实验室质控.doc

第五部分目录 胚胎实验室手册胚胎实验室工作规程 1无菌技术 2设备校准和维护 3实验室质控 5实验室工作流程 6培养液的配置 7取精和精液分析 8精子处理 9精子冷冻和解冻 10取卵和卵子处理 10IVF的授精 11单精子卵胞浆内注射(ICSI) 13胚胎的培养和观察 13囊胚培养 14胚胎移植 15胚胎冷冻和解冻 17辅助孵化 19胚胎着床前诊断（PGD）操作 19实验室人员的职业安全 20病人身份和标本标识 21实验室记录及保密21冻存标本22卵子的捐赠22事故和问题22耗材和管理23设备清单23消耗品清单24试剂清单25手术、实验室温度、湿度、通风25胚胎实验室工作制度实验室人员职责27实验室人员工作制度27实验室物品管理制度 28实验室仪器维护制度 28实验室消毒隔离制度 28实验室工作程序 29第一部分 实验室质控实验室质控是辅助生殖技术成功的关键。水、培养液、一次性用品、PVP、试剂、矿物油、混合气体的质量和实验室环境的改变可导致配子和胚胎的发育能力降低。质控应能在问题出现之前检测出潜在的问题，当检测到问题时应立即采取措施进行纠正。程序和消耗品在没有评估和权威认可时不能随意更改.一、无菌技术无菌环境对任何细胞培养的成功都是至关重要的。通常采用的方式是使用垂直层流的超净工作台.工作原理:无菌气流的方向为由上而下的。位于无菌气流中的无菌物品可保持无菌，其上方无其他物体的遮盖.操作要点： 确定无菌和非无菌物，分开放置，不将非无菌物放在无菌物上方 无菌物应暴露在无菌空气中 所有无菌操作必须在无菌环境中完成 移液时不要过早打开盖子,将盖子放在工作台的后方，内面朝上，并避免在其上方操作 所有移液管、移液头的前端均不可置于操净台外，应朝向内放置 每天工作结束后用消毒蒸馏水擦拭超净台二、设备校准和维护1。 常规检查和校准项目温度允许温差C02浓度允许浓度差C02培养箱37 C00。5 C05005倒置显微镜恒温载物台37 C00。5 C0/恒温平台与恒温试管架37 C00。5 C0/冰箱保鲜层6 C02 C0/冻臧层12 C02 C0/2.要求： 每日晨同一时间用标准的C02检测仪、温度计来检测C02培养箱内的温度C02浓度。 温度和CO浓度超出设定的界限应向上级汇报,及时处理。 每日结果记录在质控记录本3. 一般维护项目时间维护C02培养箱每月一次清洁消毒污染清洁消毒必要时由供应商保养、再校准恒温平台与恒温试管架每周一次清洁每月一次消毒超净工作台每周一次清洁必要时消毒去污离心机每月一次清沽消毒倒置显微镜与体视镜使用后清洁必要时由供应商保养、校准微量移液器每周一次清洁消毒每三个月送测定所校准冰箱每周一次清洁建有专项记录，每次清洁维护予以记录.4. 具体清洁消毒方法4。1时间安排: 每天 清洁倒置显微镜、体视镜、超净工作台、工作区域 每周 清洁C02培养箱的水托盘,换水 每月 清洁消毒离心机、恒温平台、恒温试管架、清洁培养箱4.2 清洁方法:4.2。1 超净工作台：用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2.2 倒置显微镜、体视镜：用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2。3 C02培养箱水托盘:把培养箱内物品拿出后取出托盘把水到掉，用沸水冲洗浸泡后用无菌纱布擦干,放回培养箱，倒入无菌蒸馏水至34处,待温度和CO2浓度平衡后使用4。2.4 离心机：将吊桶从转轴中取出，用洗洁精刷洗后在流水下冲净后用75酒精擦拭.