单核细胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分离鉴定及其抑菌活性.pdf

生物工程 食品科学 2013,Vol.34,No.15 181单核细胞增生李斯特氏菌拮抗菌的分离鉴定及其抑菌活性许红岩1，段效辉1,*，李小清2(1.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；2.临沂市技术监督信息所，山东 临沂 276000)摘 要：从烟台近郊土壤中分离出一株单核细胞增生李斯特氏菌拮抗微生物sly-3，利用传统生理生化和分子生物学相结合的方法对其进行鉴定，并采用生物测定的方法评价其抑菌活性。菌株的形态学特征和生理生化特征与枯草芽孢杆菌基本一致，其16S rDNA序列与GenBank中已鉴定的枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性达99%以上，据此初步确定其为枯草芽孢杆菌。抑菌谱研究发现，该菌仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌无明显抑制作用。sly-3菌株发酵过滤液初步作用于水产品中单核细胞增生李斯特氏菌，发现可有效抑制该致病菌的生长，且在高温处理条件下保留较高的抑菌活性，在食品保鲜中显示出了良好的应用前景。关键词：水产品；单核细胞增生李斯特氏菌；拮抗菌Isolation and Identification of Antagonistic Strain against Listeria monocytogenesXU Hong-yan1，DUAN Xiao-hui1,*，LI Xiao-qing2(1.Yantai Entry-exit Inspection and Quaratine Bureau,Yantai 264000,China；2.Linyi City Technical Supervision Information Institute,Linyi 276000,China)Abstract：In this study,sly-3 strain that can inhibit Listeria monocytogenes was isolated from soil in Yantai suburb.The morphological,physiological and biochemical characteristics of the isolated strain were basically consistent with those of Bacillus subtilis and the homology of 16S rDNA sequence between sly-3 and B.subtilis CICC10034 was 99%.On the basis of these results,sly-3 was fi nally identifi ed as Bacillus subtilis.The antagonistic activity of sly-3 strain also suggested that only G+bacteria could be inhibited but G bacteria could not be inhibited.Meanwhile,the 24 h culture fi ltrate of sly-3 exhibited high inhibitory activity against Listeria monocytogenes from export aquatic products.Key words：aquatic products；Listeria monocytogenes；antagonistic strain中图分类号：Q939.92 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)15-0181-05doi:10.7506/spkx1002-6630-201315037收稿日期：2012-06-09基金项目：国家质检总局科研项目(2005IK022)作者简介：许红岩(1981)，男，兽医师，硕士，研究方向为食品检测。E-mail：*通信作者：段效辉(1978)，女，高级工程师，博士，研究方向为食品检测。E-mail：单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LMO)是水产品中一种常见致病微生物，可引起食源性李斯特菌病，致死率高达30%以上，对免疫缺损的病人致死率甚至高达70%以上。据世界卫生组织报道，有4%6%的水产品都被该菌污染，由于该菌在4条件下仍可繁殖，对冷冻水产品的安全性有着严重的威胁。目前水产品中病原菌的控制一般借助于含有氯成分的消毒剂，这种处理方式，一方面会在产品表面残留较多的氯成分，对产品的风味会产生不良影响，氯成分的残留还有可能对食用者的健康造成危害，失去其原有的经济价值。