宏基因组学中的酶资源挖掘及其催化性能改良策略.docx

北 京 化 工 大 学课程论文题 目 宏基因组学中的酶资源挖掘及其催化性能改良策略姓 名 王澳克 班 级 生研1505 日 期: 2015 年 12 月 10 日论文正文课程心得附录1：中文PPT附录2：英文PPT12 / 12宏基因组学中的酶资源挖掘及其催化性能改良策略摘要：酶催化在食品、医药、化工、能源等领域发挥重要作用。开发新型微生物酶资源，对酶进行修饰改良，是酶催化领域的重要研发内容。极端微生物和不可培养微生物酶的发掘是获取新型工业催化剂的热点；体外定向进化、杂合酶、表面展示等蛋白质工程等分子生物学技术手段为开发特定性质“新酶”提供了有力工具；生物印迹、pH记忆、定向固定化、交联酶晶体、脂质体包埋等高效物理化学修饰方法拓宽了酶原有的催化性质。微生物酶资源挖掘及其改良将推动酶的生物催化产业快速发展。关键词：酶；宏基因组；定向进化；生物印迹微生物蕴藏着大量具有工业应用潜力的生物催化剂。然而，传统培养方法只能从环境中获得不到1 %的微生物。作为生物催化剂的微生物酶，由于其高度的化学底物选择性、区域选择性、对映体选择性1，能高效完成天然和非天然底物的专一性催化反应；在得到高品质产品的同时，对环境友好，有着传统化学催化剂不可比拟的优势，因而是“绿色化学”倡导的优良工业催化剂。以高附加值手性化合物为代表的生物催化已成为各大生物技术公司和化学公司竞相研发的热点2。开发高活性、高选择性和高稳定性的酶，是实现绿色化工，合成重要化工和医药产品的重要保障。自然界中尚未充分发掘的微生物资源为新型酶的获得提供了宝贵的酶源，发掘潜在的微生物及其基因资源是当前的重要方向，是生物催化的重要基础；运用生物学、物理化学方法对现有酶进行修饰改造，获得优异性能的工业催化用酶，是生物催化的关键。宏基因组学是通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选，寻找和发现新的功能基因的一种方法。它绕过了微生物分离培养过程，成为研究环境样品中不可培养微生物的有力手段。1 宏基因组学宏基因组学起源于上世纪70年代土壤微生物基因组DNA的研究，近年来研究者们已利用宏基因组文库技术从不同环境样品中筛选到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、-葡萄糖苷酶等多种具有工业应用潜力的生物催化剂。随着宏基因组学在挖掘新 型生物催化剂中的广泛使用，我们进入了宏基因组学挖掘生物催化剂的时代3。1.1 宏基因组文库的样品来源目前，宏基因组学研究的样品主要来源于土壤环境和海洋环境。这是因为土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动所需的各种条件，是微生物生活的最适宜环境。据估计，每克土壤中含有高达10000种不同的微生物4，这表明土壤微生物宏基因组是一个巨大的基因资源库，对它们的挖掘能够获得大量的生物酶制剂；而海洋环境在压力、盐分、温度和营养成分上的极端变化赋予了海洋微生物在物种资源、基因功能和生态功能上无与伦比的生物多样性。为了获得性能更加多样的生物催化剂，研究者们需要广泛地采集环境样品，特别是一些极端环境中的样品。1.2 宏基因组DNA的提取宏基因组DNA的提取是构建宏基因组文库的关键步骤，因为环境样品总DNA的浓度、纯度、片段大小和偏好性等因素将直接影响宏基因组文库的质量和代表性。DNA提取方法大体可分为两类：直接提取法和间接提取法。直接提取法，又称原位裂解法，这类方法是通过物理法、化学法或酶解法直接裂解环境样品中微生物的细胞壁来提取DNA并加以纯化。目前常用的裂解方法中，物理法有反复冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮碾磨法等；化学法所采用的化学试剂有表面活性剂（如SDS）、盐类、有机溶剂等；酶解法则主要采用溶菌酶和蛋白酶。不同裂解法的差别在于细胞破壁的方式不同。直接提取法无需对环境样品中的微生物进行复苏处理，操作简便，且样品中的微生物能够被裂解得比较完全，故DNA提取得率高，所获得的基因组DNA能较好地反映样品中微生物种群的多样性。但由于操作过程中机械剪切力大，导致所获得的DNA片段较小（150 kb），且多为平端；此外，由于提取的基因组DNA中混有金属离子、腐殖酸、多糖、多酚化合物等杂质，纯度较低，往往还需要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作（如DNA酶切、PCR扩增）的需要。