HBV分子诊断技术.pptx

电镜下观察血清中的丹氏颗粒（上图）HBV感染型颗粒组分（下图）Hepatitis B：The virus and disease,2009小小球形颗粒：直径球形颗粒：直径22 nm管形管形颗粒：颗粒：2240400 nm两者均为过剩的病毒外壳，两者均为过剩的病毒外壳，仅含仅含HBsAg，无感染性，无感染性。Dane颗粒颗粒:42nm内含核酸，内含核酸，具有感染性具有感染性2.HBV2.HBV基因组结构基因组结构pre-s1pre-s2SP PC Cpre-cXHBV DNA 3.2 kbHBV DNA:3.2KBHBV DNA:3.2KBpre-S1 pre-S1pre-S1 pre-S1蛋白蛋白pre-S2 pre-S2 pre-S2pre-S2蛋白蛋白S HBsAgS HBsAgpre-C HBeAgpre-C HBeAgC HBcAgC HBcAgP DNAPP DNAPX HBxAgX HBxAgHepatitis B virus replication 2007S区基因：区基因：包括S基因、PreS 1和PreS2基因，分别编码HBsAg、PreS1和PreS 2Ag。C区基因：区基因：编码HBcAg，还有一个PreC区可能在病毒核心和外壳的附着及结合中起作用。P区基因：区基因：最长，编码HBV DNA多聚酶、逆转录酶以及RNaseH.X区基因：区基因：编码X蛋白，可以反式激活一些细胞的癌基因及病毒的基因等，可能与肝癌的发生有关。1988 年Okamoto 提出18 株不同亚型的HBV 基因序列两两比较后,根据核苷酸序列异源性8%将18 株HBV DNA 序列分为A、B、C、D 4 个基因型HBV 基因型的概念基因型的概念Norder 等对32 例HBV 患者S 基因序列测序结果进行分析,除证实了Okamoto 的结果外,还发现了2 个新的基因型E、F 并发现S 基因序列的变化同全基因序列的变化一致,A、D 和E 型亲缘关系较近,而B 和C 型较近HBV 分型依据HBV 由双链环状DNA 构成,长度约3.2kb 迄今为止,根据HBV 全基因核苷酸序列的异质性8%或S 区基因序列差异4%,将HBV 分为A、B、C、D、E、F、G、H 8 种基因型分型的意义分型的意义通过HBV基因分型可用于流行病学研究,了解HBV基因型的地区分布及各基因型致病性或毒力强弱情况。可观察基因型与抗病毒疗效关系。慢肝中C基因型比B基因型有更高的基础核心启动子(BCP)的突变率,B型对干扰素应答明显高于C型,尤以B型年轻患者疗效最好。可观察疫苗对HBV不同基因的预防作用,尤其对母婴传播基因型的研究。目前进行HBV 基因型分型的方法主要有:(1)单克隆抗体ELASA 法:HBV 基因组前S2 区7 种抗原决定簇的产物在不同基因型中有特异的组合,利用此原理制订单克隆抗体,并行辣根过氧化酶标记,该方法简单易行,但对混合感染和特异性表位存在突变时不能分型。目前进行HBV 基因型分型的方法主要有:(1)全基因或S 基因序列分测定型法:全基因序列最为准确、可靠,但费用高,耗时长,操作复杂,不利于大规模调查研究Norder 等发现单独使用S 基因序列测定进行基因分型的方法,初步简化了基因分型的工序。于PCR 方法的乙肝病毒基因分型常见的有三种：对S 区的PCR-RFLP 法，对前S 区的PCR-RFLP法，和特异性引物的巢式PCR法。限制性内切酶长度多态分析法(PCR-RFL P):这是目前使用得最多的分型方法原理是将各种基因型的HBV S 基因或前S 基因序列排列后比较,每种基因型有其独特的限制性内切酶位点,首先经PCR 扩增出目标片断,然后用特定的限制性内切酶进行酶切,经酶切后产生不同的图谱,据此可区分不同的基因型。该方法应用最为广泛,其操作简单,费用相对低廉,适用于大量样本测定特异性引物的巢式PCR法巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。优点：如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。