时间分辨光谱学讲义.pdf

实验三：时间分辨光谱学实验三：时间分辨光谱学 摘要摘要 在这一实验中你将直接监控溶液分子和这些分子转动中的电子能量转移。除了采用稳态荧光光谱外，纳米时间分辨荧光测量法也将用来完成这些实验。实验目的：1.测定溶液中含给予体和接受体的染料分子溶液的荧光淬火，并与福斯特能量转换理论作比较。这一过程通常称之为 FRET 2.用时间分辨测量法监控溶液中重定位分子的运动。这种方法适用于用斯托克斯爱因斯坦德拜理论测定染料分子的有效分子体积。3.使用你自己装配的虚拟科学仪器 4.用商业的数学软件包发展自己的数据分析程序 注意：在激光实验前，对实验方法要有所了解，对大量数据要进行分析。最基本的要求是在开始本实验前要阅读本文，理解材料内容。此外还需要事先阅读推荐参考文献。注意：在激光实验前，对实验方法要有所了解，对大量数据要进行分析。最基本的要求是在开始本实验前要阅读本文，理解材料内容。此外还需要事先阅读推荐参考文献。.背景背景 A 时间分辨法介绍时间分辨法介绍 多年来，对于化学过程，特别是化学反应速率一直是研究领域中活跃的区域。注意注意：这些材料描述的实验具有潜在的危险性。需要高水平的安全训练，特殊的仪器设备，以及适当的人监督。你承担所有的责任、义务、以及执行这些安全程序措施带来的风险。MIT（麻省理工学院）将不承担材料中所介绍内容的带来的责任、义务及风险 麻省理工学院麻省理工学院 化学学院化学学院 5.33 高等化学实验高等化学实验 2003 下学期下学期 设想一个简单的分解反应：BkA。速率 k 可以简单地通过测定 A 的消耗量（或 B 的生成量）来求得。，根据测定体系中 A（或 B）含量所花的时间可测定反应最大速率。举例来说，你无法用一个耗时 15 秒才能测定 A 含量的仪器来测量1000s-1 的衰退速率。这样的仪器只能测出 15 秒之后的 A 物质的量。考虑一个更物理化的例子。这一例子与我们要做的实验有关。大家应该熟悉edgerton 教授的摄影。他拍摄了高速运动物体的清晰照片，如子弹穿过香蕉等。（如果不清楚，在麻省理工的博物馆中有几幅照片，一定要去看看）当你感兴趣的事情发生时，利用闪光灯，使胶卷在非常短的时间内曝光，就能得到这样的照片。如果想得到 1mm 的分辨率，闪光灯的时间就必须小于子弹飞出 1mm 的时间。否则图像就会变得模糊。在这一实验中，我们将测量能量从一个激发的染料分子（给予体）跃迁到另一个分子（接受体）的速度。这一过程仅仅只需要 500 皮秒（ps=10-12s）。用激光脉冲激发分子，再采用快速荧光检测器测定能量转移的速率。从前面的讨论中我们可以知道，脉冲的周期必须小于几百皮秒，检测器也必须具备相应的速度。B 溶液中染料分子的电子光谱学溶液中染料分子的电子光谱学 染料分子吸收可见光及紫外线导致跃迁至第一电子激发态，S1。这一跃迁的能量是 104105cm-1*(*单位 cm-1或波数，用于取代焦耳。波数是光的波长的倒数。与能量转换的关系表现为方程/hcE=)电子激发的过程（如图 1 中的 a）非常快（小于1015秒或一皮秒），以致于核在这一过程中并没有改变位置。因为新的电子结构会引起新的平衡核结构，所以激发还伴随着振动激发。振动驰豫和新的激发态溶质分子的重组会消耗了多余的能量。这些无辐射的驰豫过程会迅速平衡激发态（10-1310-12s，或 0.11 皮秒），大约会耗费能量 102103cm-1（热能）这一过程在图一中表示为 b。一旦体系处于激发态的势能最小点，它将通过释放大量能量返回基态，能量值大于104cm-1。由于基态和激发单重态之间具有较大的能量差异，所以能量不容易以热能这种无辐射形式消耗掉。最可能的驰豫机制是通过荧光，通过荧光，被激发的分子发射一种光场（c）。部分激发态分子通过荧光返回基态（与其他途径相反）的荧光量子产率，D。用荧光法测量弛豫的时间荧光的寿命通常比初始时间大得多（10-1010-8s，0.11ns）。