目前常用的其他控制措施，如：食品中常用的辐照方法，需要特殊的仪器设备；加热等一些物理方法会改变水产品本身的特性，而不能在水产品的LMO控制中得到广泛应用。水产品中LMO的控制措施对于出口企业来说仍然是棘手的问题。利用生物防控的方法，可有效抑制食品中致病微生物的生长且不会对食品造成有害残留1-3，这也吸引了越来越多致力于食品安全研究的工作者的目光。赵秀娟等4研究发现分离得到的土壤微生物对草莓中灰葡萄孢等病原菌具有明显拮抗作用。黄惠莉等5分离出的海洋微生物L菌株可有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。林敏等6分离出多株海洋微生物，具有较广的抑菌谱，能同时抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。Wang Xinghua等7分离出同时具有降解苦杏苷和抑菌活性的微生物，以期用于生产。182 2013,Vol.34,No.15 食品科学 生物工程目前，利用生物防控法抑制水产品中LMO的研究还未见报道。本研究旨在分离LMO拮抗微生物及其活性物质，对其应用于水产品中LMO的抑制进行初步探索。1 材料与方法1 材料与方法1.1 菌种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC19111)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria mo n o c y t o g e n e s，LMO090612、LMO091107、LMO100416、LMO100602共4株，由本实验室从出口水产品中分离并鉴定得到)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，ATCC14028)、大肠杆菌(Escherichia coli，ATCC25922)。1.2 培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，固体另加琼脂20g/L，pH7.4。PACALM培养基(GB4789.302010食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验)8。TSA-YE培养基(GB4789.302010食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验)8。1.3 方法1.3.1 目标微生物的初筛利用稀释涂布平板法9-10，分离筛选土壤微生物，并保存于4冰箱备用。1.3.2 发酵过滤液的制备将分离得到的不同微生物分别接种于LB液体培养基中，36恒温振荡培养24h。收集不同微生物发酵液5000r/min离心10min，取上清。收集到的上清首先用0.45m的滤膜过滤，后用0.22m的滤膜过滤，所得滤液即为发酵过滤液。收集过滤液，置于4冰箱备用。1.3.3 LMO拮抗微生物的筛选采用杯碟法11-13筛选LMO拮抗微生物。以PACALM平板为指示平板，选择牛津杯周围有明显透明抑菌圈的微生物接种于营养琼脂，用于微生物抑菌谱研究和微生物鉴定。1.3.4 发酵过滤液抑菌谱测定采用杯碟法11-13检测sly-3发酵过滤液对单核细胞增生李斯特氏菌(LMO090612、LMO 091107、LMO 100416、LMO 100602)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、大肠杆菌(ATCC25922)的抑制作用。十字交叉法用直尺测量牛津杯周围透明圈直径。1.3.5 发酵过滤液对水产品中LMO的抑制作用测定采用将在LMO菌悬液(菌液浓度为105CFU/mL)中浸泡1min的冷冻扇贝柱捞出沥干后，分成2份。一份用无菌蒸馏水喷洒后置于无菌袋封口，一份将拮抗微生物发酵过滤液喷洒于样品表面同样置于无菌袋内封口，样品都置于4冰箱保存，静置10min后，取25g用3M环境李斯特菌测试片进行李斯特菌计数，并用国家标准GB4789.3020108进行鉴定。每隔1d，将2份样品各取出25g进行李斯特菌计数和鉴定，每次做3个平行，取平均值。连续观察至第7天，计数样品中LMO数量的变化。1.3.6 抑菌微生物的鉴定将分离得到的且发酵过滤液有显著抑菌活性的菌株按照传统生理生化方法和分子生物学鉴定的方法进行鉴定。1.3.6.1 传统方法鉴定参照常见细菌系统鉴定手册14，进行革兰氏染色、明胶液化、运动性等实验。1.3.6.2 分子生物学方法鉴定采用文献15-16中的引物序列和PCR反应体系，进行16S rDNA序列扩增。PCR产物与pMD-18T载体于16连接过夜，并转化大肠杆菌DH5，于37培养24h。转化子由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果与GenBank数据库中的序列进行同源性比较。1.3.7 发酵过滤液中蛋白类物质的提取取100mL发酵过滤液中缓缓加入硫酸铵细粉，边加边搅拌，使最终饱和度为50%，4冰箱中过夜，取出迅速于12000r/min离心20min，分别收集沉淀和上清液。