药学专业毕业论文-外文翻译(15).doc

本科毕业论文(设计)外文翻译学 院 专 业药学姓 名 学 号 指导老师 职 称 合作老师职 称外文题目（原文）Competitive Inhibition of Human Poly(A)-Specific Ribonuclease (PARN) by Synthetic Fluoro-Pyranosyl Nucleosides译文：通过合成氟代嘧啶核苷竞争性抑制人多聚(A)特异性核糖核酸酶(PARN)Competitive Inhibition of Human Poly (A)-Specific Ribonuclease (PARN) by Synthetic Fluoro-Pyranosyl Nucleosides摘要：聚（A）特异性核糖核酸酶（PARN)是一种获得性相互影响的脱腺苷，这个脱腺苷酶是居间的，和其它外切核酸酶类连接在一起，参与真核信使RNA的翻译表达，因而它能积极参与有规律的基因的表达。到目前为止，氨基糖苷类和自然核苷酸是唯一报道的人类PARN活动的调节器。在现在的研究中，我们发现合成的核苷类似物连接一个氟代嘧啶核苷的糖基和苯甲酰修饰的胞嘧啶或腺嘌呤作为基本官能团能有效地抑制人类PARN。如以前所报道，当对多种肿瘤细胞系进行测试时，这种核苷类似物表现出很大的抑制作用。动力学分析表明，对PARN的抑制是有竞争性的，并不能通过改变外切核糖核酸酶类镁（）的浓度来释放。此外，用乙酰和/或糖基三苯甲基来替代糖基上2，4或6的OH是抑制效果的关键。要了解核苷如何准确的进入PARN活性部位，通过分子动力学模拟之后我们对分子进行对接。在硅片分析表明，这些化合物能有效地进入PARN活性中心。我们的研究结果支持这一想法即通过起催化作用的氨基酸残基的相互作用使糖基介导的稳定的核苷到达活跃的部位。两者合计，在体外和硅片的数据表明，我们人类PARN分子之间的目标是通过降低信使RNM的周转率而使这些化合物可发挥治疗作用，从而解释其在分子水平上的已知的体内抑制作用。 脱腺苷化是镁（）依赖的外切核糖核酸酶类，它可以不断裂解多聚（A）的末端，并释放5平滑肌磷酸酶1。在所有的脱腺苷，聚（A）特异性核糖核酸酶（PARN） 是独一无二的，因为它可以在脱腺苷化期间与5帽结构和多聚（A）的末端相互作用 2-5。这种酶同时位于真核细胞的细胞核和细胞质中6。生化研究表明，尽管没有在一个酶截断形式的晶体结构中发现这种离子，镁（）离子对催化作用是必要的7-8。PARN活动是通过辅助蛋白因子及与5帽结构的相互作用来进行体外调控的研究3，9-16。PARN是真核生物mRNA翻转时重要的介质，并在部分基因的表达方面起调节作用。尤其是当细胞增殖异常，需要向上调节翻译水平和回收mRNA，PARN可能是一个潜在的目标分子化合物用来抑制这些过程的速度。这里有一些报道关于PARN抑制因素可以调节酶的活性。据了解人类PARN可以被氨基糖苷类抑制，其中该化合物可以使活性部位变异和/或取代的重要的二价离子的功能，如二价镁（）离子。氨基糖苷类抗生素被广泛的应用于临床实践中而且这些抗生素治疗期间展出的毒性的副作用可以被这些抑制剂所解释17。此外，它还已经证明，天然的嘌呤核苷酸也可以抑制PARN的活性18-19。更具体地说，我们先前已经表明RTP的核苷酸来抑制酶是非竞争性的，而RDP和RMP的行为是竞争性的19。核苷类似物已被广泛用于防治癌症和病毒感染20。一个设计新颖的共同战略核苷类似物是糖基修饰。例如，阿糖胞苷和吉西他滨是糖修饰胞嘧啶类似物。