刘老师第三章蛋白质化学1-3节.pptx

第三章第三章 蛋白质化学蛋白质化学w1.1.蛋白质的蛋白质的组成成分组成成分w2.2.氨基酸的氨基酸的性质性质w3.3.氨基酸的氨基酸的分离与测定分离与测定w4.4.肽肽w5.5.蛋白质的蛋白质的分类分类w6.6.蛋白质的蛋白质的一级结构一级结构w7.7.蛋白质的蛋白质的高级结构高级结构w8.8.几种典型蛋白质的几种典型蛋白质的结构与功能结构与功能w9.9.蛋白质蛋白质结构与功能的关系结构与功能的关系w10.10.蛋白质的蛋白质的性质性质w11.11.蛋白质的蛋白质的分离、纯化与测定分离、纯化与测定蛋白质蛋白质-英文为英文为“ProteinProtein”第一重要第一重要第一节第一节 蛋白质分子的组成成分蛋白质分子的组成成分 一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解三、蛋白质的基本单位三、蛋白质的基本单位氨基酸氨基酸一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成主要的主要的：CHONS5055%68%2023%1319%04%微量的：微量的：PFeCuZnMoISe 大多数蛋白质含氮量较恒定，平均大多数蛋白质含氮量较恒定，平均16%16%，即即1 1g g氮相当于氮相当于6.256.25g g蛋白质。蛋白质。6.256.25称为称为蛋白质系数蛋白质系数。每克样品含氮量每克样品含氮量6.25100=6.25100=蛋白质含量（蛋白质含量（g g%）二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解w1.1.酸水解酸水解 条件条件：5 51010倍的倍的20%20%的盐酸煮沸回流的盐酸煮沸回流16162424小时，或加压于小时，或加压于120120水解水解2 2小时。小时。优点优点：可蒸发除去盐酸，水解彻底，：可蒸发除去盐酸，水解彻底，终产物为终产物为L-L-氨基酸，产物单一，无消氨基酸，产物单一，无消旋现象。旋现象。缺点缺点：色氨酸破坏，并产生一种黑色的：色氨酸破坏，并产生一种黑色的物质：腐黑质，水解液呈黑色。物质：腐黑质，水解液呈黑色。二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解w2.2.碱水解碱水解条件条件：4 4mol/L Ba(OH)mol/L Ba(OH)2 2或或6 6mol/L mol/L NaOHNaOH煮沸煮沸6 6小时。小时。优点优点：水解彻底，色氨酸不被破：水解彻底，色氨酸不被破坏，水解液清亮。坏，水解液清亮。缺点缺点：产生消旋产物，破坏的氨：产生消旋产物，破坏的氨基酸多，一般很少使用。基酸多，一般很少使用。二、蛋白质的水解二、蛋白质的水解w3.3.蛋白酶水解蛋白酶水解条件条件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常温酶，常温37374040，pHpH值值5 58 8。优点优点：氨基酸不被破坏，不发生消旋：氨基酸不被破坏，不发生消旋现象。现象。缺点缺点：水解不完全，中间产物多。：水解不完全，中间产物多。蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。析，而酶水解用于制备蛋白质水解产物。蛋白质蛋白质 月示月示 胨胨 多肽多肽 二肽二肽 氨基酸氨基酸 104 5000 2000 1000500 200 100 蛋白质的水解产物：蛋白质的水解产物：饱和硫饱和硫酸铵，酸铵，硫酸锌硫酸锌沉淀沉淀煮煮沸沸凝固凝固磷钨酸磷钨酸等复盐等复盐沉淀沉淀三、蛋白质的基本单位三、蛋白质的基本单位氨基酸氨基酸蛋白质蛋白质多聚氨基酸多聚氨基酸 如图如图什么是氨基酸呢什么是氨基酸呢？牛胰脏核糖核酸酶蛋白分子氨基酸组成牛胰脏核糖核酸酶蛋白分子氨基酸组成w含有氨基的羧酸含有氨基的羧酸氨基酸氨基酸（AAAA）1.1.化学结构化学结构wR-CH(NHR-CH(NH2 2)-COOH)-COOHwR R 代代 表表 氨氨 基基 酸酸 之之 间间 相相 异异 的的 部部 分分 ，叫叫 R R 基基(R group)R group)，又又 称称 为为 侧侧 链链(sidechain)sidechain)。