脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究_徐婧婷.pdf

，收稿日期：；修回日期：作者简介：徐婧婷（），女，高级工程师，研究方向为植物蛋白加工利用。：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究徐婧婷，赵灵芝，高伟，连运河，宋伟光，郭顺堂（植物蛋白与谷物加工北京市重点实验室 中国农业大学食品科学营养工程学院，北京 ；晨光生物科技集团股份有限公司，河北 邯郸 ）摘要：为明确脱酚处理对棉籽粕消化性的影响，采用甲醇脱酚处理获得不同游离棉酚含量的棉籽粕，比较了各棉籽粕的蛋白质体外消化性，并进一步以豆粕为对照，比较了市售高温脱酚棉籽粕、市售甲醇脱酚棉籽粕和自制脱酚棉籽粕的蛋白质体内外消化性差异，确定游离棉酚的含量与棉籽粕蛋白质消化性的平衡关系，明确脱酚处理对棉籽粕消化性的影响。结果表明：将高温棉籽粕进行甲醇处理可有效降低其游离棉酚含量（从大于 降至 以下），并提高其消化率（从 升至），但并不是游离棉酚含量越低其蛋白质消化性最高。当自制脱酚棉籽粕的游离棉酚含量在 时，其体内外消化率均可达 以上，而市售甲醇棉籽粕的游离棉酚仅为 ，但体内外消化率为 。这说明适度的脱酚处理在降低游离棉酚的同时，也有利于蛋白质消化率的提升。由此建议企业在实际的生产中，适度进行脱酚处理（约 ），既可以有效保障产品的安全性，更可以提升蛋白质的消化性。关键词：棉籽粕；游离棉酚含量；脱酚处理；蛋白质体外消化率；蛋白质表观消化率中图分类号：文献标志码：文章编号 （），（，；，）：，（）（），（），：；棉籽粕是棉籽仁经提油后获得的副产物，富含蛋白质（约 ），可被作为豆粕替代物用于畜禽蛋白饲料。然而棉籽粕里含有棉酚、植酸、单宁等多种抗营养因子，特别是棉酚的存在，使棉籽粕徐婧婷等：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究 年第期 的应用受到了较大的限制。棉酚是一种黄色多酚物质，主要存在于棉花的根、茎、叶和籽粒的色素腺体中，根据存在形式可分为游离棉酚（，）和结合棉酚（，），其中游离棉酚是棉籽粕中主要的有毒有害物质，摄入过量会导致机体胃黏膜损伤、神经系统紊乱，严重者会中毒死亡；当游离棉酚与棉仁中的磷脂、蛋白质、糖等结合生成结合棉酚后，其毒性消失，因此国家对饲料中游离棉酚的限量作出了明确规定。而通过有效的手段降低或除去棉籽粕中游离棉酚的含量，俗称“脱毒”，是棉籽粕生产加工中最重要的环节之一。目前对于棉籽粕的“脱毒”技术国内外学者展开了大量的研究，其方法包括化学脱毒法、物理脱毒法、微生物发酵脱毒法等。其中高温膨化法和甲醇萃取法是目前工业化应用最为普遍的两种方法。高温脱毒是通过高温膨化作用破坏腺体色素，使游离棉酚与赖氨酸发生反应形成结合棉酚，从而降低游离棉酚的含量。而甲醇脱毒则是根据棉酚易溶于醇类的特点，通过甲醇正己烷混合萃取的方式将棉酚提取出来达到脱毒的效果。在棉籽粕“脱毒”的过程中，其蛋白质会发生变性从而影响其消化性。尤其是高温脱酚棉籽粕（以下简称高温棉籽粕）采用不当的高温处理在降低游离棉酚含量的同时会引起蛋白质变性，造成必需氨基酸损失，进而影响蛋白质消化性、降低氨基酸利用率等；甲醇脱酚棉籽粕（以下简称甲醇棉籽粕）虽然生产全程温度相对较低，但甲醇也会引起蛋白质变性，进而影响其消化性。