细菌原生质体育种技术及其应用进展.pptx

细菌原生质体育种技术细菌原生质体育种技术及其应用进展及其应用进展报告人：雷用东目目 录录一、前言一、前言一、前言一、前言二、研究现状二、研究现状二、研究现状二、研究现状三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理四、实验过程四、实验过程四、实验过程四、实验过程五、五、五、五、影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素 六、六、六、六、应用进展应用进展应用进展应用进展 七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望一、前言原原生生质质体体育育种种技技术术主主要要有有原原生生质质体体融融合合、原原生生质质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。原生质休融合育种是原生质休融合育种是基因重组基因重组的一种重要方法。的一种重要方法。原原生生质质体体融融合合作作为为一一种种新新的的基基因因重重组组手手段段是是19781978年年第第三三届届国国际际工工业业微微生生物物遗遗传传学学讨讨论论会会上上提提出出来来的。的。一、前言原生质体融合育种技术是原生质体融合育种技术是细菌遗传育种细菌遗传育种的有的有效方法之一，发展迅速，应用广泛。文中综述了效方法之一，发展迅速，应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。二、研究现状细菌原生质体融合是细菌原生质体融合是2020世纪世纪7070年代发展起来年代发展起来的重要的重要基因重组基因重组技术。技术。19761976年年FODORKFODORK等采用等采用聚乙聚乙二醇二醇（PEGPEG）、）、磷酸钙磷酸钙诱导巨大诱导巨大芽孢杆菌芽孢杆菌原生质体原生质体的融合，的融合，SCHAEFFEPSCHAEFFEP等报道了用等报道了用PEGPEG诱导诱导枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌的原生质体融合，这的原生质体融合，这2 2项重要研究成果同时发项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的术发展的里程碑里程碑，经过，经过3030余年的发展，已经成为余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。细菌遗传育种的一项基本技术。三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理 (1)(1)克服种属间杂交的克服种属间杂交的“不育性不育性”，可以进行远缘杂交。由于用，可以进行远缘杂交。由于用酶酶解解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生皆可发生原生质体融合，产生重组子重组子。(2)(2)基因重组基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇醇(PEG)(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质包括细胞核、细胞质)相相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。种类型的重组子。(3)(3)可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。到一个菌株中。(4)(4)存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子融合子。四、实验过程（一）实验材料：（一）实验材料：1、菌种：枯草芽孢杆菌T4412、枯草芽孢杆菌TT2四、实验过程（一）实验材料：（一）实验材料：（一）实验材料：（一）实验材料：2 2、培养基培养基(1)(1)完全培养基完全培养基(CM(CM，液体，液体)；(2)(2)完全培养基完全培养基(CM(CM，固体，固体)液体培养基中加入液体培养基中加入2.0%2.0%琼脂；琼脂；(3)(3)基本培养基基本培养基(MM)(MM)；(4)(4)补充基本培养基补充基本培养基(SM)(SM)在基本培养基中加入在基本培养基中加入20g/mL20g/mL的腺嘌呤及的腺嘌呤及2 2的的纯化琼脂，纯化琼脂，75Pa75Pa灭菌灭菌20min20min；(5)(5)再生补充基本培养基再生补充基本培养基(SMR)(SMR)在补充基本培养基中加入在补充基本培养基中加入0.5mol/L0.5mol/L蔗糖，蔗糖，1.01.0纯化琼脂作上层平板，纯化琼脂作上层平板，2.02.0纯化琼脂作底层平板、纯化琼脂作底层平板、75Pa75Pa灭菌灭菌2020minmin。(6)(6)酪蛋白培养基酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用测蛋白酶活性用)。四、实验过程（一）实验材料：（一）实验材料：5 5、促融合剂促融合剂促融合剂促融合剂 4040聚乙二醇聚乙二醇(PEG-4000)(PEG-4000)的的SMMSMM溶液。溶液。6 6、溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液 酶粉酶活为酶粉酶活为4000u/g4000u/g，用，用SMMSMM溶液配制，终浓度为溶液配制，终浓度为2 2mg/mLmg/mL，过滤除菌备用。，过滤除菌备用。7 7、器皿、器皿、器皿、器皿 养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、吸管、显微镜、台式离心机、721721比色计、细菌过滤器。比色计、细菌过滤器。四、实验过程（一）实验材料：（一）实验材料：3 3、缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 (1)0.1mol/LpH6.0(1)0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。(2)(2)高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8mol/L0.8mol/L甘露醇。甘露醇。4 4、原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液(SMM)(SMM)0.5mol/L0.5mol/L蔗糖、蔗糖、20mol/LMgC120mol/LMgC1、0.02mol/L0.02mol/L顺丁烯二顺丁烯二酸，调酸，调pH6.5pH6.5。四、实验过程（二）原生质体融合育种流程：（二）原生质体融合育种流程：检出融合子检出融合子检出融合子检出融合子制备制备制备制备原生原生原生原生质体质体质体质体促融合促融合促融合促融合高高渗渗选择选择选择选择亲本亲本亲本亲本化学融合、电融合反复原生原生原生原生质体质体质体质体再生再生再生再生遗传遗传标记、标记、选择选择性培性培养基养基融合子融合子融合子融合子筛选筛选筛选筛选破壁破壁破壁破壁四、实验过程（三）实验过程（三）实验过程1、选择亲本选择亲本选择两个具有育种价值育种价值并带有选择性选择性遗传标记遗传标记的菌株作为亲本。2 2、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备（1 1）培养枯草芽孢杆菌）培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株取亲本菌株T4412T4412、TT2TT2新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基养基(CM)(CM)的试管中，的试管中，3636振荡培养振荡培养14h14h，各取，各取1mL1mL菌液转接入装有菌液转接入装有20mL20mL液体完全培养基的液体完全培养基的250mL250mL锥形瓶中，锥形瓶中，3636振荡培养振荡培养 3h3h，使细，使细胞生长进入对数前期，各加入胞生长进入对数前期，各加入25u/mL25u/mL青霉素，使其终浓度为青霉素，使其终浓度为0.3u/mL0.3u/mL，继续振荡培养，继续振荡培养2h2h。（2 2）收集细胞）收集细胞各取菌液各取菌液10mL10mL，4000r/min4000r/min离心离心10min10min，弃上清液，将菌体悬浮，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10mLSMM10mLSMM中，中，每每mLmL约含约含108108109109活菌为宜。活菌为宜。