该法提取的DNA主要适用于以质粒或噬菌体为载体的小片段文库的构建。间接提取法，又称异位裂解法，是利用梯度离心或者差速离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来，然后再用比较温和的方法提取基因组DNA。该方法受土壤中杂质的污染较小，提取条件比较温和，所获得的DNA纯度较高，片段大（20500kb），适合于构建以柯斯粘粒（Cosmid）和细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）为载体的大片段文库；但该方法操作繁琐，前分离过程会造成部分微生物细胞的丢失，加上温和条件下细胞壁较厚的微生物不易被裂解，因此所获得的DNA中基因组信息的广泛性不及原位裂解法，得率只有原位裂解法的110。随着宏基因组学的发展，许多新的DNA提取技术不断被提出，使得人们可以从各种各样的环境样品中获得高质量的总DNA。然而，并没有一种标准的或通用的环境DNA提取方法。任何DNA提取方法都存在一定的偏好性，导致选择性地富集某些微生物的DNA，同时选择性地遗漏某些微生物的DNA，从而影响所提取的DNA的种群覆盖率。在实际应用中，应根据所研究生境的特性和研究目的进行选择和优化。1.3宏基因组文库的构建1.3.1载体的选择载体在宏基因组技术中具有重要地位，常用载体有质粒（Plasmid）、细菌人工染色体（BAC）、柯斯粘粒（Cosmid）、福斯黏粒（Fosmid）等。载体的选择应考虑以下因素：研究目的、所提取的环境总DNA的质量、欲插入目的片段的最大长度、所需要的载体拷贝数、欲采用的宿主以及筛选策略56。1.3.2宿主的选择宿主的选择应考虑以下因素：所选择的载体类型，宿主的转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宿主能否为相关功能基因提供必需的转录表达体系、对异源表达基因产物是否有较强的相容性、以及目标性状（如抗菌性）缺陷型等。目前，构建用于筛选新酶的宏基因组文库时，最常用的宿主为大肠杆菌E.coli。1.4目标克隆的筛选由于环境样品中微生物种类众多，文库容量庞大，如何有效得到目标克隆，是研究者们必须 解决的一个难题。目前，从宏基因组文库中筛选新型生物催化剂的策略可分为3种：基于活性的筛选，基于序列的筛选和底物诱导的筛选。2 酶资源挖掘2.1 极端微生物酶极端微生物及其产生的酶类不仅为生物科学提供基础研究素材5，而且对苛刻条件下的工业生物催化过程有积极的实践意义。由于极端微生物培养条件苛刻，可以采用重组DNA技术在常规宿主中表达极端酶，从而避开极端菌的直接培养。嗜热耐碱的酶T1在以pGEX为载体，以Escherichia coli BL21(De3)为宿主的原核表达系统中得以可溶性表达6。通过酶GST标签的亲和层析纯化得到纯酶。其最适温度70 ，最适pH 9.0。在65 以下很稳定，在pH 9.0时半衰期为5.25 h。该酶可应用到食品工业中脂肪酸的生产，因为棕榈油和牛脂等在常温下为固态，只有在较高的温度下才能呈液态，发生反应；而常规微生物酶在较高的温度下易失活。2.2 不可培养微生物酶特定生境中只有一小部分微生物可用实验方法分离培养，占绝大多数的不可培养微生物(uncultured microorganism)是地球上尚未开发的巨大资源7。宏基因组(metagenome)技术绕过纯培养步骤，直接从生境样品中获取遗传信息，提供更加全面的基因资源，从而有效地提高了新酶的筛选效率。采用宏基因组技术筛选酶有两种途径-功能筛选和序列筛选。功能筛选途径即把来源于不可培养微生物的DNA克隆到大肠杆菌质粒中，构建宏基因组文库，然后基于酶活性筛选获得微生物酶基因。序列筛选途径以酶三联体活性中心(Ser-Asp-His)和氧阴离子洞(oxyanionhole)区的保守序列设计引物，以环境基因组DNA为模板，扩增酶基因片段，然后用基因组步查(genomic-walking)的方法克隆出全长酶基因。3 酶催化性能改良策略3.1 定向进化酶对酶分子的改造，一是基于序列的合理化设计方案(sequential ration design)，如化学修饰、定点突变(site-directed mutagenesis)等；二是利用基因的可操作性，模拟自然界进化过程的非合理设计方案(irrational design)，如定向进化(directe devolution)、杂合进化(hybrid devolution)等8。