由于振动弛豫过程在激发之后，而且也由于激发态的原子核的位移，荧光的发射波长通常大于吸收。溶液中观测到的吸收和荧光光谱表现出典型的镜像对称性，并且光谱峰出现分离，2，被称之为斯托克斯位移。图一：溶液中染色分子的电子态。吸收光（a）导致电子跃迁至第一激发态。这一跃迁伴随着快速驰豫（b）至一新的扩张的电子核结构。发出荧光后（c）系统回到基态。荧光频率低于吸收频率。它表示吸收过程中通过振动弛豫消耗掉的能量值。荧光光谱法是一种用来探察电子结构及电子激发态动力学的方法。对气相分子，荧光光谱（荧光强度作为频率函数）与分子的量子力学电子结构有关。在溶液中，光谱不具备特征性，但荧光是测量电子激发态动力学的有力工具（含时行为）。荧光的强度 If与激发态分子数量 N 成正比。N 的数值随着分子返回激发态而改变：)()(tNtIf （1）因此通过观察样品发射的随时间变化（通常只有几纳秒）的荧光强度可以直接测量弛豫速率。激发态的一阶弛豫速率方程为：（2）可知荧光强度随着荧光衰减速率 Kf呈指数下降)exp()(0tkItIf=（3）f1/kf指的是荧光强度减至（1/e）I0时的荧光寿命需。图 2 是一个时间分辨荧光衰减的例子。实验实验 A.用于瞬态和稳态测量的荧光计用于瞬态和稳态测量的荧光计 助教（TA）能帮助你熟悉光学设备，指示你如何使用示波器和电脑来获取数据。荧光计由一个激发臂和一个检测臂组成。激发臂发出激励光激发给予体分子，检测臂检测样品发出的荧光。所有的荧光测量都由 4470 室的激光激发源来完成，如图 4 所示。激发光束为一小 Nd：YAG（NeodymiumdopedYittrium 图 2：时间分辨荧光衰减 Aluminum Garnet）激光，产生的脉冲光大约为 600ps 长，波长为 532nm。激光每隔 200us 发射出脉冲光（5 Hkz 的重复率）。当此光聚焦在样品之前，有一个起偏器垂直地对光偏振。在与激发光垂直 90 度的方向收集样品发射的荧光。测量臂中的起偏器允许平行（）或垂直（）的偏振荧光通过。透镜将荧光映射在检测器上，滤波器把剩余的激发光或不需要的荧光频率屏蔽掉。瞬时荧光测量法所用的检测器是一个快速光电二极管，时间分辨率大约为500ps。它能测量给定时间间隔内样品发出的荧光强度。时间分辨率为 400ps 的示波器可测量光电二极管中的信号。示波器的轨迹由激光头发出的脉冲发射。这一设备所有的时间分辨率是由脉冲长度、检测器速度、示波器速度决定，大约为（6002+5002+4002）ps870ps。实践中，你可以通过把少量的激发光发射入检测器直接测量此值。对于稳态激光光谱测量法，荧光被聚焦在分光计的狭缝处。分光计里的光栅把荧光发散，进入阵列检测器，检测器能看到样品发射的从可见到近红外范围的所有的荧光光谱。对每一检测器，把检测头(head)大致放在荧光聚焦处，然后使用千分尺调节检测器的位置，使信号最大化。检测器的响应处于平直的顶部说明检测器达到饱和，应该减小激发强度或插入中性密度滤波器以减弱荧光信号。B.激光安全性激光安全性 新实验室正在装备一个高密度固态激光光源。其他的有关激光的一些危险化学和能源供应不是本实验所关心的问题。然而，这种细小激光源发出的光对于进入激光使用中的实验室的任何人而言仍然具有潜在的、严重和永久性的伤害。这并不是我们惧怕激光的原因，但却是我们重视激光的主要原因。即使只是光束的一部分直接射入眼睛也可能会对眼睛造成无法挽回的伤害。所以，在激光周围工作时，必须具备一些基本常识。做本实验时在储存间必须检查的实验所需的特制激光安全护目镜。这种护目镜有两个不同的滤波器，因为在这房间里有两种不同的颜色 图 4：用于瞬态和稳态的荧光计示意图 或波长的光。激光护目镜上的一个滤波器可以屏蔽激光头发出的、肉眼无法看见的少量红外光，另一个滤波器可以屏蔽肉眼明显可见的绿光。