用洗洁精、水、75%酒精依次擦洗。后重新装回吊桶4.2.5 恒温平台与恒温试管架：从实验室取出，依次用水、75%酒精、水擦洗,试管架内管用长棉签擦拭,放回室内，装好4.2.6 试管架:浸泡在洗洁精溶液中用刷子擦洗，在水龙头下冲洗，用75酒精擦拭后置于通风处下燥4.2.7 CO2培养箱：把箱内物品取出后拆除内部所有隔板，用沸水冲洗水托盘和隔板后用无菌纱布擦干。用无菌蒸馏水擦拭培养箱内壁及玻璃门。将水托盘放回培养箱，倒入新鲜的无菌蒸馏水，将隔扳重新放回培养箱内，待温度和C02浓度达到平衡后使用4.2.8 各种硅胶管：用酒精浸泡30分钟,用无菌蒸馏水内外冲洗20秒，用无菌蒸馏水浸泡过夜后再用无菌蒸馏水内外冲洗20秒,将管腔内的水分排干.5. 剥离管和移液管的准备和消毒：用经过灭菌和鼠胚实验合格的巴氏吸管。两手握住巴氏吸管的两端，将吸管窄部中央在酒精灯的火焰中烧软,移离火焰后迅速向两边牵拉，形成细长的玻璃管。用火焰将细管在合适直径处烧断，将弃去的断头在火上烧热,在留下的玻璃管中选择合适直径处烫断。在体视镜下检查其直径应为140160um（剥离管）或160-180um(转移管)。三、C02的检测和消耗品检测方 法：精子存活实验用 物：被检测过的培养液和矿物油消耗品，有来自以前受试供者的精液准 备：收集实验当天的精液,液化后用梯度法洗涤后放在无菌离心管中。C02监测：每个培养箱中各放两个精子培养管，并将培养管盖子松开，培养三天新消耗品检测:将新消耗品在适量的培养液中充分暴露，用此培养液与培养器皿收集和培养精子三天.取 样：用移液管混合标本30次后取20ul精子放入载玻片，在镜下观察,计数200条精子的活力后除2即为最后结果，同一标本重复计数的误差应在10之内。记 数：记录精子最初的浓度、活动力和活动分级，记数培养后精子的活动力和活动分级.结 果:在第三天精子活动率减少20以上提示有毒性物质存在。临界结果需重新测试。实验室定期评估项目间隔时间标准受精率2周60卵裂率2周90种植率1个月10%A级胚胎比率2周20冷冻胚胎解冻复苏率1个月70当发现妊娠率下降时，应检测一些潜在可能影响因素，发现后予以纠正.可能的影响1. 临床改变2. 空气质量3. 实验室清洁工作4. 气体供给和气体质量5. 实验耗材批号改变：矿物油6. 培养箱的校准和稳定性7. 消耗品的改变实验室工作流程上 午打开设备电源,开启恒温设备检查C02气体,C02培养箱的温度和C02浓度，并记录观察室内温湿度并记录准备当日的培养液和消耗品检查前一日的IVF或ICSI受精情况检查受精卵的发育情况取卵，精液处理IVF或ICSI下 午 胚胎冷冻 配置培养液准备消耗品将第二天所需的培养皿放入C02培养箱关掉设备电源清洁设备、工作区域取换垃圾桶 关闭实验室不用的电源培养液的配制 取卵液（HTF-HEPES+HAP)：用于冲洗取卵针、收集卵子。含97%HTFHEPES、3HAS、1肝素。 洗卵液（HTF HEPES）：用于卵丘复合物和卵子的暂时存放.含97%HTFHEPES、3%HSA。移植液（ET):用于胚胎移植和注射、打孔盘的制作。含90ttTP-HEPES、I0HSA。 培养液(IVCONE）:用于卵子、配子及卵裂球的培养.含85 90%IVCONE、15一I0HSA. 囊胚培养液(VCFHREE）：用于胚胎囊胚期的培养.含890%IVC THREE、15一I0%HSA。 80分层油：用于精液的洗涤处理。含80分层油、20沈卵液. 40分层油：用于精液的洗涤处理。