为明确两种游离棉酚的“脱毒”过程对棉籽粕蛋白质消化性的差异，本研究以甲醇处理棉籽粕获得不同游离棉酚含量的棉籽粕，分析了它们的蛋白质体外消化性，并进一步比较了市售高温脱酚棉籽粕、市售甲醇脱酚棉籽粕的游离棉酚含量和蛋白质体内外消化性差异。以此明确两种脱棉酚棉籽粕各自的营养优势。材料与方法 材料与仪器市售高温棉籽粕（、）、脱壳生棉仁、豆粕（）市售；市售甲醇棉籽粕（），晨光生物科技集团股份有限公司提供；胃蛋白酶（，酶活效价 ）、胰蛋白酶（，酶活效价 ）、糜 蛋 白 酶（酶 活效 价 ）、淀粉酶（酶活效价 ）、脂肪酶 （酶活效价 ），北京索莱宝科技有限公司；甲醇、磷酸氢二钠、盐酸磷酸二氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫氨酸、脲素、甘油、异丙醇、正已烷，国产分析纯；纤维素透析袋，生工生物工程（上海）股份有限公司；透析袋夹，上海谱科生物技术有限公司；蛋白喂养饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司；级雄性大鼠，斯贝福（北京）生物技术有限公司（许可证号：（京）。型电子天平，日本岛津公司；型全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；型高速粉碎机，天津泰斯特股份有限公司；型酸度计，上海三信仪表厂；型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；型数显恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；型恒温磁力加热搅拌器，天津市华北实验仪器有限公司；型旋转蒸发器，上海申生科技有限公司；型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；新型代谢笼，深圳市瑞沃德生命科技有限公司。实验方法 脱脂棉籽粕的制备结合相关文献及晨光公司的棉籽粕生产工艺，在实验室条件下制备脱脂棉籽粕 。将脱壳生棉仁破碎后过 目筛，将过筛后的生棉仁粉与正己烷按照料液比（）混合，在室温下搅拌浸提后抽滤去除脱脂废液并获得第一次脱脂棉籽粕；之后将第一次脱脂棉籽粕与正己烷按照料液比（）混合，在室温下搅拌浸提 后抽滤除去脱脂废液，并如此往复次后获得最终的脱脂棉籽粕，将脱脂棉籽粕置于通风橱中自然挥发去除溶剂后即为脱脂棉籽粕。同时，每一次处理后的脱脂废液 于 下 旋 蒸 回 收，可 实 现 正 已 烷 的 重 复使用。脱酚棉籽粕的制备按王成涛等 的方法略加修改。以 中所获脱脂棉籽粕为原料，（）甲醇为脱酚溶剂，按照料液比（）混合，在室温下搅拌浸 徐婧婷等：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究 年第期提 后，抽滤除去脱酚废液，如此多次重复脱酚（最多次），分别收集不同脱酚次数下的脱酚棉籽粕，将其置于通风橱中自然晾干，获得不同脱酚次数下的自制脱酚棉籽粕。高温棉籽粕的脱酚处理将两种市售的高温棉籽粕、经高速粉碎机破碎后过 目筛，筛下物混合均匀后收集待用。以（）甲醇为脱酚溶剂，按照料液比（）混合，室温下搅拌浸提 后抽滤除去脱酚废液，将再脱酚高温棉籽粕置于通风橱中自然晾干，获得再脱酚处理的高温棉籽粕，分别记为 和 。粗蛋白含量的测定参照 饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法。游离棉酚含量的测定参照 饲料中游离棉酚的测定方法。