四、实验过程（3 3）总菌数测定：）总菌数测定：各取菌液各取菌液0.5mL0.5mL，用生理盐水稀释，取，用生理盐水稀释，取10-510-5、10-610-6、10-710-7各各1mL(1mL(每稀释度作两个平板每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，、倾注完全培养基，3636培养培养24h24h后计数。后计数。此为未经酶处理的总菌数。此为未经酶处理的总菌数。（4 4）脱壁：）脱壁：二株亲本菌株各取二株亲本菌株各取5mL5mL菌悬液，加入菌悬液，加入5mL5mL溶菌酶溶液，溶菌酶溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为浓度为100ug/mL100ug/mL，混匀后于，混匀后于3636水浴保温处理水浴保温处理30min30min，定时取样，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当镜检观察原生质体形成情况，当95%95%以上细胞变成球状原生质体时，以上细胞变成球状原生质体时，用用4000r/min4000r/min离心离心10min10min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于将原生质体悬浮于5mL5mL高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。四、实验过程（5 5）剩余菌数测定：）剩余菌数测定：取取0.5mL0.5mL上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取质体裂解死亡，取10-210-2、10-310-3、10-410-4稀释液各稀释液各0.1mL0.1mL，涂布于完全培养基平板上，涂布于完全培养基平板上，3636培养培养242448h48h，生长出的，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。质体形成率。原生质体形成率未经酶处理的总菌数一酶处理后剩原生质体形成率未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数余细胞数四、实验过程四、实验过程3、原生质体融合、原生质体融合 取两个亲本的原生质体悬液各取两个亲本的原生质体悬液各1mL1mL混合，放置混合，放置5min5min后，后，2500r/min2500r/min离心离心10min10min，弃上清液。于沉淀中加入，弃上清液。于沉淀中加入0.2mLSMM0.2mLSMM溶液混匀，再加入溶液混匀，再加入1.8mLPEG1.8mLPEG溶液，轻轻溶液，轻轻摇匀，置摇匀，置3636水浴保温处理水浴保温处理2min2min，2500r/min2500r/min离心离心1010minmin，收集菌体，将沉淀充分悬浮于，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2mLSMM2mLSMM液中。液中。四、实验过程4、原生质体再生、原生质体再生 用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)(SMR)作作底层，取底层，取0.5mL0.5mL原生质体悬液，用原生质体悬液，用SMMSMM作适当稀释，取作适当稀释，取10-310-3、10-410-4、10-510-5稀释液各稀释液各1mL1mL，加入底层平板培养基的，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，3636培养培养48h48h。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平。分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数。均数。四、实验过程5、检出融合子、检出融合子 取取0.5mL0.5mL融合液，用融合液，用SMMSMM液作适当稀释，取液作适当稀释，取0.1mL0.1mL菌液与灭菌并冷却至菌液与灭菌并冷却至5050的再生补充基本的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，基本培养基的平板上，3636培养培养2d2d，捡出融合子，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。转接传代，并进行计数，计算融合率。四、实验过程6 6、融合子的筛选融合子的筛选融合子的筛选融合子的筛选 挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合挑选蛋白酶活性高于亲本的融合 子。由于原生质体融合后会出现两种子。由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种只发生质配，而无核配，形成异核体。两者都能在再生基本只发生质配，而无核配，形成异核体。两者都能在再生基本 培养基平培养基平板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定。故在传代中将会分离板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定。故在传代中将会分离为亲本类型。所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和为亲本类型。所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和选择。选择。五、影响细菌原生质体融合的因素五、影响细菌原生质体融合的因素PEG作融合剂时，影响原生质体融合的因素很多：如PEG分子量与浓度、分子量与浓度、pH值、离子种类值、离子种类与浓度、与浓度、PEG作用时间、温度、原生质体作用时间、温度、原生质体纯净与否、培养条件、酶解制备原生质体纯净与否、培养条件、酶解制备原生质体条件条件等对融合率都有一定的影响。六、六、应用进展应用进展1 1 1 1、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育2 2 2 2、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育3 3 3 3、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育4 4 4 4、益生菌的改良、益生菌的改良、益生菌的改良、益生菌的改良5 5 5 5、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育6 6 6 6、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育7 7 7 7、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育8 8 8 8、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育9 9 9 9、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育七、意义及展望同转化、接合、转导、杂交和转染等传统基因重组方同转化、接合、转导、杂交和转染等传统基因重组方式相比较，细菌原生质体融合具有广泛式相比较，细菌原生质体融合具有广泛适应性适应性和和随机性随机性：1 1、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合；、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合；2 2、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会；、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会；3 3、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状；、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状；4 4、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种；、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种；5 5、能够用于遗传分析等基础理论研究等。、能够用于遗传分析等基础理论研究等。七、意义及展望细菌原生质体融合育种技术不但可以细菌原生质体融合育种技术不但可以改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。出美好的应用前景。