w无色晶体、溶于水无色晶体、溶于水不带电形式不带电形式H2NCHCOOHR 酪氨酸分子酪氨酸分子 2 2.结构通式结构通式w地地 球球 上上 天天 然然 形形 成成 的的 氨氨 基基 酸酸 有有 300300300300 种种 以以 上上 ，但但 是是 构构 成成 蛋蛋 白白 质质 的的 氨氨 基基 酸酸 只只 有有 2222 种种,且都是且都是-氨基酸（可能还存在更多氨基酸（可能还存在更多的）的）。w提问：提问：什么是什么是-氨基酸？氨基酸？w答：答：-C-C-C-C-COOHC-C-C-C-COOH w-C-C-C-C-C-C-C C(NH(NH2 2)-COOH -)-COOH -氨基酸氨基酸 w-C-C-C-C-C C(NH(NH2 2)-C-COOH -)-C-COOH -氨基酸氨基酸 w-C-C-C C(NH(NH2 2)-C-C-COOH -)-C-C-COOH -氨基酸氨基酸一）、构成蛋白质的氨基酸一）、构成蛋白质的氨基酸1 1、按酸碱性质分类：、按酸碱性质分类：（1 1）酸性氨基酸酸性氨基酸：一一氨基氨基二二羧基氨基酸羧基氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）（天冬氨酸、谷氨酸）（2 2）碱性氨基酸碱性氨基酸：二二氨基氨基一一羧基氨基酸羧基氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）（3 3）中性氨基酸中性氨基酸：一一氨基氨基一一羧基氨基酸羧基氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸）胺、丝氨酸、苏氨酸）2 2、按侧基、按侧基R R基的结构特点分：基的结构特点分：（1 1）脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸（2 2）芳香族氨基酸芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸酪氨酸（3 3）杂环氨基酸杂环氨基酸：脯氨酸、组氨酸：脯氨酸、组氨酸3 3、按侧基、按侧基R R基与水的关系分：基与水的关系分：（1 1）非极性氨基酸非极性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸。脯氨酸。（2 2）极性不带电氨基酸极性不带电氨基酸：天冬酰胺、谷：天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。（3 3）极性带电氨基酸极性带电氨基酸：天冬氨酸、谷氨：天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。4 4、按氨基酸是否能在人体内合成分：、按氨基酸是否能在人体内合成分：（1 1）必需氨基酸必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基：指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物中摄取，有八种：赖氨酸、色酸，必须从食物中摄取，有八种：赖氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸。异亮氨酸、苏氨酸。（2 2）非必需氨基酸非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨：指人体内可以合成的氨基酸。有十种。基酸。有十种。（3 3）半必需氨基酸半必需氨基酸：指人体内可以合成但合：指人体内可以合成但合成量不能满足人体需要（特别是婴幼儿时期）成量不能满足人体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸，有两种：组氨酸、精氨酸。的氨基酸，有两种：组氨酸、精氨酸。20种基本氨基酸图示w构构 成成 蛋蛋 白白 质质 的的 前前 二二 十十 种种 氨氨 基基 酸酸 的的 名名 称称 、符符 号号 、化化 学学 结结 构构 和和 疏疏 水水 性性 指指 数数 。