圆二色技术及其应用.pdf

圆圆圆圆二色二色二色二色技术及应用技术及应用技术及应用技术及应用Circular Circular DichroismDichroism/CD/CD一 序言二 基本原理三 圆二色仪四 氨基酸和肽的圆二色性五 圆二色技术的应用一 序言二 基本原理三 圆二色仪四 氨基酸和肽的圆二色性五 圆二色技术的应用圆圆圆圆二色二色二色二色技术及应用技术及应用技术及应用技术及应用一 序言一 序言17世纪世纪,Huggens,偏振光偏振光1881年年,Biot,石英能使偏振光的石英能使偏振光的偏振面旋转偏振面旋转,1934年，年，Lowry,Optical Rotatory Power1953年，建立了第一台偏振光检测仪年，建立了第一台偏振光检测仪19世纪世纪60年代以后，圆二色仪出现年代以后，圆二色仪出现二 基本原理二 基本原理（一）几种偏振光的概念（一）几种偏振光的概念1 平面偏振光（平面偏振光（plane polarized light)又称线偏振光又称线偏振光(linearly polarized light)对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）（或磁场矢量）都是在同一方向振动。都是在同一方向振动。对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋（在平面上的投影为圆形）。电矢量方向沿逆时针方向旋转，称为左圆偏振光电矢量方向沿顺时针方向旋转，称为右圆偏振光对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的圆形螺旋（在平面上的投影为圆形）。电矢量方向沿逆时针方向旋转，称为左圆偏振光电矢量方向沿顺时针方向旋转，称为右圆偏振光2 圆偏振光圆偏振光平面偏振光左圆偏振光右圆偏振光平面偏振光左圆偏振光右圆偏振光3 椭圆偏振光椭圆偏振光对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋（对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）端点在空间的轨迹是以光传播方向为轴的椭圆形螺旋（在平面上的投影为椭圆形）。在平面上的投影为椭圆形）。4 自然光自然光对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）取所用可能方向，没有一个方向较其它方向占有优势。对着光前进的方向观察时，一束光波的电场矢量（或磁场矢量）取所用可能方向，没有一个方向较其它方向占有优势。振幅相等、角频率相等、相位相同左右圆偏振光合成线性偏振光参照面（二）几种偏振光的关系（二）几种偏振光的关系振幅相等、角频率相等、相位不同左右圆偏振光合成线性偏振光参照面12振幅不相等、角频率相等左右圆偏振光合成椭圆偏振光12aa振幅相等、位相差1/4波长两束线偏振光合成圆偏振光（二）光学活性和光学活性物质（二）光学活性和光学活性物质1 光学活性光学活性（1）手性物质含有不对称原子（结构）手性物质含有不对称原子（结构)的物质。具有光学活性。一束平面偏振光进入手性分子时，手性物质会将其分解为左右圆偏振光，并进行不同的处理。的物质。具有光学活性。一束平面偏振光进入手性分子时，手性物质会将其分解为左右圆偏振光，并进行不同的处理。左右圆偏振光在手性分子中的行进（旋转）速度不同，通过样品后，再次合成的偏振光相对于入射光旋转了一定角度。左右圆偏振光在手性分子中的行进（旋转）速度不同，通过样品后，再次合成的偏振光相对于入射光旋转了一定角度。（2）旋光现象）旋光现象（3）圆二色性）圆二色性手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量的振幅不同通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光，而是椭圆偏振光。手性物质对左右圆偏振光的吸收程度不同，出射时电场矢量的振幅不同通过样品后，再次合成的偏振光就不是圆偏振光，而是椭圆偏振光。2 光学活性物质光学活性物质(optical active substance)(1)定义具有光学活性的物质，与手性物质等价。定义具有光学活性的物质，与手性物质等价。（三）旋光色散和圆二色谱（三）旋光色散和圆二色谱1 旋光性通常用旋光度旋光性通常用旋光度表示，表示，的大小 随入射波长 而变化的关系称为旋光色散（的大小 随入射波长 而变化的关系称为旋光色散（optical rotatory dispersion,ORD)。2 圆二色性常用椭圆率（圆二色性常用椭圆率（ellipticity)表示：表示：tg=EL+ErEL Er=b(椭圆短轴）椭圆短轴）a(椭圆长轴）椭圆长轴）3 文献上也常用光学活性物质对左、右圆偏振光的摩尔吸收系数的差别文献上也常用光学活性物质对左、右圆偏振光的摩尔吸收系数的差别来表示。来表示。