含40分层油、60取卵液. 透明质酸酶（HY） HY的终浓度为80-100IUML 称量0026g的透明质酸酶溶于10ml新鲜配置的洗卵液,用04Sum的针筒式过滤器过滤后，每25m1分装于5ml的试管中，冷冻保存。 聚碘维酮（PVP) PVP的终浓度为10 称量05g的聚碘维酮溶于5ml新鲜配置的洗卵液,在室温下静置4小时后用04Sum的针筒式过滤器过滤，每04m1分装在1ml的离心管中,冷冻保存。 培养油的制备 目前我中心所用的培养油是SIGMA公司的M8410矿物油。此类矿物油已经过灭菌消毒,但用前还要经过处理.洗油：将矿物油和HTF-HEPES按9:l的比例倒入玻璃质的无菌容器中，摇动瓶子,使液体与油充分混匀。静置于冰箱保鲜层内3天（最长不可超过7灭),使油与液体自然分层。滤油：自然分层后,将上层油置用045um针筒式过滤器过滤在250ml或600ml培养瓶中,置于冰箱保鲜层中保存。平衡：用时须至少提前3天分装于50ml培养瓶中，松开瓶盖置于于C02培养箱中，平衡后方可使用。取精和精液分析 取精应在取卵于术前（1CSI、IVF)或授精的（IUI)2小时进行。 核对病人姓名、病历、身份证后给病人一个取精杯，杯身上要有明确标示。 如取精困难,则通知男科医生，考虑通过外科手术睾丸取精。 尽量要求病人在中心取精，在外取精者需在30分钟内送回。精液分析正常精液标本应质地均匀，呈狄白色,在室温下30分钟即呵自然液化。刖吸管吸起后会呈不连续的小滴落下；不正常的精液标本会显得过于清澈或因有红细胞而呈棕色，或任室温下放置l小时以上仍不液化，用吸管吸起后液滴会形成大丁2CM的长丝。精液的活力分级A级一活力良好,呈直线运动活动B级一活动较好，活动但方向不定C级一活动不良,动作迟缓，原地转动D级不活动，死精子正常精子标准项日正常值且2MLPII7278精子密度2010ML精子总数40106活动率50(A+B）豆霓25%(A级)形念30正常活率75%白细胞l106ML精子处理对于IUI和常规IVF来讲，在精液中获取足够数量的活动精子非常重要。精子处理的过程可去除精浆,从而诱导精子的获能。对于ICSI来讲，尽管只要有活动的精子就可以进行,但适量的精子处理去除精浆和杂质有利于ICSI的操作。新鲜精子处理方法l、梯度法 将80分层油、40分层油、洗卵液、培养液平衡至室温。 存15ml离心管中先后加入80%分层油和40分层油各1m注意动作要轻，不要 扰乱两层的界面。 加入2ml精液。 离心10分钟，转速为18002000转分钟(1410）。 小心吸出上清至沉淀上方0。5一lml处。加入洗卵液3-5ml，轻轻摇匀。离心5分钟，转速为800一1000转分钟. 吸出全部上清液留沉淀(如准备IVF或ICSI至此即可）。 加入培养液至0.5ml,放入培养箱，待用.2、上游法(略）3、直接离心法（略）冷冻精子处理方法 处理方法同上精子解冻法，如为IUI用留沉淀后再加入培养液至0508ml处，放入培养箱,待用即可.不动精子的实验室检测技术 目的：区分D级中的有活性的不动精子用于ICSI办法：低渗溶液法精子的冷冻和解冻冷冻保护液 采用甘油作为冷冻保护液.冷冻方法 精液标本需在完成精液分析和精予处理后l小时内冷冻保存。 冷冻保护液预热至室温。 将精液和等量的冷冻保护液加入Falcon352059培养管内，混匀. 每0608ml的的混合精液装入1支Nunclml冷冻管。 将冷冻管放入已标志的铝支架中置于4C冰箱中l0分钟. 