阿糖胞苷抑制DNA聚合，并已用于急性髓细胞白血病的临床治疗21，而吉西他滨（dFdC）轴承氟改性糖最初设计是作为一种抗病毒药剂已被证明能够抑制DNA的合成，核糖核酸还原酶，并将其纳入核糖核酸22-23。此外，一些核苷类似物是RNA病毒引起的疾病的一线治疗药物24-25。所有这些化合物是主要的内源性代谢核苷酸和核苷，和活性代谢物的目标之一或更多的酶，如DNA和RNA聚合酶。核糖核酸酶活动也可以是潜在的分子靶标用于核苷类似物抑制。这就是艾滋病毒RNA依赖的DNA聚合酶的核糖核酸酶H域的案件26-28。近年来，携带一个六元碳水化物部分的核苷类似物如ketonucleosides，已被评估他们的抗癌和抗病毒的潜力29-32。此外，糖环上添加一个氟原子和在这基础上再添加一个苯甲酰基以提高类似物的生物活性（档号31和参考文献）。然而，到目前为止这些化合物没有分子靶点或他们的合成中间体已经被确定。上述工作，促使我们学习作为一个潜在的人类PARN分子目标等核苷类似物抑制。我们侧重于这种酶的活性被天然的核苷酸减弱，其结构是已知的重大影响，它展示了主要脱腺苷化在动物体内。我们证明PARN可以有效地抑制由几个核苷类似物轴承六员氟改性糖基带或不带底座上苯甲酰组（腺嘌呤或胞嘧啶）。我们发现，这些类似物表现为PARN的竞争性抑制剂，更重要的是，增加镁（II）离子的浓度不能恢复酶的活动。为了支持我们的生化数据，我们在分子动力学（MD）的模拟之后进行分子对接实验，我们预测核苷的对接构象可以进入活动现场。生化和在硅片的三维模型分析显示这三个糖羟基在高效抑制作用方面是重要的角色。我们的数据表明，在本研究中所使用的类似物铅化合物可作为服务于发展的新可能的PARN抑制剂和其他基本deadenylases与新的治疗方法的潜力用。材料与方法材料 所有化学品包括嘌呤核苷酸和脱氧核苷酸，亚甲基蓝，polyadenylic酸钾盐（平均粒径300腺苷，巴士A300）来自SigmaAldrich. 核苷类似物的合成。氟代嘧啶核苷合成如前所述（31）。 简单地说，凝结1，2，4，6-四- O -乙酰基- 3-脱氧-3-氟-葡萄糖胞嘧啶，silyated N4-苯甲酰胞嘧啶，或N6-苯甲酰腺嘌呤造成的1的生产-（2，4，6三-O-乙酰基-3-脱氧-3-氟-D-吡喃葡萄糖-N4-苯甲酰胞嘧啶（5条）或9-（2，4，6三-O-乙酰基-3-脱氧- 3-氟-D-吡喃葡萄糖）- N6-苯甲酰（1）腺嘌呤，分别来说，在场的三甲基硅三氟甲烷磺酸钠和锡氯化物。脱保护的第5条与氢氧化钠乙醇吡啶格A1分别产生1-（3，4-脱氧- 3-氟-D-吡喃葡萄糖）胞嘧啶（C6）的，1 -（34-脱氧-3-氟-D-吡喃葡萄糖）- N4-苯甲酰胞嘧啶（A6的），或9 -（3，4-脱氧-3-氟-D-吡喃葡萄糖）-N6-苯甲酰基腺嘌呤（A2）的。A2的治疗和干2，2-二甲氧基丙烷，N，N-二甲基甲酰胺，通过乙酰化后的自由羟基集团在2位的糖基醋酸酸酐/吡啶，去除异亚丙基，而且，最后，选择性保护的主要6 -羟基组一组取得了三苯甲基化合物A4。氧化的氟乙酰化前体A4与吡啶踵铬酸盐/乙酸酐给予9-（3-脱氧-3-氟-6-O型三苯甲基-D-glycerohex-2-enopyranosyl-4 -ulose）- N6-苯甲酰基腺嘌呤（A 3）。 表达和纯化重组PARN。 质粒编码的全尺寸74 kDa的人类PARN（Virtanen教授提供的，UppsalaUniversity，瑞典）（用于N-末端His6标签的多肽表达），被传递给BL21（DE3）细胞去表达重组蛋白，如前所述33，加入一些修改。