蛋白质溶解度的测定参照 饲料原料 豆粕 附录的方法测定。体外模拟消化实验本实验参照赵峰等 的实验方法，略有改动，具体实验步骤如下：模拟胃液：称取适量胃蛋白酶，用 溶液（）配制成的胃蛋白酶盐酸溶液。模拟 小 肠 消 化 液：用 溶液配制成淀粉酶活性 ，脂肪酶 ，胰蛋白酶 ，糜蛋白酶 的小肠消化液，现配现用。胃蛋白酶水解过程：根据样品的蛋白质含量称取适 量 待 消 化 样 品（总 蛋 白 质 含 量 ）置于具塞三角瓶中，加入 的胃蛋白酶盐酸溶液，用 调至 ，在 水浴锅中平衡 置于恒温振荡箱中，转速 ，温度，后计时，振荡。人工小肠液酶水解过程：胃消化阶段结束后，取出三角瓶，用 中和，加入 人工小肠液，调节至 ，继续在，下振荡。消化产物透析实验消化产物透析方法参照黄瑞林等 的方法略有改动，具体步骤如下：透析袋预处理：将透析袋剪成 的小段，在（）的 和 （）中煮沸 ，取出透析袋用蒸馏水清洗干净，再放在 （）中煮沸 后用蒸馏水彻底清洗。将清洗完的透析袋置于 酒精溶液中保存，随用随取。消化产物透析：小肠消化阶段结束后，取出三角瓶，置于 水浴锅中灭酶 ，将消化产物全部转移至透析袋，用透析夹夹紧后置于 透析液中，透析，期间每 更换一次透析液。不同样品蛋白质体外消化率的测定透析结束后，将透析袋内的残渣全部转移至干净的玻璃培养皿中，烘干至恒重后将消化残渣全部刮下，称重后转移到已知绝干重量的玻璃砂芯坩埚中，置于 烘箱中烘干至恒重，记录重量后测定粗蛋白含量，计算蛋白质体外消化率（消化产物中分子量小于 的组分所占的比例）。蛋白质体外消化率的计算公式如下：蛋白质体外消化率（）式中，表示空白组中的粗蛋白含量，；表示样品中的粗蛋白含量，；表示透析残渣中的粗蛋白含量，。饲料配制参考美国分析化学家协会（，）中蛋白质功效比值（，）测定方法中的饲料配方要求设计蛋白喂养饲料，并委托特洛菲饲料科技有限公司制作。饲料（蛋白质含量 ）配方如下：玉米淀粉 ，糊精 ，试验蛋白样品，蔗糖 ，粉状 纤 维 素 ，豆 油 ，矿 物 质 混 合 物 ，复 合 维生 素 ，酒 石 酸 氢 胆 碱 ，半胱氨酸 ，。动物实验 只 级雄性大鼠，周龄，体重 。将 只大鼠按照区组设计法分成组，每组只。大鼠单独饲养在笼中，适应期每天饲喂豆粕配合饲料，自由饮水。大鼠经适应期后禁食，清理干净料槽中的饲料。随后正试期饲喂相应实验组饲料，限量，自由饮水。在给徐婧婷等：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究 年第期 予实验组饲料的第一天对每只大鼠进行墨汁灌胃，当动物开始出现黑便后收集粪便。连续，每天收集粪便于 保存。实验期室内温度 ，湿度 ，光照 明暗交替。组 为 参 比 组，饲 料 中 蛋 白 质 来 源 为 豆 粕（）；组饲料中蛋白质来源为市售高温棉籽粕（）；组饲料中蛋白质来源为市售高温棉籽粕（）；组饲料中蛋白质来源为市售甲醇棉籽柏（）；组饲料中蛋白质来源为自制脱酚棉籽粕（）。采食量测定：每天上午点投喂对应实验组饲料，同时将每天笼中的撒料、剩料收集烘干称重记录，计算动物每天的进食量、平均日采食量。粪便收集及处理方法：每日中午 点和下午点收集粪便，收集到的粪便置于 冰箱内保存。正试期结束后将粪便合并，去除毛发、饲粮碎屑 等 杂 物 后 混 合 均 匀 称 重，取 总 粪 的 于 烘箱内烘干至恒重，自然回潮 后称重，回潮样 品 作 为 粪 样 保 存 在 冰 箱 待 测 粪 氮含量。