因为本实验里使用绿光，而它不能被完全除尽，所以用此镜保护眼睛不受绿光伤害。助教尤其要小心，要保证所有的光束都保持在光学工作台的水平方向（也就是说，当你站着的时候，没有光束会朝向你的双眼）。不要把肉眼与激光束置于同一水平面，所以当你弯腰拾起掉落在地板上的物品时要紧闭双眼。随时随地戴上护目镜。如果严格遵循了这些原则，就能确保受伤害的危险性最小小。本实验中我们所测定样品荧光是没有危险性的。可以不用取下护目镜，完成本实验（包括把荧光导入检测器和对信号最优化）。如果你对与激光工作感觉不适，把干扰你工作的细节问题告诉助教，他们将对激光安全问题与你做更详尽的讨论 .能量转移能量转移 A.背景背景 对于一个孤立的处于电子激发态的分子来说，弛豫的机制主要是辐射，即在返回基态的过程中发出的分子荧光。这种辐射机制同样适用于被大量溶剂分子包围着的染料分子的稀溶液。但浓度更大的溶液还存在其它的弛豫途径，如染料分子间相互作用引起的弛豫途径。当分子间距离在 10100，一个分子中处于激发态的电子运动能给另一个分子施加一个库仑力，这使得激发从一个分子“跳跃”至另一个分子。设最初处于激发态的分子为给予体（D），能量跳跃所至的分子为接受体（A）。这一过程，就被称为能量转移，如下所示 *号表示电子激发态。因此，给予体返回基态伴随着接受体受激发至激发态，然后荧光接受体最终也返回基态。对这一过程完整的描述是量子力学（例如，Forster或 CohenTannoudji），但是经典模型能够为我们建立这一过程的物理图形提供所需的大多数信息。一个最简单的描述就是两个弹簧振子（把给予体和接受体当作弹簧连接的物体），这两个振子通过弹簧连接在一起。把其中一个振子从平衡位置移开，会导致第二个振子振动，其振动的速率与连接这两个物体的弹簧的力常数成正比。附录 1 中描述了更多的细节。导致能量转移的库仑作用是一种偶极偶极相互作用，它与传送天线和接受天线之间的关系相似。如果两个偶极（或天线）之间的距离为 R，相互作用的强度（势能）为 1/R3。你可以回顾物理化学书，例如 Atkin（见参考文献），或普通物理课本中的偶极偶极相互作用。福斯特（见参考文献）发展了一种接受体和给予体偶极的能量转移理论，指出从给予体到接受体的能量转移速率与 1/R6成正比：D 是孤立的给予体分子的荧光衰减时间。在福斯特理论中的基本物理量是R0，即临界转移距离。如果一个给予体和一个接受体之间的距离为 R0，那么处于电子激发态的给予体分子通过荧光弛豫的可能性和其通过能量转移至接受体从而达到弛豫的可能性一样大。公式 5 表明如果 RR0，能量转移的速率会迅速的改变，R0通常在 10 到 100 之间。所以，如果已知 R0，能量转移速率的测量法可用做分子水平的距离测量（一种分子直尺）。福斯特的 R0可由一些实验观测值来计算。fD为给予体的荧光光谱，A为接受体的吸收光谱，JDA是重叠积分，它表示光谱重叠的程度。这一积分表示，给予体发射和接受体吸收之间必须存在共振才能发生有效的能量转移。v 表示以波数为单位（cm-1）的频率。荧光光谱必须标准化到单位面积的，以便 fD（v）为 cm1/(cm-1)。吸收光谱必须用十进制的摩尔消光系数表示（liter/mol cm=(M cm)-1）,根据比尔定律 AA（v）lC,A 是吸光率或光学强度，A（v）是一定频率下的摩尔消光系数，C 是浓度，l 是光程长度。n 为溶剂的折光指数，N 为阿弗加得罗常数。2是反映电子偶极相对方向的常数,对于转动速率快于分子能量转移速率的分子来说，2值为 2/3。D 是给予体荧光量子产率。由于 R0的单位是 cm，公式 6 通常也写为：对于溶液中染料分子而言，R0通常为 10100，能量转移的速率 kDA（0.11ns-1），通常和浓度约为 10-3M 的接受体溶液的荧光速率相似。在这一界限（10100）内，处于电子激发态的给予体有两种有效的衰减途径：荧光和能量转移至给予体。