酶分子的定向进化无需了解酶的结构功能和催化机制等方面的信息，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向筛选出所需性质的突变酶。酶的定向进化即是通过基因突变、基因表达和高通量筛选技术获得预期性质的突变酶，如提高酶活力、提高稳定性、提高底物专一性和提高对映体选择性等。酶的定向进化尤以提高对映体选择性研究得最多。3.2 杂合酶杂合酶是指把来自不同酶分子中的结构单元或使整个分子进行组合和交换，产生酶杂合体，以改进或创造酶的某种功能9。杂合酶的构建也为酶的结构与功能之间的关系研究提供了模型。通过定向组合，将白地霉酶 N 末端序列和白地霉酶 C末端序列在不同的位点融合，构建一系列杂合酶。以三油酸甘油酯和三辛酸甘油酯作为模式底物，对杂合酶的底物特异性酶活力进行测定，确定酶分子上影响底物结合和催化的序列。研究结果表明决定白地霉酶对油酸甘油酯特异性的序列位为349406的58个氨基酸。该区段氨基酸的置换显著地改变了对短链脂肪酸底物（三辛酸甘油酯）的活力。同时，最终优化的杂合酶选择性水解外消旋癸酸甲酯的对映选择率比天然的酶和都要高。利用进化手段较容易构建出高度多样性的突变基因库，酶的有利功能突变体常被埋没在众多的中性突变和不利突变群中，因此建立高效的、有针对性的高通量筛选体系是定向（杂合）进化最具挑战性的内容。3.3 表面展示酶表面展示技术借助锚定载体，将外源蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体、细菌或酵母的表面，使其保持相对独立的空间构象和原有的生物活性10。不同酶的底物特异性不一样。利用共展示技术，在同一宿主上同时展示两种酶，可以扩大其催化的底物谱，更好地发挥其生物催化作用。Kobayashi等11以CWB(cell wall-binding domain)为锚定蛋白，在B.subtdis宿主上同时展示了B.subtdis 酶B。以INP蛋白(ice-nucleation protein)为锚定蛋白，通过INPTliA融合蛋白的方式在大肠杆菌表面成功展示了嗜热酶(TliA)。该展示的新型“固定化”酶，可高效催化非水相体系中橄榄油的水解反应。表面（共）展示技术开辟了表面催化剂的新领地，是未来重点发展的催化剂，其瓶颈在于高效、兼容性好的锚定载体的筛选。高效载体的开发必将推动表面催化工程快速发展。3.4 生物印迹酶根据酶在有机溶剂中具有“刚性”结构的特点，利用酶与印迹分子的相互作用，诱导、改变酶的构象，制备具有结合该印迹分子及其类似物能力的“新酶”，是修饰改造酶的一种方法。水溶性酶在通常状况下，活性位点被“盖子”结构覆盖，呈非活性状态。当底物及其类似物介导的油水界面产生时，盖子打开，呈活性状态。为了获得高效非水相酶，选择适当两亲性的表面活性剂或底物类似物作为印迹分子，待印迹分子与酶充分印迹接触后，将印迹分子-酶复合物冷冻干燥，用非水溶剂洗脱印迹分子，形成了活性中心开启的印迹酶，并且这种状态在有机溶剂的刚性环境里仍能维持。选择不同结构的印迹分子诱导，会产生结合部位构象不同的印迹酶，适应不同的底物，从而催化活力比非印迹酶显著提高。印迹酶的催化活力依赖于酶类别、有机溶剂和印迹分子本身。3.5 pH记忆酶有机溶剂中酶分子表面的必需水只有在特定的pH和离子强度下，才能使酶分子活性中心周围的基团处于最佳的离子化状态，从而有利于酶活性的表现。所以有机溶剂中的酶活力与酶冷冻干燥或有机溶剂沉淀前所在的缓冲掖的pH和离子强度密切相关，其最适pH与水相中酶的最适pH是一致的。当酶分子从水溶液转移到有机溶剂中时，它保持了原有的离子化状态。利用酶的pH记忆特性可以提高有机相中酶催化活力。对于生物印迹、pH记忆修饰型酶，不够透彻的“印迹”和“记忆”分子机理及其仅能在有机溶剂中起催化作用制约了其进一步的发展与应用。因此阐明酶分子构象诱导的细微变化与酶催化活性的关系，研究不同印迹分子对酶活性的影响，开发以水不溶性底物为代表的新型印迹分子，突破印迹酶、记忆酶仅在有机介质中起催化活性作用的局限，进而开发水相印迹酶、记忆酶，是大势所趋。3.6 脂质体包埋酶酶粉虽然在非水介质中能够催化反应，但是其催化效率比水溶液中的酶低几个数量级，其中原因之一是酶一般难溶于有机溶剂。