蛋白质表观消化率测定参照 饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法 测定饲料和粪便中粗蛋白的含量，计算每种蛋白饲料的蛋白质表观消化率，计算公式如下：蛋白质表观消化率 式中，表示老鼠平均每日进食量，；表示老鼠平均每日粪便重量，；表示饲料中蛋白质的含量，；表示粪便中蛋白质的含量，。数据处理所有实验均进行重复实验，结果取其平均值。数据采用 软件、软件和 软件进行统计分析。结果与分析 甲醇脱酚处理对高温棉籽粕蛋白质体外消化性的影响甲醇处理是利用游离棉酚易溶于甲醇的这一特点而对棉籽粕中的棉酚进行去除的方法。为明确脱除游离棉酚后的棉籽粕蛋白质消化性，本研究首先以两种游离棉酚含量较高（约为 ）的市售高温棉籽粕为原料，将其进行甲醇脱酚处理，并比较了脱酚前后两种棉籽粕的体外蛋白质消化性差异，其结果如表和图所示。表高温棉籽粕经甲醇脱酚处理后的基本成分比较指标 粗蛋白质 游离棉酚含量 注：、为两种市售高温棉籽粕；为甲醇再脱酚处理的样品；为甲醇再脱酚处理的 样品。由表可知，经甲醇再脱酚处理后，两种高温棉籽粕的粗蛋白含量变化不显著，但游离棉酚含量分别 从 和 降 低 至 和 ，分 别 减 少 了 和 ，说明高温棉籽粕尚有大量的游离棉酚的存在。经过甲醇脱酚后的两种高温棉籽粕蛋白质体外消化率均有所上升，和 两种棉籽粕的蛋白质消化率分别从原来的 和 上升至 和 （见图），说明采用甲醇对高温棉籽 粕 脱 棉 酚 能 进 一 步 提 高 棉 籽 粕 蛋 白 质 体 外消化率。注：、为两种市售高温棉籽粕图高温棉籽粕再脱酚处理前后蛋白质的体外消化率比较 脱酚处理对游离棉酚含量与蛋白质体外消化性的影响为明确游离棉酚与蛋白质消化率的关系，本研究采用甲醇对棉籽粕进行脱酚处理，制备不同游离棉酚含量的棉籽粕，比较不同游离棉酚含量棉籽粕的蛋白质体外消化率，结果如表和图所示。表不同脱酚次数下棉籽粕中游离棉酚的含量 指标脱酚次数 游离棉酚含量 注：指未经甲醇脱酚的脱脂棉籽粕从表可知，未经过脱酚处理的棉籽粕其游离 徐婧婷等：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究 年第期棉酚含量高达 ，而经过甲醇脱酚处理（次脱酚）后，其含量迅速下降至 ，减少了 。此外，随着脱酚次数的增加，棉籽粕中游离棉酚脱除效果逐步减少，到第次时，游离棉酚含量达到了 ，减少了 。对不同游离棉酚含量的棉籽粕进行体外模拟消化实验，其蛋白质消化率结果如图所示。从图中可知，随着脱酚次数的增加，即随着游离棉粉含量的减少，蛋白质的体化消化率呈先上升后下降的趋势，其中脱酚次时的棉籽粕蛋白质体外消化率最高。从开始脱酚到脱酚次时，蛋白质消化率呈缓慢上升趋势，从未脱酚的 上升至 。而当脱酚次和次时，棉籽粕的蛋白质体外消化率迅速下降至 和 ，也远低于未进行脱酚处理的棉籽粕。结合相关文献分析，棉籽蛋白多为球蛋白，甲醇等有机溶剂可改变蛋白质分子结构使其发生变性。当甲醇溶剂浓度较低时，蛋白质分子结构部分伸展，亲水基团和消化酶切位点暴露，有利于增强蛋白质消化性；而随着甲醇用量的增加，蛋白质变性程度更大，此时的蛋白质极易发生分子重排或聚合形成比天然蛋白结构更有序的聚集体，进而使其溶解性和消化性降低 。因此推测当脱酚次数大于次时，过度的甲醇处理使棉籽粕中的蛋白质发生严重变性，从而导致棉籽粕蛋白质体外消化率的降低。，不同为统计学上的显著差异（），注：指未经甲醇脱酚的脱脂棉籽粕。