RNA提取常见问题.pptx

q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 步骤步骤:材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的）：维持变性的细胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。RNA提取的通用方法影响影响RNA提取的因素提取的因素q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在存在TRIzolTRIzol或样品贮存液中，于或样品贮存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，液氮长期保存，7070短期保存短期保存影响影响RNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：酵母和细菌：一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量q 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成造成 RNA RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA RNA 后续酶反后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳RNA降解q 新鲜细胞或组织：新鲜细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组织裂解不充分组织裂解不充分另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 (如如脾脾脏脏，胸胸腺腺等等)，很很难避免难避免 RNA RNA 的降解。的降解。建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组织织碾碾碎碎，并并且且匀匀浆浆时时使使用用更更多裂解液多裂解液。RNA降解q 冷冻样品：冷冻样品：样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中速速冻冻，然然后后可可以以移移至至-70-70冰箱保存。样品要相对小一点；冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化，研研磨磨用用具具必必须须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280 比值偏低q 蛋白质污染：蛋白质污染：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：苯酚残留：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280 比值偏低q 抽提试剂残留：抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 RNARNA，并且彻底去掉，并且彻底去掉 75%75%乙醇。乙醇。解决办法解决办法:再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：设备限制：测测定定OD260 OD260 及及OD280 OD280 数数值值时时，要要使使OD260 OD260 读读数数在在 0.10 0.10-0.50 0.50 之间。此范围线性最好。之间。此范围线性最好。q 用水稀释样品：用水稀释样品：测测 OD OD 时时，对对照照及及样样品品稀稀释释液液请请使使用用 10 10 mM mM TrisTris，pH pH 7.57.5。用用水作为稀释液将导致比值的降低。水作为稀释液将导致比值的降低。电泳带型异常q 非变性电泳：非变性电泳：上样量超过上样量超过 3ug，电压超过，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，电泳缓冲液陈旧，均可能导致均可能导致 28S 和和 18S 条带分不开。条带分不开。q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高甲醛的质量不高。下游实验效果不佳q RNA RNA 降解降解 q 抽提试剂的残留抽提试剂的残留 75%75%乙醇洗涤乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀多糖等杂质，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA RT常见问题分析和解决方案问题一：问题一：少量或没有少量或没有RT-PCR产物产物RNARNA降解降解分离无污染，高质量的分离无污染，高质量的RNARNA；防止；防止RNARNA降解降解RNARNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗RNARNA沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNARNA量太低量太低增加增加RNARNA的量的量 多糖同多糖同RNARNA共沉淀共沉淀用氯化锂沉淀用氯化锂沉淀RNARNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNAcDNA第一链合成的引第一链合成的引物退火失败物退火失败确定退火温度适合所用的引物确定退火温度适合所用的引物RNARNA模板存在较多二级结模板存在较多二级结构构将将RNARNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度退火，提高逆转录反应温度反转录成功，反转录成功，PCRPCR失败失败PCRPCR步骤中使用超过步骤中使用超过1/51/5的逆转录反应产物的逆转录反应产物可能原因可能原因解决方案解决方案RT常见问题分析和解决方案问题二：问题二：有非特异性带有非特异性带q 引物和模板的非特异性退火引物和模板的非特异性退火 q 基因特异性引物设计较差基因特异性引物设计较差 q RNA中有基因组中有基因组DNA的污染的污染 q 形成引物二聚体形成引物二聚体 q 镁离子浓度太高镁离子浓度太高 提高反应的温度和特异性提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性提高引物的特异性 使用扩增级使用扩增级DNaseDNase处理处理RNA RNA 设计在设计在33端没有互补序列的引物端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度优化镁离子浓度 可能原因可能原因解决方案解决方案RT常见问题分析和解决方案问题三：问题三：产生弥散（产生弥散（smear）条带）条带 q 第一链产物的含量过高第一链产物的含量过高 q PCRPCR反应中引物过多反应中引物过多 q 循环数过多循环数过多 q 退火温度过低退火温度过低 q 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增寡核苷酸片段产生的非特异性扩增 常规常规PCR步骤中减少第一链产物的量步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少引物的用量 减少减少PCRPCR的循环次数的循环次数 提高退火温度提高退火温度 提取高质量提取高质量RNARNA，防止被，防止被DNADNA污染污染 可能原因可能原因解决方案解决方案