虽然有些酶能直接溶解在少数有机溶剂中但是酶催化效率常常很低。双亲分子共价或非共价修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂，提高酶的催化效率。增加水溶性酶在疏水性有机介质中的溶解性可显著提高酶的催化效率。通过混合酶和脂溶液，收集并冷冻干燥所得沉淀即得脂质体包埋酶。脂质体包埋酶不溶于水溶液但能很好地溶解于有机溶剂，如苯、乙酸乙酯、异辛烷、异丙醚、二甲基亚砜（DMSO）和乙醇等。脂分子亲水头与酶分子亲水表面相互作用集结在一起，而脂分子的疏水烃基端延伸到疏水有机溶剂中，增加了酶的溶解性。一个酶分子约可以吸附100200个脂分子，酶蛋白含量约占810%。经脂质体修饰的Pseudomonasfragi酶催化(R,S)-苯乙醇与月桂酸的酯化反应，在2h内能催化R-苯乙醇全部转化成酯，而S-苯乙醇几乎不反应。脂质体包埋技术面临的主要问题是包埋材料的附着稳定性14。3.7 交联酶晶体交联酶晶体(cross-linked enzyme crystal , CLES)是固定化酶的延续和发展，是一种有发展潜力的固定化方法15。酶结晶本身就是一个分离纯化和固定化的过程，双功能交联剂戊二醛对酶微晶进行交联，酶蛋白既是催化剂又是载体，它提供非常高的酶浓度，不存在传质阻碍。通常固定化酶中酶含量仅占5%左右，相同质量的交联酶晶体的催化活性比一般固定化酶要高很多。高纯度的酶晶体催化剂具有超强稳定性，可在有机溶剂、气相、超临界流体等非常规介质中表现出高度立体选择性。3.8 定向固定化酶酶的定向固定化技术可以将酶分子表面特定区域的氨基酸直接或间接(通过某些化学试剂、空间手臂)与载体偶联，实现酶分子活性中心背向载体，从而有效地消除对大分子底物结合的空间障碍，提高催化效率16。在大多数情况下，影响酶活性中心的氨基酸残基在固定化载体上的无序附着导致酶固定化后催化活性部分丧失。定向固定化可使酶蛋白以有序的方式附着于载体表面，减小无序态造成的酶蛋白结构变形，使酶活力损失降低。定向固定化的核心技术是特异性载体的开发，筛选与酶活性中心基团亲和力低的载体或对载体基团进行定向修饰是该项技术的发展方向。4 结语和展望生物催化剂作为生物催化和转化的核心，尤其是酶正受到越来越广泛和深入的研究开发。一方面，发掘潜在的微生物及其基因资源，利用基因重组表达和发酵技术大量制备酶；另一方面，利用蛋白质工程手段、物理和化学方法对现有酶进行修饰改造，以满足生物催化的要求。嗜极微生物和不可培养微生物的酶，将会在工业生产中部分替代现有的酶或作为新行业的催化剂。随着基因工程、结构生物学和生物信息学的迅猛发展，利用分子进化等手段获得最适特性的酶已经越来越被重视。作为分子进化的一个分支，酶的定向进化（杂合酶）不仅能使酶进化出单一优良的非天然特性，还能使酶的两个或多个特性叠加，产生具有多项优良性能“集成”的新酶，极大地发展和丰富了生物催化剂来源。新型酶催化剂的获得应立足于明确的设计思路。参考文献：1 Whangsuk W, Sungkeeree P, Thiengmag S, et al. 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Nucleic Acids Research, 2014, 42(D1):D350.课程心得：本学期通过选修这门课，首先前四次课让我对生化反应工程的前沿技术有了更多的了解，结合本科学的化工原理、物理化学的化工生产过程的处理技术，更深入的掌握了一些发酵，反应器设计的技术。双语课程，让自己也记住了更多的专业英语单词。每次课的课堂测验，所留的问题也都是对课堂知识点的总结。后四节课，了解了工业生物技术的现状，结合中国制造2025、生物大数据、健康中国、“十三五”规划、“互联网+”、工业4.0、精准医疗等前沿概念，从宏观的、战略的角度明白了许多工作的意义，这或许比掌握知识点更重要。课程报告展示的“采用双层静电自组装技术制备nPAM-木瓜蛋白酶-CNC催化剂”，小组讨论后定的题目。虽然以前没做过这方面的研究，但通过做PPT，了解了许多自组装及酶催化技术。结课论文，通过写自己更感兴趣的“宏基因组学中的酶资源挖掘及其催化性能改良策略”综述，虽然找资料看文献比较痛苦，但写完论文后更加系统的了解了基于宏基因组学的生物酶如何挖掘，以及实验室修饰改造生物酶的策略。（附录中，打印的PPT中文版是英文版的雏形且对图表有较多的注释，英文版是基于中文版的进行了一部分删减，请知悉。）