沉淀复溶于pH7.0磷酸钠盐缓冲溶液即得蛋白溶液；上清液补足即得去蛋白液。检测抑菌活性时分别以pH7.0磷酸缓冲溶液和50%的硫酸铵溶液为空白对照。1.3.8 发酵过滤液中多糖类物质的提取取发酵过滤液20mL，加入3倍体积无水乙醇，4冰箱过夜，5000r/min离心20min后，分别收集上清液和沉淀。沉淀用石油醚脱脂，蒸馏水溶解，离心去杂质，定容至20mL，即得多糖溶液上清液；40减压回收乙醇至无醇味后加蒸馏水定容，即得去糖发酵液。1.3.9 多糖和蛋白类物质抑菌活性的测定采用杯碟法11-13检测sly-3发酵过滤液中提取的多糖和蛋白类物质对单核细胞增生李斯特氏菌(LMO090612、LMO 091107、LMO 100416、LMO 100602)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、大肠杆菌(ATCC25922)的抑制作用。十字交叉法用直尺测量牛津杯周围透明圈直径。1.3.10 发酵过滤液热稳定性研究将发酵过滤液分别在4、25、36、80处理15h，121处理30min后，迅速恢复至室温后，检测其抑菌活性，对照为新鲜的、未经高温或低温处理的无菌发酵过滤液。生物工程 食品科学 2013,Vol.34,No.15 1832 结果与分析 2 结果与分析 2.1 sly-3菌株发酵过滤液对土壤中LMO的抑制作用14320.空白对照；13.sly-3菌株发酵过滤液50、100、200L。图 1 sly-3菌株发酵过滤液对LMO的抑制作用图 1 sly-3菌株发酵过滤液对LMO的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of sly-3 culture filtrate on Listeria monocytogenes in palcam plate从土壤中分离培养多株微生物，杯碟法筛选LMO拮抗微生物。结果分离得到12株对LMO有抑菌作用的原核微生物。由图1可知，菌株sly-3对LMO有明显抑制作用。在PALCAM平板上涂布接种LMO后，分别在平板上的牛津杯中加入50、100、200L抑菌微生物发酵过滤液和200L无菌LB培养基培养。结果发现随着发酵过滤液的增加，发酵过滤液对LMO的抑菌圈的直径也不断增大。经十字交叉法对抑菌圈直径测量后发现，当sly-3发酵过滤液为200L时，其抑菌圈直径可达到20mm。2.2 sly-3菌株发酵过滤液对微生物的抑菌谱aba、b.sly-3发酵过滤液分别为100、200L。图 2 sly-3菌株发酵过滤液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用图 2 sly-3菌株发酵过滤液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用Fig.2 Inhibitory effect of sly-3 culture filtrate on Staphylococcus aureus in LB agar plate采用杯碟法检测了sly-3发酵过滤液对水产品中分离出的LMO(LMO090612、LMO 091107、LMO 100416、LMO 100602)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、大肠杆菌(ATCC25922)的抑菌活性。图2是在营养琼脂平板上涂布接种金黄色葡萄球菌后，分别在平板上的牛津杯中加入100L和200L sly-3发酵过滤液后的结果。表明sly-3发酵过滤液对金黄色葡萄球菌有抑制作用。表 1 发酵过滤液对供试菌种的抑菌结果表 1 发酵过滤液对供试菌种的抑菌结果Table 1 Inhibitory effect of sly-3 culture filtrate on pathogenic Table 1 Inhibitory effect of sly-3 culture filtrate on pathogenic microorganismsmicroorganisms编号菌种名称抑菌圈直径/mm1单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC19111)20.10.12单核细胞增生李斯特氏菌(LMO 090612)22.00.33单核细胞增生李斯特氏菌(LMO 091107)20.40.24单核细胞增生李斯特氏菌(LMO 100416)19.60.15单核细胞增生李斯特氏菌(LMO 100602)22.10.16金黄色葡萄球菌(ATCC25923)14.50.37大肠杆菌(ATCC25922)8鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)注：牛津杯的外径为 8mm；.无抑菌圈。由表1可知，sly-3发酵过滤液对从水产品中分离出的几株LMO均有明显抑制作用，而对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌无明显抑制作用。