简单地说，菌落生长在37过夜的卡那霉素（50 ul/ml）。培养物在（1:100）稀释后在相同的37被异丙基-1-硫代-的D-半乳糖苷（IPTG）诱导的一个最终的浓度0.1mm的培养基中生长。用于PARN表达的培养液被允许在37下培养3小时。在4下经离心法收集细胞要20分钟，和颗粒被冻结在- 70。表达了他的标记可溶性蛋白进行纯化下列先前描述协议33。PARN活性测定和动力学分析。如所述前34，酶的活性可以被亚甲蓝所测定。作为时间函数脱腺苷酶率被确定用时间进程分析（图1）。亚甲蓝是由1.2mg的亚甲蓝溶解在100ml的3-吗啉基丙磺酸缓冲液中制备而成的（0.1m的3-吗啉基丙磺酸-氢氧化钾，pH值7.5和2mmEDTA）。标准反应缓冲液含20mg羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钾（pH值7.0），1.5mg氯化镁，氯化钾100mg，0.1ulRNA酶，0.2mg的乙二胺四乙酸，0.25mg的DTT，10% （v/v） 的甘油，0.075-0.6mg聚（A）。 所有的核苷酸溶解在反应缓冲液后才能使用。反应进行了利用0.01-0.02mm的重组PARN。 对于动力学分析，底物浓度聚（A）条介于0.075至0.6mL19。最终反应容积为100ul，反应是在30进行5-10分钟。反应的终止是通过反应液和亚甲基蓝混合，混合液的培养是在30黑暗的水浴器中15分钟。1mL样品在662nm Spectronic Genesys20分光光度计下测量。协调准备PARN的相配之物都是从已知的PARN晶体结构得到的与rcsB蛋白数据库一样放置。其中一个两个相同的二聚体形式活性中心被用于对接计算。全部结晶水分子从坐标文件删除之前对接。氢原子和部分收费经过分子操作环境（有效性测量）程序35使用AMBER94力场添加到了酶上。有效性测量使用PEOE的方法来分配所有潜在抑制剂的化合物部分费用。毕竟非氢原子被固定，PARN分子被大力减少由最速下降的组合，共轭梯度，并截断牛顿极小化方法在有效性测量。能量最低化也进行到放宽基板前对接。 分子对接。有效性测量是用来执行对接试验和溶剂化和计算相对结合自由能。有效性测量模块利用Carlo模拟退火（SA）的方法计算对接。一对接网格间距0.375A掳60 X40X40分箱放在围绕这一目的蛋白的活性部位。该迭代限制设置为20000，循环次数设置为20，在运行数设置为10。 分子动力学模拟。分子动力学（MD）模拟进行了利用有效性测量和其内置的医师模块使用NVT系综（氮，原子的数目; 五，体积;笔，温度）。该化合物与酶复合物对接最初优化是通过能量最小化利用有效性测量AMBER94力场。每一复杂的后来在一个明确的溶剂化水分子定期盒延长8-12A来自蛋白原子。周期边界被使用，以减少边缘效应。水结构最初为100ps的平衡保持整个蛋白质固定其次是100ps的骨干固定蛋白质平衡。在平衡阶段之后是3ns的MD模拟用300K的时间步来整合2快速扫描的势函数。Nonbonded被截止至少要有8A被使用。结果A2，A6和C6是竞争抑制剂抑制PARN活动。在我们以往的研究的基础上显示磷酸腺苷，在脱腺苷化产品之一，作为竞争行为对PARN抑制剂19，我们搜索了类似的化学性质抑制剂。我们研究了一系列的氟代嘧啶核苷潜在的抑制效果如（图1）。它有最近表明，其中一些化合物具有肿瘤抑制效果，以及在细胞抗病毒活性31。初步筛选了这些核苷关于PARN的作用活动表明，A2，A6，和C6可以有效地抑制PARN，化合物A1和A 3- A5和A7的没有显着影响（数据未显示）。