对于明显分开的给予体和接受体分子而言，荧光和能量转移速率之和可作为呈指数衰减的荧光速率。在溶液中，由于存在给予体接受体的距离分布，这将就使得问题更加复杂（见下）。正如公式 6 所示，能量转移最重要的条件是共振。给予体的荧光光谱代表了激发的给予体偶极的振动频率。它必须和从基态跃迁至激发态的接受体的电子转移频率（也就是吸收光谱）相匹配。重叠积分 JDA的大小代表频率匹配的程度。如果激发态给予体和基态接受体之间不存在共振，能量转移就不可能。因此，能量转移机制通常被称为福斯特共振能量转移（或 FRET）共振和振动弛豫表明 FRET 是一个能量下降过程。给予体的荧光频率低于给予体的吸收频率。同样地，一旦能量从给予体转移到接受体，被激发的接受体的振动弛豫会消耗掉比初始激发能更多的能量，以保证能量不会跳跃回给予体。在给予体的浓溶液中，给予体荧光和吸收光谱的部分重叠允许能量在通过其他途径弛豫之前，从一个给予体分子跳跃至另一个给予体分子。此外，两个电子态之间的相互作用造成了多种能量转移途径：FRET，交换相互作用，辐射耦合。辐射耦合，有时候被认为是次要的机制或两步机制：给予体荧光发射和随之的接受体的荧光吸收，。这种机制取决于样品长度，出现在分子间距离长或者说稀溶液里。交换相互作用需要给予体和接受体轨道的电子态相互重叠，因此此作用只能在短距离内有效。更多的解释见 Birks 或 Fleming 共振能量转移是光合作用和光捕获（见参考文献）中极其重要的过程。植物和光合作用的细菌利用大量叶绿素和类胡萝卜素排列成近似环状的结构，吸收光并让激发能通过能量转移过程进入反应中心，最初的光合电荷分离结果发生在此反应中心。在光捕获排列中，类胡萝卜素和最外面的叶绿素吸收最高能量的光，把这些光通过一个泻落的过程转移至其他靠近中心的具有较低能量的叶绿素。不同叶绿素分子的蛋白质环境变化使得在此序列的叶绿素给予体和吸收体的光谱重叠。反应中心自身就是具有更低的吸收能量的叶绿素分子。能量转移测量现在更多用作溶液中的分子尺，比如可用作测量蛋白质中氨基酸残基和辅基之间的距离。在实验的第一部分，我们将测量染料溶液中给予体和接受体分子的能量转移。我们将通过配置给予体的稀溶液和不同浓度的接受体溶液，由此来改变给予体分子和接受体分子之间的平均距离。采用时间分辨荧光法和稳态荧光法测定这些溶液的临界转移距离 R0。对于这些溶液，接受体分子随着给予体分子数量（浓度）的变化而呈现统计分布。由于任一给予体/接受体对的能量转移所引起的给予体个数的减少（按照公式 5所给出的速率而减少），使得给予体/接受体距离发生改变，正如能量转移速率一样。在这样的溶液中要获得给予体的含时个数，必须把能量转移的速率在所有的 R 进行平均。这种总体平均给出了一个激发态分子的含时衰减的表达式，也就是含时荧光测量：这里的 nA是接受体分子的数目密度。注意，给予体衰减有两种方式：给予体发出荧光或能量转移至接受体。给予体荧光衰减通常呈指数衰减，而能量转移则是以时间平方根的指数衰减。公式 8 表示可以通过研究不同接受体浓度的溶液来正确获得 Ro。从公式 8 中同样可以得到接受体瞬时荧光衰减。接受体的荧光将随着给予体荧光寿命衰减而降低，但随给予体到接受体的能量转移速率（见公式 8 的第二项）增加而增加。这些公式在福斯特的原著和 Fleming 中有详细描述。通过稳态荧光法测定处于不同浓度接受体溶液中的给予体的荧光光谱也可获得 R0值。随着接受体浓度增加，能量转移至接受体的速率增加，给予体荧光衰减速率也增加，给予体的荧光强度总体上减少。随着溶液中接受体浓度 C 的改变，可以测得给予体中的荧光强度 ID，并与没有接受体分子的溶液的荧光强度 I0相比较。福斯特提出的浓度关系如下所示：在这里，xC/C0,C0 是临界转移浓度，代表了接受体的浓度。总的来看，每一个接受体分子都处于以给予体分子为中心、半径为 R0 的球体范围中。