一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究_张松梅.pdf

饲料添加剂 ，收稿日期：；修回日期：基金项目：德宏州张以芳专家基层科研工作站，云南省张以芳专家基层科研工作站，云南省“万人计划”产业技术领军人才专项（）。作者简介：张松梅（），女，本科，主要研究方向为生物技术。：一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究张松梅，邓成松，邓绍贤，鲁金强，余世祥，吴绍伟，柴俊，张云娟，张天羽，王鑫文，杨亮宇，张以芳（德宏州尚善品味农业有限公司，云南 德宏 ；曲靖千村农牧科技集团，云南 曲靖 ；云南农业大学动物医学院，云南 昆明 ）摘要：针对现有技术制得的乳酸菌胶囊中乳酸菌活性低、在肠道内不能迅速释放、不能耐受饲料制粒过程中的高温、储存过程中容易吸湿变质以及成本较高的缺点，研究了一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法。研究以乳杆菌为芯材，用海藻酸钠 壳聚糖体系制备成乳杆菌微胶囊，通过筛选优化制备工艺，对所制得的乳酸菌微胶囊与未包埋的乳酸菌在其耐酸性、耐胆盐性、耐高温性、储存性和在模拟肠道中崩解释放效果进行比较。结果表明，乳酸菌微胶囊最优工艺为海藻酸钠浓度为，菌液海藻酸钠（）为，浓度为，壳聚糖浓度为；并且所制得的乳酸菌微胶囊与未包埋的乳酸菌相比，其耐酸性、耐胆盐性、耐高温性和储存性都有了明显提高，并能在肠道中迅速崩解释放出乳酸菌。最终所制备的乳酸菌微胶囊具有良好的耐胃酸、耐胆盐消化能力，并有望添加到动物饲料中进行高温（）制粒和长期储存。关键词：饲料添加剂；乳酸菌；微胶囊制备；特性研究中图分类号：文献标志码：文章编号 （），（，；，；，）：，（），（）：；张松梅等：一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究 年第期 乳酸菌（）是指一类能发酵糖类产生乳酸的无芽胞、革兰染色阳性细菌的总称，是应用最早的一种益生菌，已被广泛添加于各种动物饲料中。乳酸菌的抗逆性较差，经过饲料制粒、体内胃酸和胆汁作用后，严重影响其应用价值，因此，对乳酸菌进行微胶囊包埋已成为国内外研究的热点。胃液的 值通常在 以下，此酸度使得绝大部分被摄入的乳酸菌被破坏，只有约百万分之一的乳酸菌能活着到达大肠。当把乳酸菌添加于饲料中制粒时，通常的饲料制粒温度为，在此温度下仅 即可使得乳酸菌损失 。另外，在饲料生产和畜禽养殖中，为便于使用，通常将乳酸菌直接加入全价料或添加剂预混料中，因这两者都存在大量的微量元素金属离子（如 、和 ）、维生素类（如氯化胆碱）及抗生素等物质，这些物质均会通过一系列氧化还原反应、酸碱度变化、改变乳酸菌生存微环境等方式影响到乳酸菌的存活和活力。为了使添加到饲料中的乳酸菌经饲料制粒处理后能保持较高活性，及进入动物体内能耐胃酸胆汁并到达肠道起益生作用，本研究以乳酸菌为芯材，用海藻酸钠 壳聚糖体系制备成乳酸菌微胶囊，并对其进行微胶囊高温耐受性检测、人工胃液及胆汁的耐受性检测和肠溶性检测。本研究为乳酸菌的应用及乳酸菌微胶囊的生产提供参考。材料与方法 菌种及试剂乳酸菌为本实验室分离保存，培养基购自北京陆桥技术有限责任公司，厌氧袋，乙醇，氯化钙，海藻酸钠，壳聚糖，冰乙酸，柠檬酸三钠，盐酸，磷酸氢二钾，氢氧化钠，胰蛋白酶，胃蛋白酶。