A=AL-AR=L-R=A/CL=AL-ARC L或或随波长而变化的关系称为圆二色谱（circular dichroism,CD)（四）（四）CD与与ORD和吸收光谱的关系和吸收光谱的关系1 旋光性和圆二色性1 旋光性和圆二色性差别：一个孤立的生色团在所有波长均有旋光性。圆二色性只在发生吸收的那些波长才能观测到。联系：都是由光学活性分子的不对称性引起的二者之间相互联系，由其一可推知其二。由差别：一个孤立的生色团在所有波长均有旋光性。圆二色性只在发生吸收的那些波长才能观测到。联系：都是由光学活性分子的不对称性引起的二者之间相互联系，由其一可推知其二。由Kroning-Kramers将二者联系起来。将二者联系起来。科顿效应：科顿效应：CD谱与吸收谱峰位基本接近，但吸收谱都是正值，而谱与吸收谱峰位基本接近，但吸收谱都是正值，而CD谱则能显示正负。谱则能显示正负。2 CD与与ORD和吸收光谱的关系和吸收光谱的关系CD谱中在谱中在=0处，处，取极值，（峰值或最小值）取极值，（峰值或最小值）ORD在=在=0处，处，=0000+-+-Positive cottoneffectNegative cottoneffect吸 收 谱吸 收 谱3 CD与与ORD和吸收光谱相比在结构分析中的优点和吸收光谱相比在结构分析中的优点（3）CD谱线可正可负，其极值与吸收谱一致。（谱线可正可负，其极值与吸收谱一致。（1）吸收谱均是正值，若同时存在多个吸收峰，其互相交叠，分析困难。（）吸收谱均是正值，若同时存在多个吸收峰，其互相交叠，分析困难。（2）对于）对于ORD谱，任意波长处的旋光性是所有生色团贡献之和，其极值与吸收谱不同。谱，任意波长处的旋光性是所有生色团贡献之和，其极值与吸收谱不同。三 旋光仪与圆二色仪旋光仪与圆二色仪LIGHT单色器单色器棱镜棱镜调制解调器调制解调器样品室样品室光电探测器光电探测器前置放大器前置放大器（一）圆二色仪光路图（一）圆二色仪光路图（二）圆二色仪组成部分（二）圆二色仪组成部分1 光源氙灯光源氙灯2 起偏器尼科耳棱镜起偏器尼科耳棱镜:天然方解石天然方解石Rochon棱镜：结晶状石英棱镜：结晶状石英3 调制解调器（）在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作用是将单色的平面偏振光以这种频率交替地变化为左、右旋圆偏振光。调制解调器（）在其上施加几万赫兹的高频交变电压，作用是将单色的平面偏振光以这种频率交替地变化为左、右旋圆偏振光。4 光电倍增管（光电倍增管（PM）样品杯）样品杯由高度均匀的熔融石英制做，不会带来附加的原二色性，也不会对光产生散射。样品浓度要与样品杯光径配合，使待测样品的由高度均匀的熔融石英制做，不会带来附加的原二色性，也不会对光产生散射。样品浓度要与样品杯光径配合，使待测样品的O.D.值不大于。值不大于。6 氮气保护装置氮气保护装置四 氨基酸和肽的圆二色性四 氨基酸和肽的圆二色性（一）氨基酸的圆二色性（一）氨基酸的圆二色性氨基酸分子中具有紫外生色团的有吲哚基，酚羟基，苯基，二硫键，咪唑基，羧基。酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，胱氨酸，脯氨酸在近紫外区（氨基酸分子中具有紫外生色团的有吲哚基，酚羟基，苯基，二硫键，咪唑基，羧基。酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，胱氨酸，脯氨酸在近紫外区（240-300nm)对对CD谱有贡献羧基在谱有贡献羧基在200-210nm显示正峰。显示正峰。（二）肽的的圆二色性（二）肽的的圆二色性Secondary structure of macromolecule-helix-helix:190 nm(+)208nm,222nm(-)x E-30200210220 230 240nm-sheet:195nm(+)antiparallel:red shiftparallel:blue shift215-217nm(-)-sheetUnordered structure:(-)below 200nm(+)218nm weak bandunordered-turn:180-190nm(-)200-205nm(+)225nm(+)band,weak red shift远紫外区（远紫外区（190-240nm)在波长大于在波长大于300nm的区域，包括可见区域，对的区域，包括可见区域，对CD谱的贡献主要来自像血红素一类含有金属离子的生色团，这一波段谱的贡献主要来自像血红素一类含有金属离子的生色团，这一波段CD谱常用于研究金属离子的氧化态、配位体以及链谱常用于研究金属离子的氧化态、配位体以及链-链相互作用。链相互作用。（三）含有金属离子的生色团（三）含有金属离子的生色团1 利用圆二色谱，可以计算多肽二级结构的含量。利用圆二色谱，可以计算多肽二级结构的含量。,fff+=,、,、,分别为螺旋、折叠和非周期结构在波长处的椭圆率值，f、f、f分别为螺旋、折叠和非周期结构在蛋白质中所占重量百分比。