误差函数 erf（x）通常用作统计分析，大部分的数学软件包都有此函数，而且被广泛地制成了表格形式。由于稳态测量方法不能有时间限制，因此具有一定的局限性，例如再吸收的贡献很难被修改（见 Birks）B.能量转移的实验测量能量转移的实验测量 概要和目标概要和目标：FRET 法将用于染料溶液中的给予体和接受体分子。通过使用时间分辨荧光法和稳态荧光法测定这些溶液可获得临界转移距离。测定的 R0 值将同公式 6 中计算值进行比较。要研究 FRET 的机制，我们应该了解随给予体分子数目（浓度）改变而引起的接受体分子的统计分布。通过配置给予体的稀溶液和不同浓度的接受体溶液，我们可以改变给予体和接受体分子之间的平均距离。1）给予体给予体/接受体光谱重叠接受体光谱重叠 在测定能量转移之前，需要计算给予体和接受体对的临界转移距离。给予体分子为R6G（见表 1），接受体分子为 NB 或用 MG 替代。分别配置这些分子的乙醇稀溶液，并测定各自的吸收光谱和荧光光谱。利用 4472 室的紫外可见分光光度计测定吸收光谱。一定要用十进制摩尔消光系数（liter/mol cm）表示吸收光谱。荧光光谱用前面所述的荧光计测得。R6G 作为给予体，吸收 532nm 处的激发光。接受体应和给予体的荧光有良好的吸收重叠（接受体在 532nm 附近吸收应该最小，为什么？）图 5 给出一个给予体荧光/接受体吸收重叠的例子 根据给予体荧光光谱和接受体吸收光谱，利用公式 6 计算 R0。第一步计算光谱重叠积分，可采用多种方法进行重叠积分计算（思考一种你自己的方法）。但最 图 5：给予体荧光/接受体吸收重叠的例子 表 1：用于给予体/接受体的染料分子 简单的方法是使用梯形近似或电子数据表中辛普森法的数值积分法。值得推荐的方法是用 matlab 编写的程序（Athena）来计算 R0，这对后面的计算也会帮助。附录 2中有一个描述 了所有重要步骤的 matlab 程序，如果你正在研究此法，可以试着使用。要运行此程序，你必须按如下所述去做：（a）把实验所得的给予体吸收光谱和接受体荧光光谱转化为以波数为单位的频率（cm-1）（b）然后根据吸收测量中的接受体浓度和光程长度，根据比尔定律把吸光率转化为十进制地摩尔消光系数（c）标准化荧光光谱振幅，使数字积分的区间变成一致的。（d）根据这两个光谱，计算重叠积分 JDA。由于实验数据套有不同的频率轴，所以需要作一些修正来使它们一致。你可以从参考文献中提到的在线资源中找到一些常用给予体的量子产率（通常的是 0.50.9）。现在，用公式 7 计算 R0，利用 R0和公式 10 再计算 C0。我们将测量以浓度 C0为中心的一系列接受体溶液的能量转移。制备约十份乙醇溶液，其中给予体浓度约为10-4M，接受体浓度范围从 0.02C0到 2C0。浓度变化的范围越宽，分析的结果就越精确。保持给予体浓度不变，最好低于 10-3M，否则给予体给予体之间的相互作用会变得重要。2）瞬时荧光测量法瞬时荧光测量法 瞬时测量法是由一个快速光电检测器检测样本的发射光。检测器的输出值由一个快速数字示波镜测量，它在计算机读取之前对荧光数据进行平均。助教会示范这些实验所用的光学排列，示波镜和计算机中取样软件的使用。a）检测器响应。综上所述，实验中的瞬时检测法的时间分辨率由几个要素构成。要测量仪器响应（它代表能够观测到的最快动力学的时间尺度），用一张纸把一些激发光驱散到检测器。用中性密度滤波器把示波镜上的信号减小至低于500mV。观察到的瞬时现象就是仪器响应。要测量与响应时间范围内的荧光衰减，去卷积是必要的。附录 3 讨论了在必要情况下用有限时间分辨法对数据去卷积。如果你测量高浓度的接受体溶液或作实验的第二部分，去卷积是必要的。b）测量染料溶液的荧光衰减。对前面已配好的每一个给予体/接受体溶液，测量给予体的瞬时荧光衰减。把样品放入固定臂，利用调焦镜头把荧光瞄准检测器。在检测器前，插入一个带通过滤器，只允许给予体荧光波长通过。