时, 产生的α片段和ω片段发生互补, 可形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶, 称作α－互补
这个互补系统用来监测质粒上有无插入序列
③蓝白斑筛选: pUC质粒
在LacZ—的大肠杆菌中, 在有IPTG诱导物和X-gal生色底物的平板培养中, 菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒, 其上有LacZ′, 质粒和大肠杆菌DNA可实现α－互补, 表示出β-半乳糖苷酶, 可降解生色底物使菌落呈蓝色( 有活性、 阴性克隆) 。
如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因, 则LacZ′基因受到破坏, 便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶, 因此菌落呈白色( 无活性、 阳性克隆) 。
9.质粒DNA的分离和纯化
从细菌中提取质粒DNA的方法都包括以下三个步骤: 培养细菌、 收集和裂解细菌、 纯化质粒DNA
三种方法: 氯化铯密度梯度离心法; 碱变性法; 煮沸法
原理: 碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH12.6的高碱性条件下, 染色体DNA和质粒DNA都发生变性, 但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离, 因此当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时, 变性的质粒DNA又恢复到原来的构型, 保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。经过离心, 染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
流程:
1、 取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物, 加在微量离心管中, 离心收集细胞沉淀;
2、 加入100微升冰冷的悬浮液, ( 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA, 4~5mg溶菌酶) 静置5分钟;
3、 加入200微升微冷的裂解液( 0.2NaOH, 1.0%SDS) 缓缓混匀置室温5分钟。
4、 加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠, 振荡后, 冰浴5分钟。
5、 离心的上清液用苯酚抽提数次, 用乙醇沉淀收集质粒DNA。
溶液Ⅰ: 50mmol/L 葡萄糖; 25mmol/L Tris-Cl(pH8.0); 10mmol/L EDTA(pH 8.0) (主要作用: Solution I 中的EDTA能够螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性, 对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。)
溶液Ⅱ (pH 12.6) : 0.2mol/L NaOH ;1%SDS (现用现配) (主要作用: 细胞壁肽聚糖碱性下水解, 核酸和蛋白质变性. Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min, 以免变性质粒不易复性)
溶液Ⅲ (pH 4.8) : 100ml5mol/L NaAc 60ml; 冰醋酸 11.5ml; 双蒸水 28.5ml (作用: 中和碱液, 质粒DNA复性, 变性蛋白－SDS＋, 线性DNA沉淀)
三 噬菌体载体
1.基本过程: 吸附、 注入、 合成、 组装、 释放
2.λ噬菌体载体( 特有多极调控、 9-23KB)
DNA是一条线性双链DNA分子, 一旦进入宿主细胞, 黏性末端互补配对形成双链环状DNA分子, 这种黏性末端结合形成的双链区段称为COS位点, 随后闭合充当转录模板
λ噬菌体载体的主要类型
1. 插入式载体经过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。
2. 替换型载体( 取代型载体) : 具有成正确克隆位点, 允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体。( 广泛)
3.柯斯质粒载体: 是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型载体, 也称为黏粒载体( 45KB)
特点: 具有λ噬菌体特性( cos位点) 、 具有质粒载体特性、 具有高容量的克隆能力
四 其它载体
1.酵母载体: 整合型载体( YIp) 、 复制型载体( YNp) 、 附加体型载体( YEp)
2.人工染色体载体( 一种穿梭载体:能够在两类不同宿主中复制、 增殖和选择的载体)
①酵母人工染色体( YAC) : 选择标记主要采用营养缺陷型基因, 例如带有突变赭石突变抑制基因在培养基上形成红色菌落, 而带有赭石突变抑制基因SUP4则为白色
②细菌人工染色体( BAC) 又称F黏粒
五 表示载体
1.克隆基因正确表示的基本条件:
①最基本条件: 应该能够进行正常的转录和转译, 以及在正常情况下还与转译后加工有关。
②重要条件: 编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。具有核糖体结合位点; 具有克隆基因的功能( 强) 启动子; 插入序列的正确取向
2.表示元件:
①启动子: 必须是强启动子、 应能呈现出一种低限的基础转录水平、 启动子应是诱导型的
常见原核强启动子: Plac、 Ptac、 PL启动子、 T7噬菌体启动子
Plac: 受Lac阻遏蛋白负调控, 受乳糖或类似物IPTG的诱导;
Ptac: Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。受Lac阻遏蛋白负调控, 可用乳糖或类似物IPTG的诱导, 启动能力比Plac和Ptrp都强;
PL启动子: 噬菌体早期左向转录启动子, 受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导( 低温30℃阻遏, 高温42℃ 诱导) 。
T7噬菌体启动子: 具有高度特异性, 只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录
T7如何诱导调控的原理

②转录终止子③转译起始序列④转译增强子⑤转译终止密码子
第四章: 基因操作中大分子的分离和分析
一 核酸凝胶电泳( 用于分离、 鉴定和纯化DNA或RNA片段; 检测: 分子量、 DNA浓度)
1.基本原理: 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团, 呈负离子化状态; 核酸分子在一定的电场强度的电场中, 它们会向正电极方向迁移( ”—”-→”+”)
2.琼脂糖凝胶电泳: 核酸片段因其分子量或分子形状不同, 电泳移动速度有差异而分离
①DNA迁移率的影响因素: DNA分子的大小( 反比) 、 琼脂糖浓度( 反比) 、 DNA构象、 凝胶和电泳缓冲液中的EB、 电压、 琼脂糖种类、 电泳缓冲液