指指 数数 愈愈 正正 表表 示示 疏疏 水水 性性 愈愈 强强 。天冬氨酸天冬氨酸赖氨酸赖氨酸精氨酸精氨酸组氨酸组氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸谷氨酸谷氨酸黑色素、甲亢黑色素、甲亢脑白金脑白金苯丙氨酸苯丙氨酸半胱氨酸半胱氨酸蛋氨酸蛋氨酸丝氨酸丝氨酸苏氨酸苏氨酸天冬酰胺天冬酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸脯氨酸脯氨酸蛋白质中不常见的氨基酸蛋白质中不常见的氨基酸（二）非蛋白氨基酸（二）非蛋白氨基酸鸟鸟氨氨酸酸、胍胍氨氨酸酸、高高半半胱胱氨氨酸酸、高高丝丝氨氨酸酸、-丙氨酸、丙氨酸、-氨基丁酸等氨基丁酸等第二节氨基酸的性质第二节氨基酸的性质一、氨基酸的光学活性和光吸收值一、氨基酸的光学活性和光吸收值二、氨基酸的解离和两性性质二、氨基酸的解离和两性性质三、氨基酸的化学反应三、氨基酸的化学反应一、氨基酸的光学活性和光吸收值一、氨基酸的光学活性和光吸收值w构成蛋白质的氨基酸构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外除甘氨酸外，均含，均含有有-碳原子，在空间各原子有碳原子，在空间各原子有两种排列两种排列方式方式：L-L-构型与构型与D-D-构型，它们的关系就构型，它们的关系就像左右手的关系，互为像左右手的关系，互为镜像关系。镜像关系。旋光性：旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。光吸收：光吸收：氨基酸在可见光范围内无光吸收，氨基酸在可见光范围内无光吸收，在近紫外区含苯环氨基酸在近紫外区含苯环氨基酸大大键键有光的吸收。有光的吸收。蛋白质故也具有紫外吸光性，实验室利用紫外分蛋白质故也具有紫外吸光性，实验室利用紫外分光光度仪在光光度仪在280280nmnm处测定蛋白质含量；处测定蛋白质含量；以以丙丙氨氨酸酸为为例例：二、氨基酸的解离和两性性质二、氨基酸的解离和两性性质 氨基酸既含有氨基，可接受氨基酸既含有氨基，可接受H H+，又含又含有羧基，可电离出有羧基，可电离出H H+，所以氨基酸具有所以氨基酸具有酸碱两性性质酸碱两性性质。通常情况下，氨基酸以。通常情况下，氨基酸以两性离子的形式两性离子的形式存在，如下图所示：存在，如下图所示：“+”“+”“不带电不带电 ”“”“”pIpI等电点时的等电点时的pHpH不同氨基酸等电点（不同氨基酸等电点（pIpI）不同不同提问：提问：为什么为什么？H3NCHCOOHR+酸性溶液中酸性溶液中（pHpI）H3NCHCOO-R+在晶体状态在晶体状态或水溶液中或水溶液中即即等电点等电点（pIpI）H2NCHCOO-R碱性溶液中碱性溶液中（pHpI）（-R R 有电性区别）有电性区别）氨基酸的水溶液既可被酸滴定，氨基酸的水溶液既可被酸滴定，又可被碱滴定，所以具有两性电又可被碱滴定，所以具有两性电离的性质，现以离的性质，现以甘氨酸甘氨酸为例来说为例来说明氨基酸两性电离的特点。明氨基酸两性电离的特点。甘氨酸的电离酸碱滴定曲线：甘氨酸的电离酸碱滴定曲线：从左向右是用从左向右是用NaOHNaOH滴定滴定的曲线，溶液的的曲线，溶液的pHpH由小由小到大逐渐升高；从右向到大逐渐升高；从右向左是用左是用盐酸盐酸滴定的曲线，滴定的曲线，溶液的溶液的pHpH由大到小逐渐由大到小逐渐降低。曲线中从左向右降低。曲线中从左向右第一个拐点第一个拐点是氨基酸羧是氨基酸羧基解离基解离50%50%的状态，的状态，第二第二个拐点个拐点是氨基酸的等电是氨基酸的等电点，点，第三个拐点第三个拐点是氨基是氨基酸氨基解离酸氨基解离50%50%的状态。的状态。w由由氨基酸的滴定曲线氨基酸的滴定曲线，可用下列，可用下列 Henderson-Hasselbalch Henderson-Hasselbalch 方程求出方程求出各解离基团的解离常数各解离基团的解离常数（pKpK）：根根据据pKpK可可求求出出氨氨基基酸酸的的等等电电点点，可可由由其其等等电电点点左左右右两两个个pKpK值值的的算算术术平平均均值求出。值求出。