为了进一步了解A2，A6和C6核苷类似物的抑制作用，我们进行详细的动力学分析，结果发现这些化合物表现为在体外高效率的PARN竞争性抑制剂。随后，从我们的动力学分析确定了抑制常数（文插图，如图2所示）这三个化合物。就A2，计算基值0.51mg和A6的，抑制常数为0.21mg（表1，图2）。同样的动力学分析氟代嘧啶核苷胞嘧啶核苷与缺乏苯甲酰修改（C6）的，这也抑制PARN活动（图3A）用0.6毫米。三脱氧-3 -氟-葡萄糖（B6）的，只包含同一没有相应的糖环成分，无明显抑制并在随后的分析作为阴性对照组（数据未显示）。此外，我们比较了这些化合物与自然核苷酸的抑制作用，作为一个有竞争力的表现抑制剂。该CMP的抑制常数为0.7mm（图3B），与C6类似，但比A6高。表1总结了所有在研究中使用的化合物的抑制常数。这些结果表明，PARN可以有效地抑制合成核苷是在目前进行了测试研究，具有竞争力的方式，意味着这种抑制作用依赖于对大自然的了解糖基比该基地的性质。此外，我们的数据表明，PARN可能是一个新的分子针对这些化合物在体外。图1：镁（）离子不释放A2，A6和C6的抑制剂。以往的研究表明，镁（II）离子对PARN活动有重要作用，尽管没有这样的离子在活跃的截断的PARN的晶体结构中被发现图2：苯甲酰氟代嘧啶核苷抑制PARN活动：A2和A6的是非竞争性抑制剂。双倒数图1 /对1/ 基板 V的PARN在A2的存在活动（A）或A6的（B）所示。（在A充满标记）A2的浓度分别为0mm（圈），0.025mm（三角形），0.25mm（m2），以及1mm（倒三角形）。A6的浓度（在B空标记）分别为0mm（圈），为0.05mm（三角形），0.5（方），1mm（倒三角形）。至少有三个有代表性的独立实验显示。插图：斜坡（公里/ Vmax值）的双重相对于核苷酸浓度倒数线。图3： C6和一磷酸胞嘧啶是PARN非竞争性抑制剂。双1 /对1/ 基 V的PARN活动倒数作图C6的存在（在A充满标记）或一磷酸胞嘧啶（在B空标记）显示。C6的浓度（在A充满标记）和一磷酸胞嘧啶（在B空标记）是为0mm（三角形），0.025（圈），0.25（方），和1mm（倒三角形）。代表至少有三个独立的实验曲线显示。插图：相对于核苷酸的双倒数线的斜坡（KM/Vmax）浓度。此外，在我们以前的报告中，我们观察到，增加镁（II）离子的浓度可以扭转自然的抑制二和三磷酸核苷酸而不是通过抑制磷酸核苷酸19。因此，我们要排除PARN可以被合成核苷抑制的可能性，不知何故，被救出使用过量镁（），虽然这些核苷酸不包括任何磷酸基团。我们完成了脱腺苷化与Mg（）浓度检测，变以下（10倍）以上（10倍）的浓度准的试验条件。有趣的是，根据条件测试，镁（）浓度很难颠倒对A2，A6和C6的抑制作用（图4）。 这些数据表明，新型人工合成的化合物的作用是独立当地镁（）浓度，而这些抑制效应化合物不能被剥夺，通过改变镁（）的水平。 图4：镁（II）在抑制PARN中通过核苷酸中的嘌呤碱的效果。（顶部）相关活动抑制由1 mM A2 （空条子）或者1 mM A6（实条子）来呈现0，1.5，and15mM 镁（II）。（底部）相关活动呈现了1 mM C6（空条子）或1 mMCMP（实条子）来呈现0，1.5，and10mM镁（II）。结果是意味着至少三种独立试验的价值形式。预测的C6，A6和A2与PARN的活性部位对接。为了进一步分析的C6，A6和A2氟代嘧啶核苷与PARN核苷的特异性相互作用，我们进行分子对接试验，利用已知的PARN晶体硅结构8作为受体。