sly-3发酵过滤液对LMO、金黄色葡萄球菌代表的革兰氏阳性菌有显著抑制作用，对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌所代表的革兰氏阴性菌无明显抑制作用。据此可以推测，该拮抗微生物仅对革兰氏阳性细菌有抑制作用，而对革兰氏阴性细菌则没有抑制作用。原因很可能是由于细菌细胞壁结构的不同造成了不同的抑菌效果。2.3 sly-3菌株鉴定结果2.3.1 生理生化鉴定结果表 2 sly-3菌株初步生化鉴定表 2 sly-3菌株初步生化鉴定Table 2 Biochemical characteristics of sly-3 Table 2 Biochemical characteristics of sly-3 项目明胶液化MR实验VP实验 触酶实验 水解淀粉实验 运动性实验 柠檬酸盐实验结果注：.阳性反应。图 3 sly-3菌株革兰氏染色结果图 3 sly-3菌株革兰氏染色结果Fig.3 Gram staining of sly-3图 4 sly-3菌株菌落形态观察图 4 sly-3菌株菌落形态观察Fig.4 Colony characteristics of sly-3184 2013,Vol.34,No.15 食品科学 生物工程按照 常见细菌系统鉴定手册14，对sly-3菌株进行革兰氏染色、明胶液化、甲基红等实验，进行生理生化鉴定。由表2及图34可知，sly-3菌株为革兰氏阳性杆菌，明胶液化、MR-VP、触酶、水解淀粉、运动性以及柠檬酸盐实验结果均呈阳性，与枯草芽孢杆菌生理生化特征完全相符。2.3.2 分子生物学方法鉴定结果用原核生物16S rDNA通用引物序列扩增出1.5kb的特异性条带，将测序结果相互重叠拼接，得菌株sly-3的16S rDNA序列。将此序列与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，并构建系统进化树结果如图5所示，sly-3与已知菌株B.subtilis CICC10034亲缘关系最近，在同一分支，二者的16S rDNA序列同源性达99%以上。说明sly-3生理生化和分子生物学特征符合枯草芽孢杆菌的特征，遂确定sly-3为枯草芽孢杆菌。Bacillus subtilis ClCC10034Bacillus subtilis PCL1608Bacillus subtilis D53Bacillus pumilus 1Re36Bacillus pumilus 51-3cBacillus pumilus 007.2Bacillus cereus H1439Bacillus thuringiensis xjul-8Bacillus cereus XJU-1Bacillus cereus W-2Bacillus thuringiensis F1-02asly-364951001001000.0056450图 5 sly-3菌株系统进化树图 5 sly-3菌株系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of sly-32.4 sly-3发酵过滤液对水产品中LMO的抑制作用01234567890357?/d菌落数(lg(CFU/g)sly-3菌株?图 6 sly-3菌株发酵过滤液对水产品中LMO的抑制作用图 6 sly-3菌株发酵过滤液对水产品中LMO的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of sly-3 culture filtrate on Listeria monocytogenes in aquatic products将sly-3菌株接种于LB液体培养基培养24h后，经过过滤除菌得到发酵过滤液。将发酵过滤液喷洒于被LMO污染的冷冻扇贝柱表面，置于4环境保存，每隔1d用美国3M环境李斯特测试片检测扇贝柱中LMO的数量，结果如图6所示。冷冻水产品中喷洒于水产品表面的sly-3发酵过滤液不能立刻抑制水产品中LMO菌株，当对样品跟踪检验其LMO数量发现，3d之后，sly-3发酵过滤液组LMO数量明显低于无菌水组，随后无菌水组和sly-3菌株发酵过滤液组都呈不断增长趋势，但sly-3菌株发酵过滤液组LMO数量明显低于无菌水组。这可能是由于发酵过滤液中含有糖类等营养物质，有助于细菌的繁殖，且由于第0天发酵过滤液仅喷洒于污染物表面10min，还不能对LMO起到抑制作用，使得LMO数量高于无菌水组。但在后期，蛋白类抑菌物质发挥作用，抑制了LMO的繁殖，使得该菌数量明显低于对照组，起到了抑制水产品中LMO的作用。2.5 sly-3菌株发酵过滤液中抑菌活性物质的初步鉴定2.5.1 多糖类物质抑菌活性 近来多糖抑菌作用的研究已有很多，枯草芽孢杆菌也能产生多糖，而已有研究对枯草芽孢杆菌多糖是否具有抑菌作用则不甚确定。本实验对枯草芽孢杆菌多糖和去多糖发酵液利用杯碟法，选用LMO(ATCC19111)进行抑菌实验，结果见表3。