主要设备试生化培养箱，鼓风干燥器，紫外分光光度计，厌氧培养罐，精密增力电动搅拌器，恒温培养箱震荡器等。主要溶液配置主要溶液配置见表。胶囊芯材制备（乳酸菌培养）将乳酸菌接入 液体培养基，在恒温生化培养箱中 厌氧培养至液体变混浊，活菌数达到约为 以上，将培养所得的处于稳定期前期的乳酸菌经离心分离后，弃上清，将收集到的菌体制成菌悬液，加入菌悬液总重 的菌种保护剂，静置一段时间，即为乳酸菌液胶囊芯材。表主要溶液及配置方法名称配置方法人工胃液取质量浓度为 的盐酸 ，加蒸溜水稀释，调节 值至。然后加入胃蛋白酶，加入量按照 的质量浓度比（人工胃液中加入胃蛋白酶）计算，充分溶解后，用孔径 微孔滤膜过滤除菌，即得人工胃液。人工肠液称取 ，加 入 蒸馏水 溶 解，用 调节 值为；另取胰蛋白酶，加适量水溶解，将两液混合后，用水定容至 ，用孔 径 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌，即 得 人 工肠液。解囊液柠檬酸三钠溶于蒸馏水中，配制成浓度为的溶液，灭菌 。人工模拟胆汁溶液号胆盐溶于蒸馏水中，浓度为，过滤除菌。稀释液 的生理盐水，灭菌条件为 ，。普鲁兰多糖改性首先取普鲁兰多糖按照 的比例溶解于二甲基亚砜中，得普鲁兰多糖溶液，备用；然后将份质量的胆固醇和份质量的琥珀酸酐溶解于份质量的吡啶中，并加入冰盐酸，得到白色絮状沉淀，冷藏过滤后收集；将该白色絮状沉淀用蒸馏水洗至 值大于，并置于乙酸乙酯乙醇中重结晶，之后经 干燥，得白色针状琥珀酰胆固醇；取琥珀酰胆固醇、二甲氨基吡啶溶解于二甲基亚砜中，反应活化 ，得反应液；将反应液加入普鲁兰多糖溶液中进行反应后，滴入无水乙醇中，析出白色沉淀状的改性隔水普鲁兰多糖，经冲洗干燥后备用。制备壁材按比例分别称取壁材原料，包括结冷胶、海藻酸钠、改性淀粉，按质量计算，结冷胶、海藻酸钠、改性淀粉三者占壁材总干重的，且结冷胶 海 藻 酸 钠 改 性 淀 粉（）（）（），取结冷胶溶解于相应比例的纯化水中，搅拌至完全溶解后依次加入相应比例的海藻酸钠和改性淀粉，继续搅拌混合均匀，得到壁材溶液。制备胶囊将壁材溶液和胶囊芯材按的质量比同时泵送通过同心多元喷嘴，将其滴入 的石蜡油中，通过结冷胶的低温凝胶特性，形成乳酸菌微胶囊半成品；胶囊滴制后收集，用石油醚清洗石蜡油，将胶囊半成品浸入 的氯化钙溶液中，海藻酸钠与钙离子结合形成海藻酸钙，完成胶囊的二 张松梅等：一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究 年第期次凝胶，与结冷胶共同构成胶囊壁壳，保证胶囊成品的弹性和韧性。包衣将上述制好的改性隔水普鲁兰多糖与改性淀粉混合研磨后加水制成包衣液，按常规工艺对乳酸菌微胶囊半成品进行包衣，改性隔水普鲁兰多糖与改性淀粉的用量为乳酸菌微胶囊质量的。干燥完成包衣的乳酸菌微胶囊放入转笼中进行定型和预干燥。通过定型的乳酸菌微胶囊放入湿度为 的干燥间，静置干燥，收集后剔除次品，得到乳酸菌微胶囊成品。正交试验设计参考有关文献，选择对乳酸菌微胶囊制备影响较大的个因素，即海藻酸钠浓度、菌液与海藻酸钠的体积比、壳聚糖质量浓度、质量浓度，采用因素水平（）正交试验设计，以包埋率和粒径为评价指标，筛选出乳酸菌微胶囊的制备工艺。微胶囊配方（）正交试验设计如表所示。