免疫标记技术.pptx

免疫标记技术免疫标记技术=抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性特异性特异性特异性特异性免疫标记技术的主要特点：免疫标记技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+标记技术标记技术酶酶酶酶荧光素荧光素荧光素荧光素同位素同位素同位素同位素免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术放射物标记技术放射物标记技术放射物标记技术放射物标记技术酶标技术酶标技术酶标技术酶标技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术免疫荧光技术其他标记技术其他标记技术其他标记技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术酶免疫组化技术酶免疫组化技术酶免疫组化技术双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法竞竞竞竞 争争争争 法法法法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法间间间间 接接接接 法法法法双位一点法双位一点法双位一点法双位一点法1.ELISA检测检测HBsAg(小组做小组做)实验内容实验内容3.免疫标记技术免疫标记技术(录像录像)2.尿液尿液HCG检测检测(胶体金法胶体金法)()(小组做小组做)实验目的实验目的1.1.掌握酶联免疫吸附实验的基本原理；掌握酶联免疫吸附实验的基本原理；2.2.了解利用双抗体夹心法测定了解利用双抗体夹心法测定HBsAgHBsAg的方法。的方法。3.了解胶体金法检测了解胶体金法检测HCG的原理、方法。的原理、方法。基本原理基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用利用酶催化底物反应的生物放大作用利用酶催化底物反应的生物放大作用利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异提高特异提高特异提高特异性抗原性抗原性抗原性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。疫技术。疫技术。疫技术。Ag+AbAg+AbE EAgAbAgAbE E+底物底物呈色反应呈色反应一、酶免疫技术一、酶免疫技术EIA固相固相聚苯乙烯聚苯乙烯 AgAgAgAg或或或或AbAbAbAb吸附到固相吸附到固相吸附到固相吸附到固相上的过程上的过程上的过程上的过程,称为称为称为称为包被包被包被包被 (酶免疫测定法酶免疫测定法酶免疫测定法酶免疫测定法)基本特点：基本特点：标记后保留酶和抗原标记后保留酶和抗原(抗体抗体)的活性；的活性；酶促反应专一性，保证特异性；酶促反应专一性，保证特异性；底物反应放大作用，提高敏感性；底物反应放大作用，提高敏感性；酶标试剂保存稳定；酶标试剂保存稳定；操作简便，安全易行。操作简便，安全易行。常用酶及其底物常用酶及其底物常用底物：常用底物：常用底物：常用底物：邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。：反应显橙黄色，应避光，致癌性。：反应显橙黄色，应避光，致癌性。：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性,但水溶性差。但水溶性差。但水溶性差。但水溶性差。常用底物：常用底物：常用底物：常用底物：对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(p-NPP)(p-NPP)：产物为黄色。：产物为黄色。：产物为黄色。：产物为黄色。APAP灵敏性高于灵敏性高于灵敏性高于灵敏性高于HRPHRP，但不易获得纯品，且稳定性低于，但不易获得纯品，且稳定性低于，但不易获得纯品，且稳定性低于，但不易获得纯品，且稳定性低于HRPHRP、价高，故应用不如、价高，故应用不如、价高，故应用不如、价高，故应用不如HRPHRP普及。普及。普及。普及。1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP)酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）ELISAELISA基本的实验过程基本的实验过程双抗体夹心法检测双抗体夹心法检测HBsAgHBsAg HBVHBV感染后的血清学指标感染后的血清学指标:HBsAg,HBsAbHBsAg,HBsAbHBeAg,HBeAbHBeAg,HBeAb HBcAb(IgG,IgM)HBcAb(IgG,IgM)乙肝表面抗原乙肝表面抗原乙肝表面抗原乙肝表面抗原,存在于存在于存在于存在于HBVHBVHBVHBV感染的急性期及慢感染的急性期及慢感染的急性期及慢感染的急性期及慢性期的血清中性期的血清中性期的血清中性期的血清中,为感染为感染为感染为感染指标。指标。指标。指标。实验材料实验材料1.HBV1.HBV诊断试剂盒；诊断试剂盒；2.HBsAg2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。阳性对照品，阴性对照品，待检品。实验步骤实验步骤2.