将铝支架置于液氮罐内，距液氮面10-15cm，持续10分钟。 将铝支架置于冷冻提桶中，保存于液氮罐中.解冻方法 洗卵液预热置室温. 确认患者编号、姓名等，从液氮中取出精液冷冻管，再次确认患者编号、 姓名。 将冷冻管在室温下放置56分钟，同时仔细检查冷冻管足否有裂痕或液氮渗漏. 用移液器将全部精液吸入15ml离心管中。 缓慢的逐滴加入洗卵液35ml,每加入一滴后轻轻摇匀. 离心 5分钟,转速为1000转分钟。 吸去上清备用。取卵和卵子处理 通常在注射HCG36小时后经阴道在B超引导下行穿刺取卵，取卵在紧邻胚胎实验室的手术室进行,卵子经穿刺吸取在Falcon 14ML试管中.取卵准备 1打开各恒温板,恒温试管架和体视镜预热。 2将洗卵液倒入Falcon 352059皿中,多少依每人预计卵数而定，但一般在 5l0ml 间，放入C02培养箱中平衡待用。 3取Falcon353002皿待用，并制作ICSI注射盘,放入C02培养箱平衡，等待加入精子。 4将含有肝素的取卵液倒入Falcon352059试管中.一般每支试管中倒入 52ml 5将575英寸巴氏管2支插入黑色橡胶吸头中待用.取卵步骤 1执行无菌操作，及时替换有污染可能的器皿. 2将护士置于恒温试管架中的含卵泡抽吸液的FalCOFI 352059试管中的卵泡液倒入353002中，在体视镜下寻找卵丘复合物。 3找到卵丘复合物后拣出,用巴氏管在当日晨制作的353037外孔中洗涤后放入内孔。 4如卵丘复合物有血块污染应先用1 ml无菌针头将其剥离后再拣出。 5如有异常抽吸液，应在手术最后再处理，并将抽吸液保留转交给手术室护士。 6在卵泡抽吸过程中，将所获得的卵丘复合物及时的放入取卵前一天下午制备的353037皿中，并置于培养箱中培养，一般在获得46个卵丘复合物中就应进行. 7记录取卵开始和结束时间及找到卵丘复合物的数目。培养皿的制作 暂时培养皿:1个，在取卵前1日下午制作，置于C02培养箱中平衡过液，用IVCONE倒入Falcon353037皿的内孔中，液量依预计卵子量而定,但一般不超过5ml。 培养皿：1个，在取卵前一日下午制作，置于C02培养箱中平衡过夜，用IVCONE在Falc。n353037皿中作27个5080ml的培养液滴，盖以矿物油。 注射盘:1个在取卵日晨制作,置于C02培养箱中平衡待用，用移植液和PVP在Falcon353002皿中分别制作多个液滴，盖以矿物油。IVF的授精卵子成熟度的评估形念标准成熟度标志完整或破裂的第一极体，卯细胞可有空泡过熟M+排出第一极体成熟MII未见GV也未排出第一极体未熟M1有一个完整的球型核仁未熟GV授精时间取卵后小时授精步骤1. 从C02培养箱中取出暂时培养皿和调整好精了密度为510ml的精子制备液。2. 用巴氏吸管将卵丘复合物放入培养皿中。3. 用移液滴头吸取精子制备液放入培养皿中，放的过程中要始终对准卯丘复合物。4. 在倒置显微镜下检查精子密度,每200倍视野的活动精子数应为2040个。5. 将培养皿放回培养箱6. 记录卵丘复合物的数日和成熟度。7. 次日晨用转移管将卵了拣出,在洗卵液中洗涤后放入前一日制备的353801皿中。8. 在倒置显微镜下观察受精情况.9. 记录卵子数目和受精情况。单精子卵胞浆内注射(ICSI）显微操作糸统 显微操作系统是NIRON-EF300粗调为手动的机械操作器，微调为操作杆倒立的液压三维显微操作器. 显微操作系统配备恒温台，其设置温度应使ICSI注射器中的液滴保持37。目前我们的温台设定为38.5。 