②配制: 最常见1%的, 称取琼脂糖1g, 加100ml电泳缓冲液( TAE) , 微波炉煮沸, 冷却到50度时倒胶
3、 RNA胶的制备: 1.5g琼脂糖加115ml水, 加热融化。冷却至60℃时加30ml的5 X MOPS电泳缓冲液 (终浓度为1X); 加5ml甲醛( 琼脂糖终浓度为1%) 。制胶。
二 分子杂交
1.定义: 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下( 适当的温度、 离子强度等) , 按碱基互补的原则, 重新形成双链核酸分子的过程
2. 探针( probe) : 被标记的核酸分子, 能够是DNA、 RNA和合成的寡核苷酸
基本原理: 碱基互补;
杂合双链: DNA:RNA 、 DNA:DNA;
类型: 液相杂交、 固相杂交
3.杂交的基本过程: 凝胶电泳分离→变性→印迹转移→预杂交→杂交→洗膜→杂交信号检测
4、 Southern Blot原理: 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后, 经过琼脂糖凝胶电泳进行分离, 继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上, 固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列, 则二者经过碱基互补的原理进行结合, 游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测, 从而显示出待检的片段及其相对大小。
DNA→ 琼脂糖电泳→ 印迹转移→ 预杂交→杂交( 变性探针) → 洗膜→放射自显影或显色
5、 Northern Blot原理: 在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳, 继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
mRNA提取→甲醛变性电泳→印迹转移→预杂交→杂交( 变性探针) →洗膜→放射自显影或化学发光
6、 western 杂交基本原理同southern、 northern blot方式。但其是检测蛋白质, 关键在于探针的性质: 抗体( antibody)
三 PCR技术及其应用
1. 定义: 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法, 由高温变性、 低温退火( 复性) 及适温延伸等几步反应组成一个周期, 循环进行, 使目的DNA得以迅速扩增
2.反应体系: 10×扩增缓冲液10ul、 4种dNTP混合物各200umol/L、 引物各10～100pmol、 模板DNA0.1～2ug、 TaqDNA聚合酶2.5u、 Mg2+1.5mmol/L、 加双或三蒸水至100ul
Taq DNA聚合酶: 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶
①5’®3’DNA聚合酶活性和5’®3’外切酶活性 ; ②无3’®5’外切酶活性,
3.PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、 酶、 dNTP、 模板和缓冲液( 其中需要Mg2+)
4.步骤: 变性( 双链DNA经过高温变性解离成互补单链DNA ) 、 退火( DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合) 、 延伸( 适温延伸5’→3’引物形成新链变成4条链DNA )
基本原理: 碱基互补
设计原则: ( 1) 靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同
3'下游Primer与双链DNA正链互补, 与负链相同
正链5' ———————————— 3'
负链 3'———————————— 5'
例如: IL-3
正链5'GCTCCATGACCCAG--------GCGATCTTTTGAGTCCAA 3'
负链3‘CGAGGTACTGGGTC--------CGCTAGAAAACTCAGGTT 5'
上游引物序列: 与其相同 5' GCTCCATGACCCAG 3'
下游引物序列: 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'
因此序列为: 5'-TTG GAC TCA AAA GAT CGC -3'
5、 Sanger双脱氧终止法
F. Sanger在1977年创造用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列, 其基本原理如下:
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板, 合成准确的DNA互补链;
②该酶能够用2‘, 3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端, 从而终止其延伸反应。
在DNA测序反应中, 加入模板DNA, 引物( 特异性引物) , DNA聚合酶, dA, dT, dG, dC和一种ddNTP。常见Klenow大片段, 无5'→3'外切酶活性。
基本原理: DNA的半保留复制
测序步骤
①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板, 克隆并扩增待测DNA片段, 使其变性。
②选择一条与DNA单链互补的短链引物, 将引物用放射性同位素标记。
③引物先同单链模板复性。
④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、 互补引物分子、 四种的dNTP、 DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不同的ddNTP。
⑤进行聚合反应 , DNA新生链延长, 当掺入ddNTP时, 聚合反应终止。
⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。
⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置, 读出 DNA序列。
读出序列方法: 从下到上依次读出互补链的核苷酸序列
第九章 重组DNA导入细胞
一、 重组DNA分子导入受体菌
方式: 转化、 转导、 转染、 感染、 接合等
感受态细胞( competent cell) : 容易接受外源DNA的状态.导入方法
1. 氯化钙转化法 2. 电击法 3. 体外包装感染法
1、 转化( transformation)
指某些细菌(或其它生物)能经过其细胞膜摄取周围介质中的DNA片段, 并将另外DNA片段整合到自己染色体组中的过程。
2、 转导( transduction)
定义: 以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程, 称为转导。
3、 接合(conjugation)
是细菌经过性菌毛相互连接沟通, 将遗传物质( 主要是质粒DNA) 从供体菌转移给受体菌。能经过结合方式转移的质粒称为接合性质粒, 不能经过性菌毛在细菌间转移的质粒为非接合性质粒。