五圆二色技术的应用五圆二色技术的应用图：三种LRR（lysine-rich repeat)家族肽的CD谱图 A,Bob1（1-65）和Oct/DNA复合物的CD谱（1）蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸结合的研究2 CD谱非常适合研究蛋白质的构象变化图B，Oct/DNA/Bob1（1-65）三元复合物的CD谱（2）克山病区粮饲养的豚鼠心肌线粒体膜的研究模型动物心肌线粒体膜的CD谱（a：病区粮喂养组；b：病区粮补加蔬菜喂养组；c：正常对照组）模型动物心肌线粒体细胞色素C的CD谱（a：病区粮喂养组，15周前死亡；b：病区粮喂养组，存活的；c：正常对照组）（3 3）烟草花叶病毒侵染膜蛋白烟草花叶病毒侵染膜蛋白烟草花叶病毒侵染膜蛋白烟草花叶病毒侵染膜蛋白（4）疏水表面对球状蛋白质二级结构变化的诱导作用BSA 在疏水石英板表面的CD谱（a.1ug/ml,60S;b.5ug/ml,60S;c.60ug/ml,60S;d.60ug/ml,30min;e.60ug/ml,溶液中的BSA）a:无规卷曲b:有-折叠c:有-螺旋d:-螺旋更多（5）磷脂膜诱导的蜂毒素二级结构的变化蜂毒素的CD谱（1：蜂毒素插入单层膜的CD谱；2：蜂毒素吸附在单层膜上时的CD谱；3：在Tris-HCL缓冲液中的蜂毒素CD谱）1-螺旋84%，-折叠1%无规卷曲15%2-螺旋27%，-折叠20%无规卷曲53%Conformational transition:from alpha-helix rich to beta-sheet richPrPcPrPscScout1.Protein Concentration:0.5 mg/ml2.Cell Path Length:0.5 mm3.Stabilizers(Metal ions,etc.):minimum4.Buffer Concentration:5 mM or as low as possible while maintaining protein stabilityTypicalInitial Concentrations:One may find that the protein concentration needs to be adjusted to produce the best data.Changing this has a profound effect on the data,so small increments or decrements are called for.If that does not produce reasonably good data,a change in buffer composition may be necessary.It would also be a good idea to check the sample for unforeseen aggregation via Dynamic Light Scattering(DNA repair enzymes are an especially good example of this behavior).If buffer poses a problem,cells with shorter path(0.1 mm)and a correspondingly increased protein concentration and longer scan time can help.1.What is meant by“far UV”light?2.When CD is applied to proteins what is the main chromophore(absorbing group)that is looked at?What wavelength range does it absorb in?3.You are measuring the CD spectrum of a protein using a 1mm path length cell.You find that the signal is weak because the concentration of the protein is lower than you were initially told.How could you overcome this problem and what do you have to be careful of.4.Does the CD spectrum of a protein give most information about the(i)primary structure,(ii)secondary structure or(iii)tertiary structure?5.Draw the CD spectrum of an-helix.Remember to label the axes and mark important points