显微注射针和持针内的压力由操作器控制,连接的管中充满矿物油使整个管路中不含空气。显微注射针 ICSI显微注射针对于成功的ICSI是非常重要的,目前我们采用的是COOK生产的K MPIP一3330。精子处理 (见前精子处理)卵子的处理 ICSI前卵子需在透明质酸酶中剥离颗粒细胞，一般在取卵后2-3小时进行。1. 准备一个皿，分别加入透明质酸酶(HYASE)及H-HTF制成液滴2. 用一较粗吸管将35枚转移到透明质酸酶中,小心谨慎地吹打卵子卵子颗粒细胞开始脱离在透明质酸酶中处理的时间不应超过30秒3. 将部分裸化的卵子转移到H HTF滴中，尽量少吸透明质酸酶液。上下吹打单个卵子，用一较细的吸管除去颗粒细胞在另几个HHTF滴中冲洗卵子然后用新皿重复以上操作直至所有卵子完全裸化ICSI过程1. 根据有无极体,M2（有极体）、M1(无极体）及有无GV判断卵子成熟情况。将成熟卵子转移到前一天晚上制备好的ICSI微滴中。不成熟卵子（M1和(jV)可以继续培养至成熟。2. 将12 ul精子悬液加到ICSI微滴的中央。孵育几分钟让精子游到液滴的边缘。3. 装上ICSI针射针.4. 用注射针压住精子的尾部并将其制动.因为精子颈部含有大量的中心粒， 这些中心粒在细胞分裂过程中对染色体起到重要作用，在操作过程中不伤及 颈部是其中的关键.不正确的精子尾部挤压会降低受精率。吸取精于是要先 吸取尾部.5. 将卵子微滴移到视野中央。用固定针将卵子固定.注射带有极少量PVP的精子,注射后防止胞浆倒流进入注射针。6. 所有的卵了注射后应放入准备好的培养液中培养。7. 根据受精后第二天有无两个原核(2PN)及两个极体出现末判断是否受精.胚胎的培养和观察培养的基本原则 所采用的耗材和试剂应用无菌无热源并通过鼠胚的。 有高质量的供气，稳定无菌的环境,温湿度气体浓度应稳定控制。 尽量减少胚胎操作次数，尽量减少胚胎暴露于不理想的环境中。 受精观察一般在授精开始后15 18小时检查卵子是否受精，并记录每个卵了的原核，极体及其他需要记录的内容。受精标准： 卵内有双PN,卵周隐有2个极体，卵子表现分裂迹象.一般卵裂发生较晚，约在授精后2230小时发生第一次卵裂，正常的卵裂时间和卵裂方式才是最可靠的指标。胚胎的观察： 可在授精后第二天开始观察，必须在37度恒温平台倒置显微镜下进行并记录每个卵子的卵裂球数、大小、形念及有无碎片等其他需要记录的内容。 胚胎质量的分级： 一至三级适用于移植. 一级：卵裂球等大，均质透明，无碎片。 二级：卵裂球不等大，均质，无碎片. 三级:卵裂球等大，均质，有少许碎片。 四级:卵裂球不等大，变黑,颗粒不均匀。囊胚培养： 此项技术主要是为了减少多胎妊娠的发生率。囊胚移植与常规情况比更符合生理情况,通过延长体外培养的时间，可白然淘汰无发育潜能的胚胎，移植的胚胎存经历了自然选择后无疑是最具有活力的。囊胚培养操作：1. DAY3，检查胚胎卵裂情况，并在中午十二时至二时之问转移至IVCThree 培养液。每个液滴最多可放4枚正常发育的胚胎。培养至DAY5做移植评分时为止。如果卵裂异常，应及时速报护士及相关医务人员2. DAY5，评估胚胎质量，确定能否用于移植或冷冻。囊胚移植应该与DAY2DAY3 胚胎的移植相同。囊胚冷冻可以在DAY5时进行3. 如果在DAY5不形成囊胚,那么这种胚胎可以继续培养一天存DAY6评估是否用于移植或冷冻.囊胚质量评分要点: 在DAY5，大多数囊胚应当达到4AA。 为了尽量避免多胎妊娠，移植囊胚数目不得超过两枚。选择评分为3以上的囊胚。最好选择评分最高的囊胚，如-AA。