有效性测量停靠的最低能量根据研究显示这些化合物的构象图5。所有C6的构象的对接来自一个单一的集群中最大下降的RMSD范围0.1A在，提出了较高的特异性这给定受体（图5）化合物。该建立一个氢键连接在5糖-OH和氢键30之间，优化了另外两个羟基的群体几何糖环电子捐赠两个天冬氨酸残基（Asp382和Asp28）的催化剂（图6）。 关于A6，至少有6列共10个对接构象结果给了一个集群内下降，表明有一个化合物A6的首选（图5）结合的方向。随后分子动力学模拟为了验证进行对接的结果。镁缺乏模拟证实了A6的绑定定位，这最适合糖环羟基团体建立氢键（Asp28和Asp292）和疏水（Asp382）相互作用与催化三联（图6）天门冬氨酸残基。类似的复合物C6，5-OH氢键与葡萄糖30连接。OH基团的关键作用在位置2，4和6也支持这一事实，化合物A5在这些位置带有少的极性的乙酰基，是亲水性，并减少不抑制PARN活动（数据未显示）。对存在A6额外的苯环（苯组）相比，似乎已到C6通过进一步优化疏水与受体相互作用苯环的相互作用，从而实现了最佳的糖环方向的互动与催化天冬氨酸残留物（图6）。 此外，杂环芳香胞嘧啶环采用最佳的几何建立疏水相互作用与两个受体（Phe31和Phe115）苯基环。然而，更为复杂的复合酶A2腺苷环设置一个非常高的共轭体系的中间建立丕复合叠加与受体的相互作用（Phe115）如（图6）。 五元环与Phe115腺苷基相互作用，而不是苯基环中的胞嘧啶基复合情况。因此，能量最低的对接构象的A2化合物倾斜，略有偏移，不允许5-OH在葡萄糖30粘接，因此糖的羟基与催化三联（图6）天门冬氨酸残基相互作用。图5：复合物C6，A6，A2，和B6在PARN 活跃点的接驳。在PARN中，有着微小的能量和大量普遍存在的复合物A2，A6，C6，和B6的接驳构造。在PARN中较低的能源和最流行的对接构象A2，A6的，C6和B6化合物。聚类对接构象显示了效率高的C6和A6化合物。A2的对接构象表现出低度的聚类。该B6的对接构象散射意味着对这种化合物nonconsensus结合模式。因此，我们认为，既然B6的代表为以后的合成结构基础测试的化合物，它作为对照复合使用。复方B6的对接表明，A6的糖基单是建立与催化氢键能力正如由散射的对接构象在酶（图5）B6的活性部位。两者合计，这些数据表明，芳香环腺苷的A2的复合构成一个庞大的，高度共轭核心，降低了其抑制效力与胞嘧啶基化合物的C6和A6比较。A6化合物的额外的苯环的贡献进一步提高其结合方式，使其成为对PARN更有效的抑制。最后，我们两个在体外和分析表明，人类PARN可能是一个新的分子目标在体内，这些类似物，这些化合物可以作为为PARN发展新型抑制剂先导化合物与潜在的治疗应用。图6：PARN与化合物C6，A6和A2相互作用。左：化合物结合模式的三维模型的C6，A6和A2的PARN活性中心。每个Ligplot互动地图化合物。相互作用是根据下表绘制位于上面的数字。讨论在我们寻找有治疗潜力有竞争性的PARN抑制剂中，我们研究了一种新型的核苷类似物氟代嘧啶核苷。核苷类似物已被广泛探讨为潜在的抗肿瘤和抗病毒治疗药物。在此基础上的改良，糖基或者两者都已经被主要用于瞄准关键酶以提高治疗指数。人类PARN代表了一个对药品研发的潜在目标，到目前为止对药品研发还未被广泛地研究。本研究选择的核苷的糖组成部分是由一种罕见的六元环、一个和抗癌和免疫抑制效果相关联的改进组成23，29，30。糖基所携带的氟原子进行改善活动，脂溶性和细胞膜渗透36-39。