图不同脱酚程度棉籽粕的蛋白质体外消化率结合图中游离棉酚含量和蛋白质消化率可以明确，脱除棉籽粕游离棉酚有利于提升蛋白质消化率。但是过度的甲醇处理引起蛋白质变性，反而会影响蛋白质的消化率。从实验结果看，脱酚次数次时蛋白质体外消化率最高，达 ，此时游离棉酚含量在 左右。不同工艺处理的棉籽粕蛋白质消化性差异比较 不同工艺处理的棉籽粕游离棉酚含量与体外消化率比较为进一步明确脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响，本研究以普通豆粕（）为对照，比较市售高温棉籽粕（、）、市售甲醇棉籽粕（）和自制棉籽粕（）这种样品的游离棉酚含量和蛋白质体外消化性的差异。其中自制棉籽粕（）即为 章节中消化性最好的第次脱酚处理所获样品。从表中可以看出，与普通豆粕相比，高温棉籽粕的粗蛋白含量均在 左右，而市售甲醇棉籽粕和自制棉籽粕的粗蛋白含量均达到 以上，显著高于高温棉籽粕。在游离棉酚含量上，市售甲醇棉籽粕的含量最低，仅为 ，低于自制棉籽粕的 ，远低于高温棉籽粕的 和 。表不同样品的基本成分样品粗蛋白游离棉酚 注：为市售豆粕，、为两种市售高温棉籽粕，为市售甲醇棉籽粕，为第次脱酚处理的自制棉籽粕。从图中的蛋白质消化性来看，两种高温棉籽粕的蛋白质体外消化率分别为 和 ，市售甲醇棉籽粕的蛋白质体外消化率为 ，显著高于高温棉籽粕；但总体而言种市售棉籽粕的蛋白质体外消化率均低于豆粕。但自制棉籽粕体外消化率却最高，达 ，与豆粕的蛋白质消化率近似。这一结果进一步说明适当地控制甲醇对棉籽粕的处理程度和脱除棉酚，可以有效地提高棉籽粕蛋白质的消化性，使其成为一种优良的蛋白质饲料。从上述结果看出，棉籽粕游离棉酚含量约为 时，其蛋白质消化性能保持较好的水平。因此建议生产企业在实际的工业化生产中，既要降低游离棉酚含量，同时还要注意不能引起棉籽蛋白质的过度变性，否则过度的处理可能会对蛋白质的消化性造成不良影响。徐婧婷等：脱酚处理对棉籽粕蛋白质消化性的影响研究 年第期，不同为统计学上的显著差异（），图不同脱酚工艺下棉籽粕的蛋白质体外消化率 不同工艺处理的棉籽粕体内蛋白质表观消化性比较动物体内的消化过程是极为复杂的，单纯的体外消化分析有一定的局限性，例如饲料中粗纤维种类和含量对食糜通过胃肠道速率的影响，酚类、胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子对营养物质在动物体内消化吸收的影响等。因此，为进一步明确游离棉酚含量与蛋白质消化性的关系，本研究进一步进行了大鼠体内消化实验，比较不同工艺处理下的棉籽粕蛋白质的体内消化性情况。，不同为统计学上的显著差异（），图不同脱酚工艺下棉籽粕蛋白质表观消化率大鼠体内消化实验结果如图所示，总的趋势与蛋白质体外消化率类似。与豆粕相比，两种高温棉籽粕表观消化率在所有样品中均仍为最低，分别为 和 ，市售甲醇棉籽粕的消化率为 ，与高温棉籽粕差异不显著；另一方面，自制棉籽粕的大鼠体内表观消化率在个样品中仍为最高，达 ，表现了较好的消化性。因此，体内实验进一步证明，棉籽粕可作为一种良好的蛋白质来源应用于动物饲料中，如果在棉酚的脱除工艺把握适当，可以在既保证食用安全的同时达到较好的蛋白质消化利用率。结论棉籽粕是一种重要的植物蛋白原料，可作为重要蛋白质来源应用于饲料中。然而游离棉酚是影响棉籽粕应用的重要抗营养因子，为实现其应用，工业上首先会对其进行脱酚处理，其中应用最为广泛的方法为高温脱酚法和甲醇萃取脱酚法。