氨基酸等电点的计算氨基酸等电点的计算:w中性氨基酸：中性氨基酸：pKpK1 1为为-羧基的解离常数羧基的解离常数,pKpK2 2为为-氨基的解离常数。氨基的解离常数。pI=(pKpK1 1+pKpK2 2)/2氨基酸等电点（氨基酸等电点（PI）的计算的计算中性氨基酸：PI=1/2（pk1+pK2)酸性氨基酸：PI=1/2（pk1+pKR)碱性氨基酸：PI=1/2（pk2+pKR)w中性氨基酸中性氨基酸pIpI一般为一般为6.06.0 提问：提问：为什么偏酸性？为什么偏酸性？答：答：-COOHCOOH解离程度略大于解离程度略大于-NHNH2 2的得电的得电子能力子能力w提问：提问：酸性氨基酸的酸性氨基酸的pI(pI(更偏酸、更偏更偏酸、更偏碱碱）？）？答：答：更酸更酸（3.0 3.0 左左 右）右）w 碱碱 性性 氨氨 基基 酸酸pI pI 更更 碱（碱（7.67.610.7)10.7)(只只 有有 三三 种）种）w 提提 问：问：大大 多多 数数 氨氨 基基 酸酸 在在 中中 性（性（pH=7pH=7）时，时，带带 电？电？-等电点时的氨基酸等电点时的氨基酸溶解度最小，易于沉淀溶解度最小，易于沉淀w提问：提问：为什么？为什么？（较小的同性排斥）（较小的同性排斥）三、氨基酸的化学反应三、氨基酸的化学反应w由由-氨基参加的反应：氨基参加的反应：(1)(1)与亚硝酸反应：与亚硝酸反应：放出氮气，氮气的一放出氮气，氮气的一半来自氨基氮，一半来自亚硝酸，在通常半来自氨基氮，一半来自亚硝酸，在通常情况下情况下测定测定生成的生成的氮气的体积量可计算氨氮气的体积量可计算氨基酸的量基酸的量，此反应可用于，此反应可用于测定蛋白质的水测定蛋白质的水解程度。解程度。（2 2）与甲醛的反应与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法：氨基酸的甲醛滴定法 用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用氢离子，然后用NaOHNaOH滴定，从消耗的碱量可以计滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。算出氨基酸的含量。此法称为间接滴定法。RCHCOO-NH3+RCHCOO-NH2+H+OH-中和滴定中和滴定HCHORCHCOO-NHCH2OHHCHORCHCOO-N(CH2OH)2（3 3）酰化反应：酰化反应：RCHCOOHNH2RCHCOOH+HCLNHCORRCOCL与苄基（苯甲氧）甲酰氯反应：与苄基（苯甲氧）甲酰氯反应：COOHCOOH（4 4）与与2,4-2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯(DNFB)DNFB)的反应：的反应：-肽链末端分析肽链末端分析NO2FO2N+HNCHCOOHRNO2O2NHNCHCOOHR+HF弱碱性弱碱性DNP-氨基酸氨基酸（5 5）成盐反应：成盐反应：RCHCOOH+HClNH2RCHCOOHNH2HCl（6 6）与醛类的反应：与醛类的反应：西佛碱西佛碱由由-羧基参加的反应：羧基参加的反应：（1 1）成盐反应：成盐反应：AA+碱碱盐盐AA+NaOH氨基酸钠盐氨基酸钠盐(重金属盐不溶于水重金属盐不溶于水)（2 2）成酯反应：成酯反应：RCHCOOH+C2H5OHNH2RCHCOOC2H5NH2HCl气气当羧基变成乙酯后，羧基的化学性当羧基变成乙酯后，羧基的化学性质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突质就被掩蔽了，而氨基的化学性质就突出地显示出来。出地显示出来。（3 3）酰化反应：酰化反应：YNHCRHCOOH+PCl5酰化氨基酸酰化氨基酸YNHCRHCOCl酰化氨基酰氯酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。酸的氨基结合，在合成肽的工作上常用。（4 4）脱羧反应：脱羧反应：H2NCHRCOOH脱羧酶脱羧酶CO2+RCH2NH2胺胺-氨基与氨基与-羧基共同参加的反应羧基共同参加的反应 茚三酮可与脯氨酸、羟脯氨茚三酮可与脯氨酸、羟脯氨酸生成酸生成黄色黄色化合物，与其它氨化合物，与其它氨基酸生成基酸生成蓝紫色蓝紫色化合物。