此外，随着苯甲酰基（BZ）的改进已经被应用于核苷合成；具有被改进的苯甲酰腺嘌呤的三磷酸腺苷类似物已被一个DNA聚合酶的克莱片段认可和纳入DNA 40。苯甲酰基也已经被应用于化合物来抑制艾滋病病毒逆转录酶的核糖核酸酶H领域。所有这些特点功能把fluoro-pyranosyl类似物建立为为药物研发的有前途的化合物。在这项工作（A2和A6）中测试的两个苯甲酰fluoro-pyranosyl核苷表现为竞争性的酶抑制剂，携带被改进的苯甲酰腺嘌呤（A2）或被改进的苯甲酰基胞嘧啶（A6）作为基组（图1）。 与天然核苷酸AMP 和 CMP相比，这些化合物的Ki值被发现是相当低的，还表现出竞争性抑制（图4，表1）。 该化合物C6，它带有一种改进的糖基，但没有被改进的苯甲酰基地（胞嘧啶），它还可以在竞争激烈的方式Ki值为0.65mm来抑制PARN，可与最近的结构相似的天然核苷酸如CMP的值相比较。比较A6、C6和结构相似的天然核苷酸CMP的Ki值，它们都以携带胞嘧啶为基础（分别为0.21，0.65和0.72mm），很明显苯甲酰改进对更有效的抑制作用是至关重要的。这或许可以归因于一个事实，即该组的结构有助于核苷在活性部位更好地适应，其电荷可以稳定和关键的催化氨基酸的相互作用。最后，最初的化合物B6以一种招标模式在酶的活性部位显示无共识，在酶活性上没有抑制作用，观察也被体外生化分析证明了（数据未显示）。为了获取C6、A6和A2如何与PARN的活性部位相互作用的信息和支持生物化学数据，我们进行分子动力学模拟。我们的研究结果表明，所有三个化合物可以容纳到酶的活性部位，从而有利于通过特定的相互作用有效地抑制它的活动。A2能有竞争性地抑制PARN，但当糖上的- OH基团被乙酰或者甚至体积更大的三苯甲基组（复合A1，A3和A4）取代时，没有抑制被观察到。这种无效很可能归因于不同的化学行为和体积较大的乙酰基组可能不适合进入催化袋。对A6进行了类似的观察，在糖基的羟基上暗示一个至关重要的作用。此外，苯甲酰基的存在提高了胞核嘧啶基地的抑制作用，和C6相比，反映在化合物A2和A6的Ki值上（表1）。 我们的数据表明，与胞嘧啶为基础的化合物相比，由A2的芳香环形成的体积大的共轭核心降低了其抑制效力。然而，与C6相比，化合物A6额外的苯环的贡献进一步改善其亲和力，使其成为更有效的PARN抑制剂。在这项工作中提出的硅片分析表明糖基和主要的催化氨基酸之间重要的相互作用，同时在PARN中的聚（A）限制形式实验中也观察到8。C6在其活性部位的最佳结合方向是允许糖环的-OH基团与三个催化Asp残基（图6）建立氢键相互作用，以及为了六元糖环和受体之间已增强的相互疏水作用。再加一个额外的苯基（化合物A6）提高受体的活性部位的相互作用（图6）。结合A2、A6、C6、AMP和CMP的Ki值，我们的数据表明，至少在这里测试的在被改进的核苷的情况下，PARN对于胞嘧啶有一个较高的亲和力，而不是对于基于腺嘌呤的化合物。虽然PARN从聚（U）中区分聚（A），但不能降解聚（C）或聚（G）6-13，似乎至少在这种被改进的核苷测试情况下，它更好的结合一个胞核嘧啶而不是一种腺嘌呤。值得注意的是，PARN的基体识别仍是一个未解决的问题。一个重要的观察：尽管事实上酶有效降解聚（A），但是在腺嘌呤基地和酶之间没有特定的氢键之间的相互作用8。在该类似物的作用下，脱腺苷化反应中的二价镁离子的介入也进行了研究。之前我们已经表明，当二价镁浓度的增加而不是带有一个磷酸基（AMP 和 GMP） 的核苷酸的浓度增加时，嘌呤核苷酸的抑制作用会使三个磷酸基（ATP 和GTP）或两个磷酸基（ADP 和 GDP） 被释放。