同样可插入一个桔黄色的玻璃滤波器，以消除任何发散的泵光。对荧光产生到完全衰减时间内的示波镜上的荧光信号进行平均化。不改变检测臂的光学排列测量所有的溶液 如果时间允许，用一个只允许样品中接受体荧光波长通过的红带滤波器取代带通滤波器，测量相同溶液中 NB 接受体分子荧光的增加和衰减。（不用检测 MG，因为它的弛豫几乎没有辐射。）3）稳态荧光测量法）稳态荧光测量法 通过电脑取样的小分光计来检测发散的荧光，就可完成稳态荧光测量。把一个给予体溶液（无接受体）放在样品固定器上，与荧光监测器排成一行。用聚焦镜头聚焦在分光计的狭缝上，通过电脑最大化实时荧光信号。去掉带通滤波器或红通过滤波器。如果分光计达到饱和，用中性的滤波器削弱光强度。一旦排列好，不改变检测臂的光学和队列，收集给予体分子及所有的给予体/接受体溶液的荧光光谱。4）数据分析）数据分析 这一部分实验目的是对 R0进行比较。（a）根据公式 6，计算光谱重叠积分，得到的 R0（b）瞬时荧光测量法所得 R0（c）稳态荧光测量法所得 R0。并且包括对各种方法得到的 R0进行评价。在你的报告里应当有这三种方法的细节。下面的一些讨论可能对数据分析有用。1.光谱重叠积分所得 R0。这一方法在第二部分 C.I.中讲过。附录 2 有一个标有详尽注释的 matlab 程序，它可根据荧光数据文件和十进制摩尔消光系数A来计算光谱重叠积分和临界转移距离。在计算 R0之前，可能需要对输入数据套进行一些修正，比如基线校正。2.稳态荧光测量法中得出的 R0。给予体荧光的淬火同样适用于公式 9。首先整理光谱，减少外来数据或在必要情况下进行基线校正。在纯给予体溶液(无接受体)中测定给予体荧光的总强度，根据这一总强度对其它溶液的给予体荧光强度进行标准化。电子数据表、matlab（如同重叠积分那样），或其它软件包可以处理这种计算（如果你使用了电子数据表，那么对于 erfx，就需要使用多项式近似）。用 I/I0对C 作图以求出 R0。一个 R0（或 x 或 C0）值要通过所有数据点。可以使用最小二乘拟合程序来完成这一工作。最好的（也是被推荐的）方法是使用 matlab 之类软件包中的拟合程序。最低限度你可以使用电子数据表，对数据点和公式 9 的计算值作图，然后改变 R0值，以找出最小2值。（2值是测量值和方程 9 在 C/C0点的计算值差值的总合）。利用下列公式计算 95置信水平下 R0的不可靠性：公式里，S 表示 R0在 95置信水平下的不可靠性，N 为数据个数（使2最小化使用的给予体/接受体荧光光谱的个数）。关于误差分析更多的描述见附录 B。在你的实验报告里应该包含最终的 ID/I0对 C/C0图形（实际数据和理论曲线）。3.来自瞬时荧光衰减的 R0。公式 8 描述了随接受体分子的浓度变化而改变的瞬时荧光衰减，并且应该采用最佳拟合的形式对此荧光衰减进行分析。其基本思想和前面的一致：用拟合程序改变 R0的值，找出你自己的实际数据和公式 8 中给出的曲线的最佳拟合。同样地，有许多方法可用来完成这种拟合，你可以请教你的助教。这里有如何开始的说明：首先，删掉由于系统的时间响应引起的突跃，清理示波器上的信号，确保所有的信号基线都回到零。接着，标准化原始数据，使每一个给予体或给予体/接受体的信号有一个为 1 的最大值。可以通过左右移动数据，使这一最大值（最好为 1！）处于时间 t0 处。现在从给予体荧光轨迹上找出D值。D表示信号衰弱至荧光强度最大值的 1/e 时的时间。通过改变 R0去最小化2的方式来拟合不同浓度标准曲线和公式 8 计算值的关系。还有，计算 R0在置信水平为 95时的不可靠性（公式 15）。在实验报告中必须包含最终的 ID图（实际数据和理论曲线）。重定向运动重定向运动 A.背景背景 当一个分子处于电子激发态，电子在轨道间的迁移会导致分子的一个新电荷构型。分子电子云密度的改变，可以被认为是（形式上描述为）一个具有方位性的偶极（矢量）的产物。