操作程序：1. 用阿拉们数字对囊胚的扩张度和孵化状念评分，用ABC字母对内细胞团（ICM)以及滋养外胚层(TROPHECTDERM)评分2. 用解剖镜对囊胚质量进行初步评估3. 用倒置显微镜对囊胚质量进行进一步评估.将囊胚分成3 6级（满囊胚 以后),然后评价ICM以及TROPHECTDERM发育情况. 评分标准: 扩张度和孵化状念: 早期胚胎:囊胚腔不到整个胚胎的的一半 囊胚：囊胚腔超过了胚胎体积的一半 满囊胚：囊H11腔完全占据整个胚胎 扩张胚：囊胚腔体积稍大于早期胚胎,透明带逐渐变薄 孵化胚：TROPHECTODERM通过透明带逐渐变薄 孵化后囊胚：囊胚完全脱离透明带. ICM分级 A包裹紧密，大量细胞。 B结构松散，少量细胞. C极少量细胞。 TROPt IECTODERM分级 A细胞形成紧密结合的上皮。 B少量细胞形成结构松散的上皮。 C极少量细胞。胚胎移植胚胎移植可在第二天至第六天进行，胚胎通过移植管经宫颈管植入宫腔。用物移植管：由护士准备。移植液：新鲜配置的移植液盛于352059试管中，在恒温试管架上预热.移植胚胎的选择 移植胚胎的选择可以参考胚胎的分级。1优先选择级别高的胚胎。2在同有少许碎片的胚胎中选择卵裂球数目较多的胚胎。3在同一级别的胚胎中，优先选择原核形态发育快，有早期卵裂的胚胎.4不移植多个原核的胚胎。 移植的数目基于病人年龄,周期数、胚胎质量、宫内环境以及病人的知情意愿，而定,应尽量减少移植胚胎的数量,常规移植不超过2个.移植过程1. 将已选择移植的胚胎集中放在培养皿的一个液滴内，放回培养箱2. 将1个353002皿置于体视镜镜头下3. 用lMLBO注射器吸耿081ML的移植液，滴出23滴于353002皿中，排尽注射器内空气，连接移植管内管和1MLBD注射器，冲洗移植管并排尽管内空气4. 将移植管与注射器交于手术医生，待医生将外管置于宫腔后从C02培养箱中取出放有胚胎的培养皿，在体视镜下将移植胚胎放入353002液滴中，并尽量使胚胎聚在一起5. 取回移植管内管及注射器，排出注射器内液体至刻度00l处，以使内管前端可能粘连的宫腔分泌物、气泡等排出6. 将管头放入252002中胚胎所在的液滴中，轻轻逐个将胚胎吸入，最后一个吸入的胚胎要与管口留有1CM的距离7. 注射器和管内的移植液量总和不可超过002ML,并保证注入宫腔的液体不多于0010015M1，以防止过多的液体携带胚胎倒流出宫腔8. 将吸有胚胎的移植管交于手术医生进行移植,移植结束后取回移植管，在体视镜下冲洗，检查是否有胚胎滞留9. 如有胚胎滞留，应重复以上步骤移植胚胎冷冻和解冻慢速胚胎冷冻1取待冷冻的胚胎，在冷冻液中洗涤10分钟.2取胚胎冷冻保护液放入冷冻管。3将胚胎放入冷冻管。4把胚胎管放入220C温度中，先以20C分钟的速度将胚胎管降至一70C.5用一100C以下的钳子夹冷冻管，使其迅速结冰。6再以030C分钟的速度降至一350C.7冻好的管子立即放入液氮的盒里之后再移入。快速胚胎冷冻1写好病人的姓名、编号。2配置好冷冻液20%(PPD)、01M蔗糖.3胚胎放入1ml冷冻液中。4室温放置5分钟。5直接加入液氮中。胚胎解冻 胚胎解冻液的配置： D4液：H HTFll9ml+HSA21m 02M蔗糖：D4液94ml+068g蔗糖 D1液：02M蔗糖46ml+丙二醇04m JiD2液：D1液lml+02M蔗糖1mD3液：02M蔗糖+D4液lm解冻步骤： 1确认患者身份找出相应的冷冻管，并进行记录。在解冻液器皿上标上记 号D1 D4。 