但这种脱酚处理过程是否会对棉籽粕的蛋白质消化性产生影响目前尚不可知。因此，为明确游离棉酚的含量与蛋白质消化性的关系，本研究首先比较了高温棉籽粕脱酚前后的消化性差异，实验结果表明：自制脱酚棉籽粕体内外消化率可达，而市售甲醇棉籽粕的游离棉酚含量最低（仅为 ），但体内外消化率为 。这说明适度的脱酚处理，在降低棉籽粕游离棉酚的同时，也有利于蛋白质消化率的提升。但脱酚次数不易过多，否则反而会因为甲醇的过度处理引起蛋白质的变性，影响蛋白质的消化率。由此建议生产企业在实际的工业化生产中，既 要 尽 可 能 降 低 棉 籽 粕 中 的 游 离 棉 酚 含 量（），但同时也要注意脱除处理对蛋白质结构的影响，使蛋白质能保持较好的消化水平。参考文献周建中，张晖棉籽蛋白的研究进展及其在食品中的应用 农产品加工，（）：张大煜棉酚的性质及其用途无锡轻工业学院学报，（）：，：王丽，王薇薇，周航，等棉粕脱毒工艺及游离棉酚对蛋鸡性能影响的研究进展粮油食品科技，（）：侯红利，罗宇良 棉酚毒性研究的回顾 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索氏抽提法测定蓖麻含油率的条件优化江苏农业科学，（）：邹立飞，郑鹏响应面法、神经网络优化薏仁米酒产氨基酸态氮 食品研究与开发，（）：金灿，李克虎，等响应面法优化糜子油提取率粮油食品科技，（）：王芳，廖亮，赵晓敏，等 响应面法优化油菜籽粕中硫苷的提取工艺中国食品添加剂，（）：康姮，路彬，李晓青 响应面法优化胡萝卜山药儿童饼干配方 中国食品添加剂，（）：陈晓，易雪平，倪穗索氏提取法提取牡丹籽油的工艺优化研究 中国野生植物资源，（）：郭彩霞，任晓婷，张生万，等 响应面法优化超声波辅助提取猕猴桃果皮多酚工 艺研究 食品工业科技，（）：刘玲玲，武彦文，欧阳杰，等 利用红外光谱技术快速分析食用油与地沟油第十六届全国分子光谱学学术会议论文集，（责任编辑：梅竹）（上接第 页）汲怀兵，唐金泉，宋卫国，等低温脱酚棉籽蛋白与普通棉粕和高蛋白棉粕的比较粮油食品科技，（）：王如南，朱丹丹，田令善，等整棉仁轧坯萃取制备高蛋白棉粕的工艺研究中国油脂，（）：刘大川，邹丽娟棉仁低温压榨饼己烷甲醇分步浸出工艺研究 中国油脂，（）：王成涛，朱丹丹，张燕飞，等甲醇乙醇混合溶剂萃取脱酚制备脱酚棉籽蛋白的工艺研究中国油脂，（）：中国国家标准化管理委员会 ，饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法北京：中国标准出版社，国家标准化管理委员会 ，饲料中游离棉酚的测定方法，北京：中国标准出版社，国国家标准化管理委员会 ，饲料原料 豆粕 北京：中国标准出版社，赵峰，赵江涛，张宏福 基于人工消化液与密闭消化器的酶法测定豆粕鸭代谢能值的研究畜牧兽医学报，（）：黄瑞林，李铁军，谭支良，等透析管体外消化法测定饲料蛋白质消失率的适宜酶促反应条件研究动物营养学报，（）：黄光云，韦明松，罗鲜青，等仿生法评定种青贮饲料营养消化率的初步研究 饲料研究，（）：杨永兰，夏淑芳，刘骥，等蛋氨酸羟基类似物对小鼠营养物质消化 和 肌 肉 生 长 的 影 响 动 物 营 养 学 报，（）：沈俊，陈达图，胡官波，等生长猪脱酚棉籽蛋白消化能的评定及估测模型研究动物营养学报，（）：，：，（）：石彦国，杨泽慧，孙冰玉醇浓度对醇法大豆浓缩蛋白浸提液中溶出蛋白的影响中国粮油学报，（）：叶宏涛，刘国华 体外消化法在动物上的应用 饲料工业，（）：（责任编辑：刘斌嘉）