这种振动偶极本质上是一种天线或传导体发射出可见的荧光。由于偶极具有明确的方向性，因此，如果分子在发出荧光时旋转，我们认为荧光的偏振将随着旋转而改变。在实验的第二部分，我们将使用时间分辨荧光法测定溶液中染料分子的旋转。这种方法能即时观察到荧光的不同偏振组成。并能让我们知道溶液中分子旋转的平均速率。与气相不同，这类旋转不能用量子力学来处理。溶剂分子通过溶液粘度对分子施力，使得分子不能自由旋转。更确切来说，这一问题属于经典扩散之一（布朗运动）。溶质分子的位置由于溶剂分子推动而逐渐、随机地改变。液体中的球体旋转运动的理论要归功于德拜、斯托克斯和爱因斯坦（DSE）各自的工作。DSE 理论预测，如果能把溶液中一群分子排成一行，然后观察随旋转运动而随机改变的分子方向，这种队列会随着一个特征时间比例rot呈指数衰减：此外，rot与转动扩散常数 D 有关，而 D 与分子体积 V 和液体粘度有关：所以，如果能测出分子在不同粘度的溶液中的转动弛豫，就能得到 V（V 实际上是分子有效体积（或流体力学体积），通常略大于晶体结构的体积）。这一方法可以用来测定聚合体或蛋白质的螺层半径。我们可以通过改变乙醇/甘油的比例来改变粘度，测得rot，并由此测得染料分子的有效分子体积。怎样用荧光法来测定分子的重定向运动？在平衡溶液中，分子的方向是各向同性的在每一个方向上都是平等的。我们需要用一种方法来打破这种各向同性（引进不等性），并观察体系怎样回到平衡状态。我们可以使用偏振光来激发染料分子，然后观察样本发出的荧光的偏振。实验装置中的起偏器让激发光在进入样本前向垂直于桌面的方向偏振（电磁场振动方向），由于电磁场振幅是具有方向性的，排列在这一偏振方向上的分子将优先被激发。如果这些优先垂直排列的分子，在没有旋转时发射荧光，那么这种荧光也会优先垂直偏振。另一方面，如果分子在发出荧光前转动，荧光的偏振将会有一个水平的成分。所以，如果我们在检测器前面放一个起偏器，只让垂直方向的偏振荧光通过，测定荧光的弛豫，信号将随rot衰减。反之，如果起偏器只让水平偏振光通过，荧光信号将随rot增加。检测的几何构型分别是水平方向和垂直方向的的。当然，衰减也会受到荧光寿命的影响，荧光寿命不会随作起偏器定位而变化。如果我们测出在水平结构I(t)和垂直结构I(t)上荧光的衰减，就能通过含时的各向异性来删除荧光寿命这项：各向异性只作为转动弛豫时间的函数而衰减 这类测量法将在第六章 Fleming 中讨论。图 3 中给出了这类测量法的一个例子，显示了个体扫描和计算的各向异性。注意，当转动弛豫略快于荧光衰减，每一个衰减的尾端（当重定向完成）几乎能够相互重叠。B.重定向运动的实验测量法重定向运动的实验测量法 观察一个若单明 6G 稀溶液（10-510-4M）的瞬时荧光性。配制一系列甘油与水不同比例的溶液（甘油与水的重量百分比为 10020）。把一个起偏器放在快速光电检测器前，使偏振方向垂直于桌面，然后再水平于桌面。除了偏振方向的改变外，不改变其他任何条件，测定两种荧光衰减。长时间观察两个衰减的匹配，重复观察几个样本。计算每种溶液的各向异性（公式 13），根据各向异性的变化得到指数rot（公式 14）。根据溶液粘度，将rot的数值代入公式 12，以求得有效分子体积 V。粘度可以从表 2 的数据推算。图 3：平行（虚线）和垂直（散点线）荧光衰减曲线及计算所得各向异性 表 2：水甘油溶液粘度系数.参考文献参考文献 以下是参考文献列表（既有必修的也有专业的），它们将有助于理解和解释本实验。*表示理解实验所必须的文献。+表示保留文献。以下是两个可以获得染料分子数据的在线参考：附录一附录一 双耦合振荡器双耦合振荡器 如果溶液受到合适波长的光照射。溶液中一部分染料分子将会被激发至电子激发态。激发态分子弛豫的两种主要途径之一为荧光，通过这一途径，受激发的染料分子释放出一个光子并回到基态，然后与处于基态的另一个染料单体相互作用。