2将冷冻管放入30水浴箱中2分钟. 3将胚胎由冷冻管中用吸管取出。 4将胚胎放入Dl中5分钟。 5将胚胎放入D2中5分钟。 6将胚胎放入D3中5分钟. 7将胚胎放入D4中5分钟. 8将胚胎放入IVF-ONE+10ttAS培养液中，放入C02培养箱内培养即可。胚胎可以马上植入，也可以培养数小时或隔天植入。要点：解冻必须一次成功 解冻操作在室温下进行(1820C0）确认患者身份并进行记录 辅助孵化 辅助孵化是利用物理或化学的方法，人为的在胚胎的透明带上制造一处缺损或裂隙从而有利于胚胎的发育，增加着床的可能性。一般在DAY2或DAY3移植前进行。化学方法 即利用Tyrode液的酸性在胚胎的透明带上溶解出一个15-30um的小孔。 1准备Tyrode液和HHTF微滴培养皿并加以平衡。 2将胚胎放入H一HTF微滴中，一枚胚胎一个微滴。 3将钻孔针调至Tyrode微滴中抽吸少量TYrode液,确保不漏液. 固定针将胚胎固定. 5将针尖刺入卵子透明带03点间部位。用打孔针接触透明带，前后移动少许,并将少量的Tyrode液注射到透明带表面。关键是要在操作中密切注意操作细节.首先溶解透明带外层，然后溶解内层。 6操作中尽量使所用的Tyrode液量减到最少，不要将TYrode液喷到胚胎内，并尽快先成操作，以免胚胎在酸性环境中的时问过长。 7该操作过程需要23分钟。胚胎应在新平衡的HHTF中冲洗，然后转移到胚胎培养液中.接下来的操作应尽可能的谨慎，以免造成卵列球丢失.激光方法即利用瑞士FERTILASER的第二带OCTAX激光破膜系统产生的激光束在胚胎的透明带上打孔。透明带打孔1. 准备HHTF微滴培养皿并加以平衡2. 将胚胎放入HHTF微滴中,一枚胚胎一个微滴3. 在倒置湿微镜下观察，选择透明带清晰空隙较大、无卵裂球处用激光束打孔4. 依透明带的厚度和韧性调节激光束的能量强度，一般在69之问5. 该操作过程需要2 3分钟。胚胎应在新平衡的HHTF中冲洗，然后转移到胚胎培养液中。接下来的操作应尽可能的谨慎，以免造成卵裂球丢失 胚胎着床前诊断（PGD)操作根据不同的病因用IVF或ICSI 高龄妇女（37岁以上)，如果有染色体异常的病史或流产史，需要做PGD。可以在人工刺激排卵及取卵后，用IVF使卵子受精。如果病人来做PGD是由于遗传病，由其携带的病变基因引起的，需要直接检查原因。这种情况下，选用ICSI,目的是防止粘在透明带上的精子有DNA的污染。受精卵的培养及取单细胞 从取卵的当天算(当天为0），将胚胎培养到DAY3时，即受精卵分裂到8个细胞期时，就可以从中取出12个单细胞做诊断。取细胞是在显微镜下操作，用固定针固定胚胎，然后用激光或酸性培养液将透明带打孔，再换取细胞的针，吸取12个细胞。FISH（Flurosence in-situ hybridization),PCR（Polymerase chain reaction）的选择 二者的选择是根据病人情况而定,检查染色体数目异常和结构异常(如平衡异位)，选用FISH。检查基因病变则选用PCR，对于x一连锁遗传病需做性别鉴定的，则选用FISH较简单。FISH的操作注意或规则1. 首先将取出的胚胎细胞固定在载玻片干后再进行脱水和去蛋白，使细胞核固定在玻片上2. 脱水后经固定和在缓冲液中冲洗后，加上荧光标记的DNA探针，然后在370C条件下杂交3. 杂交后，需要流掉非特异性结合的DNA探针,然后在荧光显微镜下检查细 胞核，检查结果必须有两人确定4. 整个操作要仔细，不能将细胞核丢失.检查细胞核时，要排除假阳性信号5. 