化合物。蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反反应应有有关关基基团团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双双缩缩脲脲反反应应NaOH、CuSO2紫紫色色或或粉红色粉红色二二个个以以上上肽键肽键所所有有蛋蛋白质白质米伦反应米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2、HNO3红色红色Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNOHNO3 3及及NHNH3 3黄黄 色色、橘色橘色Tyr、Phe乙乙醛醛酸酸反反应应乙乙醛醛酸酸试试剂剂及浓及浓H H2 2SOSO4 4紫色紫色Try坂口反应坂口反应SakaguchiSakaguchi-萘萘 酚酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚酚试试剂剂反反应应（FolinuFolinu）碱碱 性性 CuSOCuSO4 4及及磷磷钨钨酸酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚酚基基、吲吲哚基哚基TyrOHN第三节氨基酸的分离与测定第三节氨基酸的分离与测定w层析法层析法w电泳法电泳法w氨基酸的显色反应氨基酸的显色反应一、层析法一、层析法 层析法是利用被分离样品混合物中各层析法是利用被分离样品混合物中各组分的组分的化学性质化学性质的差异，使各组分以不的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相一个同程度分布在两个相中，这两个相一个为为固定相固定相，另一个为，另一个为流动相流动相。当流动相。当流动相流进固定相时，由于各组分在两相中的流进固定相时，由于各组分在两相中的分配情况不同或电荷分布不同或离子亲分配情况不同或电荷分布不同或离子亲和力不同等，而以不同的速度前进，从和力不同等，而以不同的速度前进，从而达到分离的目的。而达到分离的目的。（常见：滤纸层析（常见：滤纸层析、薄层层析、离子交换层析薄层层析、离子交换层析、亲和层析亲和层析）一）滤纸层析）滤纸层析-分离、鉴定分离、鉴定AAAA混合物的方法混合物的方法固定相：纤维素上吸附的水固定相：纤维素上吸附的水流动相：展层溶剂流动相：展层溶剂（二）薄层层析（二）薄层层析优点：分辨率高，所需样品量微，层析优点：分辨率高，所需样品量微，层析速度快，可使用的支持剂种类多（纤维速度快，可使用的支持剂种类多（纤维素粉、硅胶、素粉、硅胶、M2O3M2O3），），应用广泛。应用广泛。（五）离子交换层析（五）离子交换层析-是一种用离子交换是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法树脂做支持剂的层析法 注意：注意：AAAA与树脂结合牢固程度与树脂结合牢固程度 （AAAA与树脂间的亲和力）与树脂间的亲和力）1 1 静电吸引静电吸引2 2 AAAA侧链与苯乙烯间的疏水相互作用侧链与苯乙烯间的疏水相互作用 PH=3 AA PH=3 AA与阳离子交换树脂之间静电力：与阳离子交换树脂之间静电力：碱性碱性AAAA（R2+R2+）中性中性AAAA（R+R+）酸性酸性AA AA 洗脱顺序洗脱顺序：酸性：酸性AAAA，中性中性AAAA，碱性碱性AA AA（四）高效液相层析（四）高效液相层析（HPLCHPLC）优点：快速，优点：快速，灵敏，高效灵敏，高效特点：（特点：（1 1）使用的固定使用的固定相支持剂颗相支持剂颗粒很细，因粒很细，因而表面积很而表面积很大；大；（2 2）溶剂系数采溶剂系数采取高压，因取高压，因此洗脱速度此洗脱速度增大。增大。二、电泳法二、电泳法电电泳泳是是指指带带电电的的颗颗粒粒在在电电场场中中向向着着以以其其颗颗粒粒所所带带电电荷荷相相反反的的电电极极移移动的现象。动的现象。三、氨基酸的显色反应三、氨基酸的显色反应(见见PPT55PPT55）