枯草芽孢杆菌多糖溶液未表现出抑菌活性，而去多糖发酵液对供试LMO的抑制效果相当于对照发酵液的85.23%，因此可以判定多糖并非发酵液的抑菌成分。表 3 表 3 sly-3菌株sly-3菌株发酵过滤液不同成分抑菌活性实验结果发酵过滤液不同成分抑菌活性实验结果Table 3 Inhibitory effects of different components from sly-3culture Table 3 Inhibitory effects of different components from sly-3culture filtrate on filtrate on Listeria monocytogenesListeria monocytogenes 抑菌效果多糖去多糖发酵液蛋白质去蛋白质发酵液发酵过滤液抑菌圈直径/mm提纯后抑菌圈直径/mm保留的抑菌活性/%20.10.10020.10.117.10.385.2320.10.117.80.188.3520.10.1002.5.2 发酵液中蛋白类物质的抑菌活性 利用杯碟法对蛋白类提取物进行抑菌实验，结果如表3所示，蛋白类提取物的抑菌活性为总发酵液的88.35%，去蛋白发酵液无抑菌活性。蛋白类提取物呈茚三酮反应阳性。结合上述结果可知，蛋白类物质为发酵液的主要抑菌成分。2.6 温度对抑菌物质活性的影响 0204060801001204253680121?/?/%图 7 温度对sly-3菌株发酵过滤液抑菌活性的影响图 7 温度对sly-3菌株发酵过滤液抑菌活性的影响Fig.7 Effect of temperature on the antagonistic activity of sly-3由图7可知，发酵液在常压下经过各种处理后均有80%以上的活性，121处理30min后也能保持50%以上的活性。在所选择的5个温度中，4是常规冷藏温度，生物工程 食品科学 2013,Vol.34,No.15 18525是室温，36是夏季时的室外温度，80是巴氏杀菌温度，121则是高压灭菌温度。实验结果表明，发酵液中的抑菌成分具有很好的热稳定性，在进行多种热处理后仍能保持较高的抑菌活性，可望应用于食品加工解决LMO污染问题。3 讨 论3 讨 论细菌的鉴定一般分为传统生理生化鉴定和分子生物学鉴定。本研究利用传统方法确定了拮抗微生物sly-3的菌落形态、革兰氏染色结果、芽孢染色及其他各项生理生化指标，发现各项特征与枯草芽孢杆菌的生理生化特征十分吻合。同时利用分子生物学方法，分析了LMO拮抗菌sly-3菌株16S rDNA序列，其与枯草芽孢杆菌的同源性高达99%以上。一般认为细菌间16S rDNA 基因序列同源性达97%以上的菌株即可定为同一个种，因此结合传统生理生化方法和分子生物学方法将LMO拮抗菌株sly-3鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是一种应用广泛的生防菌，其抑菌谱广，国外已开发出防治各类作物白粉病、霜霉病、炭疽病等真菌与细菌病害的菌剂。国内用于防治水稻纹枯病和三七根腐病等病害也取得了良好的效果17-18。除了用于植物病害的防治，枯草芽孢杆菌还被用于水产养殖以防治动物病害或提高动物免疫力19-20。然而，到目前为止，利用枯草芽孢杆菌的生防法在食品保鲜中却鲜有报道。主要是受到利用菌体会增加食品本身的污染，而分离到的抑菌代谢物对温度高度敏感不适合于应用到食品的保鲜等方面的限制。本研究分离得到的抑菌代谢物对水产品中分离的单核细胞增生李斯特菌表现了显著地抑制作用，且在121条件下处理30min仍保留50%以上的抑菌活性，有着良好的热稳定性，明显优于Lim等21分离得到的Bacillus subtilis BP6菌株，在食品加工中有着良好的应用前景。本课题组将继续分离纯化出发酵过滤液中活性物质，探究拮抗微生物活性物质代谢机理，通过优化发酵条件等方法提高其抑菌活性，同时探索其在食品保鲜中的安全性，并期望在食品包装中引入该活性物质，开发出作用显著的抑菌保鲜包装材料，为其在水产品加工方面广泛应用打下基础。参考文献：参考文献：1 KIM K J,YOO D S,KIM Y B,et al.Characteristics of sophorolipid as an antimicrobial agentJ.J Microbiol Biotechn,2002,12(2):235-241.2 SHAV V,BADIA D,RATSEP P.Sophorolipids having enhanced antibacterial activityJ.Antimicrob Agents Ch,2007,51(1):397-400.3 陈静,宋欣,曲音波,等.酵母胞外槐糖脂产生条件优化及其抑菌作用J.山东大学学报:理学版,2005,40(3):116-120.4 赵秀娟,徐文桥,张凤巧,等.土壤拮抗微生物对几种草莓病原菌的拮抗作用测试J.中国农业科技导报,2007,9(2):77-81.5 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