with their values.6.Why is nitrogen gas used in CD instruments?7.Does CD give information about where the helices are in a protein?8.You wish to study the thermal stability of a protein with a single buried tryptophanresidue.What methods would you consider using and why?9.Membrane proteins are difficult to study by CD.True or false?Why?思考问题思考问题思考问题思考问题参考文献参考文献参考文献参考文献1.1.生物物理学生物物理学生物物理学生物物理学赵南明，周海梦，高教出版社施普林格出版社2000,330赵南明，周海梦，高教出版社施普林格出版社2000,3302.2.园二色性和旋光色散在分子生物学中的应用园二色性和旋光色散在分子生物学中的应用园二色性和旋光色散在分子生物学中的应用园二色性和旋光色散在分子生物学中的应用鲁子贤，崔涛，施庆洛，科学出版社1987鲁子贤，崔涛，施庆洛，科学出版社19873.3.3.3.Circular Circular Circular Circular DichroismDichroismDichroismDichroism and Linear and Linear and Linear and Linear DichroismDichroismDichroism,Dichroism,Alison Rodger and BengtNordn,Oxford University Press 1997Alison Rodger and BengtNordn,Oxford University Press 19974.4.分析仪器手册分析仪器手册分析仪器手册分析仪器手册朱良漪，孙亦梁，陈耕燕，化学工业出版社 1997,p 2475.Circular Dichroismand Optical Rotary Dispersion of Proteins and Polypeptides,A.J.Alder,N.J.Greenfield and G.D.Fasman,朱良漪，孙亦梁，陈耕燕，化学工业出版社 1997,p 2475.Circular Dichroismand Optical Rotary Dispersion of Proteins and Polypeptides,A.J.Alder,N.J.Greenfield and G.D.Fasman,Meth.EnzymologyMeth.Enzymology,27,675(1973).6.Computed Circular Dichroism Spectra for the Evaluation of Protein Conformation,N.Greenfield and G.D.Fasman,27,675(1973).6.Computed Circular Dichroism Spectra for the Evaluation of Protein Conformation,N.Greenfield and G.D.Fasman,Biochemistry,Biochemistry,8(10),4108(1996)7.C.R.Cantor and P.R.Schimmel,8(10),4108(1996)7.C.R.Cantor and P.R.Schimmel,Biophysical ChemistryBiophysical Chemistry,Vol.2,Chapter 8(1980)8.Effect of Trifluoroethanol on Protein Secondary Structure,F.D.Soennichsen,J.E.VanEyk,R.S.Hodges and B.D.Sykes,Vol.2,Chapter 8(1980)8.Effect of Trifluoroethanol on Protein Secondary Structure,F.D.Soennichsen,J.E.VanEyk,R.S.Hodges and B.D.Sykes,Biochemistry,Biochemistry,31(37),8791(1992)9.Protein Secondary Structure and Circular Dichroism:A Practical Guide,W.C.Johnson31(37),8791(1992)9.Protein Secondary Structure and Circular Dichroism:A Practical Guide,W.C.Johnson,PROTEINS,PROTEINS,7,205-214(1990)7,205-214(1990)