表微胶囊配方（）正交试验设计表水平海藻酸钠质量浓度菌液海藻酸钠 质量浓度壳聚糖质量浓度 包裹效率和粒径测定（微胶囊质量评价）包裹效率测定：称取 微胶囊份，分别加入到 灭菌水和 解囊液中，在胶囊待胀溶和溶解完全时，分别采用梯度稀释法稀释，并将稀释后的液体倾注于含碳酸钙的 琼脂平板上，置培养箱中厌氧培养 后进行活菌计数，并计算包封率。包封率（）（为微胶囊的活菌数（微胶囊表面与其内部活菌数之和）；为微胶囊表面的活菌数）。粒径测定：随机取制得的微胶囊颗粒若干，分别用游标卡尺测量其粒径，取其平均值。计算公式为：（为粒径，为微胶囊颗粒数）。乳酸菌胶囊特性分析 微胶囊在人工胃液和肠液的溶出情况检测称取微胶囊份，分别置于 人工胃液 和 人 工 肠 液 中，于 摇 床 中 处理。分别 于、时取样，以人工胃液和人工肠液为空白对照组，测 值，根据 值变化情况来分析人工胃液和人工肠液中微胶囊的溶出情况。微胶囊对人工胃液、人工胆汁的耐受性和崩解性检测称取微胶囊，溶解于 的人工胃液中，于摇床中 处理。后取样，将微胶囊过滤，用生理盐水洗涤至中性，干燥。将干燥好的微胶囊用解囊液处理后，采用梯度稀释法进行活菌计数。称取微胶囊，溶解于 的人工胆汁中，于摇床中 处理。后取样，将微胶囊过滤，用生理盐水洗涤至中性，干燥。将干燥好的微胶囊用解囊液处理后，采用梯度稀释法进行活菌计数。称取微胶囊，溶解于 的人工肠液中，于摇床中 处理。后取样，采用梯度稀释法进行活菌计数。微胶囊对高温的耐受性检测分别称取微胶囊加入到 解囊液和 液体培养基中，待解囊液组完全溶解，液体培养基组不做处理。两组试管同时放入 水浴锅中，分别在、取样，采用梯度稀释法进行活菌计数。微胶囊的稳定性检测称取 微胶囊以铂纸密封，恒温培养箱条件下中放置个月，每个月取出份（）微胶囊。采用梯度稀释法进行活菌计数。并与未包埋的乳杆菌进行比较。结果与分析 制备乳酸菌微胶囊最佳配方的筛选结果表微胶囊配方筛选的（）正交试验结果试验编号海藻酸钠质量浓度菌液海藻酸钠 质量浓度壳聚糖质量浓度包封率平均粒径 张松梅等：一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究 年第期 通过测定微胶囊包封率的大小，对制备的微胶囊进行最佳配方的筛选，筛选结果见表。以包封率为试验指标，其极差越大表明该因素对指标的影响越大。由表可知，对包封率影响因素的主次顺序为菌液海藻酸钠海藻酸钠质量浓度 质量浓度壳聚糖质量浓度，最优工艺为海藻酸钠质量浓度为，菌液海藻酸钠为，质量浓度为，壳聚糖质量浓度为。在最佳配方条件下制备的乳酸菌微胶囊，平均粒径较小，微胶囊大小较均匀，见图。图湿微胶囊和干微胶囊 乳酸菌微胶囊特性分析结果 微胶囊在人工胃液和肠液的溶出结果称取微胶囊份，分别置于 人工胃液 和 人 工 肠 液 中，于 摇 床 中 处理。分别 于、和 时取样，以人工胃液和人工肠液为空白对照组，测其 值，根据 值变化情况来分析人工胃液和人工肠液中微胶囊的溶出情况。溶出情况见图。由图可知，微胶囊在人工胃液处理的前 ，值有上升现象，处理 后基本稳定。在人工肠液中，处理 后，其 值基本稳定。图微胶囊在人工胃液和人工肠液中溶出情况 微胶囊对人工胃液、人工胆汁的耐受性和崩解性检测结果称取微胶囊，溶解于 的人工胃液中，于摇床中 处理。后取样，将微胶囊过滤，用生理盐水洗涤至中性，干燥。将干燥好的微胶囊用解囊液处理后，采用梯度稀释法进行活菌计数。乳酸菌微胶囊在人工胃液后，活菌数达 ，菌体存活率达（如表所示）；而未包埋的菌液组活菌数下降个数量级，菌体存活率为 ，说明该乳酸菌微胶囊具有良好的耐酸性。