第二种弛豫途径更快速，应当首先考虑它的作用。少数被激发的给予体分子被大量的未激发的接受体分子包围在内。虽然这些染料分子是电中性的，但电子的运动将对分子产生库仑力的相互作用，。这种相互运动的结果驱使激发态能在给予体和接受体之间“跳跃”。要充分描述这种相互作用是怎么导致激发态的跳跃和为什么会导致激发态的跳跃，就有必要从量子动力学上解释相互作用的电子动力学行为。（见CohenTannoudji 等所著课本（1977）中的重型量子力学）为了对这一过程有一个物理上的认识，我们用一个简单的经典模型来理解在类似系统中的能量跳跃，但是要记住，分子激发态转换交互作用在细节上是有所不同的。假设一个弹簧系统，如图 1 物体1 代表给予体分子，物体2 代表接受体分子，弹簧3 代表这两个分子之间的相互作用。我们必须认识到，这是对分子间运动彻底的简单化，但这一模型仍然可以给出一些能量转移的基本物理。如果推动物体1 使其处于运动中，物体2 就无法在物体1 摆动的同时保持固定不动。图 3 显示了这两个物体随时间变化的位移。物体1 和物体2 的位移在图 2 中分别以实线和虚线表示。可以看出，在物体1 摆动逐渐减弱的同时，物体2 的摆动逐渐增大。当物体1 基本上不动时，物体2 的位移达到最大值。体系的能量在物体1 和物体2 的摆动中反复前后摇动。对这一模型的数学处理见附录 B。附录 B 中显示了能量从一个物体到另一个物体的频率与 k成正比，k为连接两个物体的弹簧的弹簧常数。推动物体1 与用光激发一个给予体分子类似。给予体保持激发态的时间与被激发的给予体分子和邻近的基态接受体分子之间的相互作用强度成反比。然后，激发态跳跃至接受体，就像前面例子所述，摆动从一个物体跳跃至另一个物体。给予体分子从最初的激发态返回至基态，激发态跳跃至接受体，接受体跃迁至第一激发态，这一过程就被称为能量转移。附录 2 由 Joshua Vaughan 授权使用 附录附录 2用用 matlab 计算谱图重叠的计算谱图重叠的 R0 这一程序由这一程序由 Joshua Vaughan 于于 2000 年秋编写年秋编写 附录附录 3-卷积卷积 对高浓度溶液染料溶液，荧光衰减速率的测定变得更加困难。我们使用的是时间分辨率接近 0.8nm 的光电探测器，当我们试图测定的有效荧光衰退时间接近这一值时，探测器得不出真实数据。实验观测值由探测器时间分辨率和荧光衰减时间标度共同决定。更确切的讲，一次实验测量就是一个由仪器响应 R(t)探测器时间分辨率和样品响应 S(t)荧光衰减所构成的积分。我们把信号相应的荧光强度称为一个卷积积分：从本质上来说，荧光衰减总量可从检测器响应图上得到。当荧光衰减比检测器响应快得多时，S(t)接近 delta 函数，我们只能看到检测器的响应。当检测器比荧光衰减快得多时，R(t)接近 delta 函数，我们的信号纯粹就是荧光。当它们以相似的时间标度存在时，通过比较荧光数据和仪器响应，我们仍能从衰减过程中获取信息。假设我们运用宽度为 的高斯函数模拟检测器的时间分辩率：用衰减时间为 的指数函数模拟荧光衰减 计算卷积积分（以及衰减常数），我们得到 在这里，erf(x)是个误差函数，它在大多数数学软件包里是一标准函数。(erf(0)=0;erf()=1)。这对我们的实验有何意义？假设我们在响应宽度为和有效衰减常数为的条件下处理，荧光衰减，结果会怎么样。上面这些线性和半log图形比较了在/值为0.1到3条件下计算的卷积积分，和指数衰减（虚线）。对于小的，我们只观察到指数弛豫，但当变大时，观察到的信号接近检测器响应，我们得不到一个确切的值。在另一个对比中，我们从=3，和0.3时的测量信号来获得荧光指数衰减（虚线）。很明显，=3时得不到一个有意义的测量值，但通过测量=3时的尾部弛豫能推断出其它情况下的衰减信息。（注意，我们也可通过测量信号峰与检测器响应峰的位移来获得衰减时间的一些信息）。