整个操作过程要用血细胞做对照，防止因操作过程和溶液失效引起的误诊6. 整个溶液的PH值要确定，浓度要准确，保存温度适宜。PCR操作规则1. 所有用具都必须严格消毒，单独分开保存，防止DNA污染2. 操作人员必须戴无菌手套、消毒手术衣进入隔离室，隔离室内不允许带DNA 或血样本，防止交叉污染3. 所有溶液都要先去DNA污染后才能用4. 做PCR时，必须设阳性对照及阴性对照组,防止误诊5. PCR结果必须由两名检查人员同时阅读后出报告6. 定期检查PCR仪的温度是否达到实验要求，保持所有操作用具的清洁 因PGD是一项新的技术，可靠性不足100，故要求病人在做完PGD怀孕后，做绒毛膜穿刺或取羊水,再次检查胎儿染色体或基因，以确诊。防止因误诊而生出有基因缺陷的孩子。实验室人员的职业安全安全措施1. 参加每年度的体检2. 操作人员应进行乙肝病毒的免疫，每五年加强一次3. 一切体液类标本如精液,宫颈黏液或血液制品应作为潜在感染原处理4. 处理体液标本(精液、卵泡液、血清等)必须戴一次性手套，写记录单或离开实验室时应脱去手套，脱去手套时应洗手5. 如果裸露的手接触体液类物质,立即用清洁剂撤底清洗6. 如果眼睛或有创伤的皮肤不小心接触血液制品，立即消毒清洗7. 消毒衣和手套不准穿出实验室外8. 离开实验室休息或用餐前切记洗手9. 实验室内禁止吃东西、喝饮料、吸烟10. 操作标准化11. 肝炎或有其他传染病的病人的体液标本、冷冻胚胎、精子等应另行处理和保存液氮安全处理 装或倒液氮时戴上安全手套 不要单独举起液氮罐，须两人操作病人身份和标本标病人的身份标识1. 每位病人必须有明确的身份证明,其标示应是独一无二的2. 取卵和胚胎移植时必须与病人直接核对证实病人身份3. 如同时进行治疗的病人名字相同，必须另做标记(如病历号、年龄等）标本的识别和处理1. 不同病人的卵予、精子、胚胎等须分别放置于有标记的不同容器中2. 所有容器的标示必须是清楚、详细和决不含糊的3. 女性病人的姓名及相应的编号应标记在ICSl操作皿、培养皿、洗涤皿：,并同时标记在精液容器和精子洗涤管上实验室记录及保密实验室记录1. 记录取卵过程、精液情况、授精时间、方式、受精检查、卵裂检查、移植和胚胎冷冻情况2. 在冷冻胚胎移植周期，记录胚胎解冻情况3. 移植后13天时进行妊娠检测并汜录结果4. 记录精液冷冻和解冻的情况保密 病人允许进入实验室 未经允许非工作人员不得进入实验室 实验室钥匙专人保管、专人负责，不得借给他人，离开科室时上交负责 所有病人的实验室记录必须保密 完成一天工作后记住锁门 冻存标本 通知病人有天冷冻储存情况及所须费用 胚胎冷冻保存期限为半年，在病人的要求下可以延长 在胚胎冷冻保存期内，每半年应向病人说明胚胎冷冻情况，并 要求交纳每年的冷冻费用 病人有权在任何时候要求丢弃其本人的冷冻胚胎 丢弃胚胎（志愿或到期未延长者）：约每半年清理相关文件和选择 需要被丢弃的胚胎，从液氮中取出,由两个工作人员核对证实后 方能丢弃 填写记录单,加入病人的冷冻记录 卵子的捐赠 周期病人可自愿将多余卵子提供给其他需要卵子的病人；需要卵子的病人可以寻找亲友或自愿者提供卵子；本中心不参与卵子的捐赠。 供者和受者存卵子捐赠或接受协议上分别签字并经公证处 公证 来自一个人的卵子原则上只有单一受者 供者和受者的移植时间尽量避开 与国家有关规定冲突的应依照国家有关规定执行事故和问题事故 丢失精液、卵子、胚胎授精标本错误移植时胚胎错误问题违反实验室安全规则 找卵时未发现卵子及时通知临