表微胶囊在人工胃液中的活菌数变化名称微胶囊中原始活菌数 人工胃液处理后活菌数 存活率乳酸菌微胶囊 称取微胶囊，溶解于 的人工胆汁中，于摇床中 处理。后取样，将微胶囊过滤，用生理盐水洗涤至中性，干燥。将干燥好的微胶囊用解囊液处理后，采用梯度稀释法进行活菌计数。乳酸菌微胶囊在人工胆汁后，活菌数达 ，菌体存活率达 （如表所示）；而未包埋的菌液组活菌数下降个数量级，菌体存活率为 ，说明该乳酸菌微胶囊具有良好的耐胆盐性。表微胶囊在人工胆汁中的活菌数变化名称微胶囊中原始活菌数 人工胆汁处理后活菌数 存活率乳酸菌微胶囊 称取微胶囊，溶解于 的人工肠液中，于摇床中 处理。后取样，采用梯度稀释法进行活菌计数。由表可知，该乳酸菌微胶囊在人工肠液 后基本溶解，活菌数达 ，菌体存活率达 ，说明该乳酸菌微胶囊具有肠溶性。表微胶囊在人工肠液中的活菌数变化名称微囊中原始活菌数 人工肠液处理后活菌数 存活率乳杆菌微胶囊 微胶囊的高温耐受性实验结果分别称取微胶囊加入到 解囊液和 液体培养基中，待解囊液组完全溶解，液体培养基组不做处理。两组试管同时放入（一般的制粒温度）水浴锅中，分别在、取样。采用梯度稀释法进行活菌计数。由图可知，乳酸菌微胶囊组比的菌液组耐受高温的时 张松梅等：一种饲用乳酸菌微胶囊的制备方法及其特性研究 年第期间长，说明该乳杆菌微胶囊可耐 高温。图微胶囊的高温耐受性检测结果 微胶囊稳定性实验结果称取 微胶囊，在 恒温培养箱条件下放置个月（相当于常温下存储年），每个月取出份（）微胶囊，采用梯度稀释法进行活菌计数。由表可知，在 恒温培养条件下放置个月后，乳酸菌微胶囊组菌体存活率达 ，而未包埋乳酸菌菌组基本死亡，说明该乳酸菌微胶囊具有储存稳定性。上述试验重复次，取平均值。表微胶囊的稳定性检测结果名称活菌数量 存活率 乳酸菌微胶囊 未包埋乳酸菌 讨论本研究旨在将制备的乳酸菌微胶囊添加到动物饲料中，饲喂动物后乳酸菌微胶囊需经过体内胃酸胆汁到达肠道后溶解释放出乳酸菌起益生作用，而动物饲料添加剂需经饲料制粒处理。因此本研究在乳酸菌微胶囊制备后，通过人工模拟饲料制粒处理的高温环境和动物体内环境对乳酸菌微胶囊进行评价：高温耐受性检测、人工胃液和胆汁的耐受性检测、肠溶性检测。结果表明：未包埋的乳酸菌在 （人工胃液）的条件下处理后，活菌数下降 个 数 量 级，而 乳 酸 菌 微 胶 囊 在 人 工 胃 液（）条件下处理后，活菌数下降个数量级，说明该微胶囊有一定的耐酸性；未包埋的乳酸菌在胆盐条件下处理后，活菌数下降个数量级，而乳酸菌微胶囊在胆盐条件下，活菌数只下降个数量级，说明该微胶囊具有较强的耐胆盐性；乳酸菌微胶囊在人工肠液处理 后基本溶解，说明该微胶囊有良好的肠溶性；乳酸菌微胶囊在高温 下比未包埋的耐受时间要长，说明该微胶囊具有一定的耐热性。由于条件限制，该实验的制粒温度与实际的制粒温度会有一定差别，因为实际生产中的制粒受湿度压力等各方面的影响。结论（）制备乳酸菌微胶囊的最佳配方为海藻酸钠质量浓度，质量浓度，菌液海藻酸钠，壳聚糖质量浓度。（）研制出的乳酸菌微胶囊与未包埋的乳酸菌相比，其耐酸性、耐胆盐性、耐高温性和储存性都有了明显提高，并具有肠溶性，可添加到猪饲料中进行 制粒处理和长期保存。参考文献徐致远，郭本恒，陈卫乳酸菌微胶囊技术的研究进展乳业科学与技术，（）：，：，：，：，：，：，：，；，（）：，：，；，：，：，（）：，：（责任编辑：刘斌嘉）