在各孔内加入酶标抗体在各孔内加入酶标抗体1滴滴,37温育温育30分钟。分钟。3.各孔分别加入洗涤液各孔分别加入洗涤液(加满加满)-甩掉，反复甩掉，反复3次，次，然后在吸水纸上吸干然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水纸上倒扣在吸水纸上)。4.各孔内加入底物液各孔内加入底物液A、B各各1滴，轻轻摇动混匀，滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应室温避光反应15分钟。分钟。5.各孔内加入终止液各孔内加入终止液1滴，观察结果。滴，观察结果。1.将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、阴性对照血清及待测血清各阴性对照血清及待测血清各1滴。滴。结果判定结果判定2.2.若待检孔显色若待检孔显色深于或等于阳性深于或等于阳性对照孔则判对照孔则判定为阳性；定为阳性；3.3.若待检孔显色若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照介于阴性对照孔和阳性对照孔之间孔之间则判定为弱阳性。则判定为弱阳性。1.1.若待检孔显色若待检孔显色浅于阴性浅于阴性对照则对照则判定为阴性；判定为阴性；注意事项注意事项2.洗涤必须彻底，防止产生假阳性。洗涤必须彻底，防止产生假阳性。1.加样应加在板孔的底部，避免产生气泡加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。并迅速完成。二、胶体金法检测尿液二、胶体金法检测尿液HCG人绒毛膜促性腺激素人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin,HCG)受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCGHCG，是一种具有促，是一种具有促，是一种具有促，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素性腺发育的糖蛋白类激素性腺发育的糖蛋白类激素性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。临床上常用抗临床上常用抗临床上常用抗临床上常用抗HCGHCG检测尿液中的检测尿液中的检测尿液中的检测尿液中的HCGHCG以辅助早孕诊断和其以辅助早孕诊断和其以辅助早孕诊断和其以辅助早孕诊断和其他临床相关疾病。他临床相关疾病。他临床相关疾病。他临床相关疾病。胶体金标记免疫技术胶体金标记免疫技术(金标法金标法)胶胶胶胶体体体体金金金金是是是是由由由由氯氯氯氯化化化化金金金金与与与与还还还还原原原原剂剂剂剂反反反反应应应应形形形形成成成成的的的的一一一一种种种种胶胶胶胶体体体体颗颗颗颗粒粒粒粒，具具具具有有有有吸吸吸吸附附附附蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的特特特特性性性性(可可可可以以以以标标标标记记记记AgAgAgAg或或或或Ab)Ab)Ab)Ab)；胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。金颗粒呈现酒红色。金颗粒呈现酒红色。金颗粒呈现酒红色。胶体金标记免疫技术是将胶体金标记免疫技术是将胶体金标记免疫技术是将胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测金颗粒光学检测金颗粒光学检测金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。A GT B层析流方向层析流方向HCGHCG金标试纸金标试纸A：加待检尿液：加待检尿液G：金标：金标鼠抗人鼠抗人鼠抗人鼠抗人HCGHCG单抗单抗单抗单抗T T：鼠抗人鼠抗人鼠抗人鼠抗人HCGHCG单抗单抗单抗单抗C C：羊抗鼠：羊抗鼠：羊抗鼠：羊抗鼠IgGIgG抗体抗体抗体抗体B B：吸水纸：吸水纸：吸水纸：吸水纸滴加标本滴加标本 CA GT B层析流方向层析流方向HCGHCG金标试纸金标试纸滴加标本滴加标本 C复溶复溶固定固定反应条带反应条带质控条带质控条带双双抗抗体体夹夹心心法法A：加待检尿液：加待检尿液G：金标：金标鼠抗人鼠抗人鼠抗人鼠抗人HCGHCG单抗单抗单抗单抗T T：鼠抗人鼠抗人鼠抗人鼠抗人HCGHCG单抗单抗单抗单抗C C：羊抗鼠：羊抗鼠：羊抗鼠：羊抗鼠IgGIgG抗体抗体抗体抗体B B：吸水纸：吸水纸：吸水纸：吸水纸胶体金免疫法与胶体金免疫法与RIARIA、ELISAELISA等方法相比等方法相比,有有许多优点：许多优点：1.1.1.1.它它它它不不不不需需需需ELISAELISAELISAELISA法法法法中中中中所所所所要要要要求求求求的的的的作作作作用用用用的的的的底底底底物物物物和和和和显显显显色色色色剂剂剂剂，使操作更简便使操作更简便使操作更简便使操作更简便;2.2.2.2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;3.3.3.3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有有有有效期长效期长效期长效期长;4.4.4.4.灵敏度高，灵敏度高，灵敏度高，灵敏度高，10-25IU/L10-25IU/L10-25IU/L10-25IU/L。