我们的研究结果符合这些观察而且表明，二价镁的促进作用通过改进的核苷并不影响PARN的抑制作用，这可能是因为缺乏任何磷酸基。一些研究关于二价镁离子结合模式到磷酸基进行辩论。据报道，二价镁只结合ATP的-磷酸盐，即 Mg-ATP 是一种，-双齿或R、-，-，-和R，-双齿混合物，最后，金属与ADP的R-和-磷酸和所有ATP的磷酸盐41-44相互作用。在PARN的活性部位，对二价镁积极参与机制的实际作用进行了详细研究7。在那份报告中，提出的对PARN的两个金属离子示意图是基于以前同一组的报告45表明PARN活性部位类似于DNA聚合酶I中30-50个核酸外切酶的活性部位。作者认为三个天冬氨酸残基（D28，D292，和D382）和一个谷氨酸残基（E30）可通过水分子直接或间接的协调衔接两个金属离子。然而，二价镁可代替其他二价金属离子（如Mn2+ 或 Co2+），在对镁离子本身催化机理的绝对要求提出问题。此外，据报道，新霉素B作为一种混合非竞争性抑制剂17，其二价镁离子释放PARN和DNA聚合酶活性的克莱片段的抑制作用。在该报告中，作者表明对于PARN，新霉素B中的钾和二价镁离子的浓度无关，并认为新霉素B和二价离子为同一站点或重叠结合位点17竞争。众所周知，在又脱氧核糖核酸的情况下，比如DNA聚合酶的克莱片段，二价镁很难用Kae 105 M-1和蛋白质结合，单金属离子和双金属离子的机制都已经被提出来了46。因此，二价镁无法释放PARN的抑制作用这可能由于金属对酶的亲和力弱或重叠（对金属和抑制剂）的结合点。如上所述8，一个截断人类PARN的C-末端的晶体结构是在两种状态下来决定（自由和RNA结合形式），但有趣的是，作者报道说，尽管二价镁包括在这机制条件下（在同一数量级的标准统一试验下使用，即1.5至2mm之间）。在这个报告中，晶体数据显示，PARN活动所必需的氨基酸，例如，（D28 D282，D382，E30），无论和核糖或一个寡核苷酸基板磷酸基团都很好的相互作用，而生化数据显示，H377对催化活性以及与磷酸盐的相互作用也是必不可少的。在我们的分析中，同样的氨基酸都参与了在活性部位核苷糖基的协调。此外，事实上，增加的二价镁确实可以通过嘌呤三和二磷酸核苷酸（RTP和RDP）释放PARN的抑制活性，而不是通过单磷酸核苷酸（RMP），这表明可能是金属离子独立存在的一种抑制模式。此外，在最近的一份报告47中，即使在没有二价镁的情况下，关于二价镁PARN的热稳定性影响被检测到酶能够运作，虽然速度慢一些。虽然二价镁对整个PARN功能完整性是必要的，上述数据可以解释为什么在我们的研究中增加的二价镁浓度没有影响核苷类似物抑制程度。此外，最近的一项关于结合到PARN的帽的结构性基础的研究显示帽结合和活性部位领域部分重叠48。有趣的是，一个常见的天门冬氨酸残基（D28），似乎和我们研究的A2，A6和C6的40-OH基团协调有关系，在帽结合领域和活性部位领域的二价镁协调中可能也呈现为常见的残基。在目前的研究中，很明显的是，核苷类似物的相互作用并没有干预必要的二价镁，这一特点在这一类似物作为在细胞环境中潜在的治疗化合物的有效性是必不可少的。目前的研究表明PARN代表至少有一个氟代嘧啶核苷核苷类似物的目标在分子水平上。从这个角度来看，这些类似物可以通过干扰mRNA的生命周期发挥效果，其中PARN是一个关键部分。对于mRNA进出因素的类似化合物的进一步发展可用于更深入的生化研究，最终用于治疗应用。这些化合物在细胞培养中展现这项建议被记录的抗癌和抗病毒效力所支持。参考文献 略原文