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细菌的简单染色和革兰染色

生72 伍国羽 2007012357
组别：周四班 2-1-1
实验同组人：王甦
实验时间 2010年3月25日

实验目的
1) 掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤
2) 掌握革兰氏染色法的步骤和关键点
3) 识别细菌的革兰氏染色结果
4) 学习无菌操作技术

实验原理
革兰染色法由丹麦病理学家Christain Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类。
近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

实验器材
载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；
结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；
枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌、平板，大肠杆菌平板，牙垢。

实验步骤
1) 涂片
左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
室温下自然干燥。
2) 固定
手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
3) 初染
滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。
4) 媒染
用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。
5) 脱色
用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。
6) 复染
滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。
7) 镜检照相
吸干载玻片背面及标本周围水渍,滴上半滴水，盖上盖玻片,油镜镜检；看到合适的结果后拿着标本到4楼实验室显微摄影。

实验结果与讨论
1. 实验结果图与讨论分析
1) 大肠杆菌
图1. 大肠杆菌显微图，放大倍数100X10=1000倍。菌体个体小，短棒状，分散存在。革兰氏染色结果呈红色。
染色结果符合理论，为革兰氏阴性菌。实验过程中发现取平板上的菌进行实验菌体多，密度大，易于制作和观察，而使用液体菌液则由于菌体过少而效果不佳。实验中发现大肠杆菌菌体耐受性较好，固定时需要温度略高，否则固定不容易成功。

2) 枯草芽孢杆菌
图2. 枯草芽孢杆菌，放大倍数100X10=1000倍。菌体个体较大，呈杆状。革兰氏染色结果呈紫色。
染色结果符合理论，为革兰氏阳性菌，但偏向于红紫色。推断枯草芽孢杆菌细胞壁不是特别的厚，故结晶紫的颜色被洗掉了一些，菌体最终的染色结果偏向红紫色。

3) 金黄色葡萄球菌
图3. 金黄色葡萄球菌，放大倍数100X10=1000倍。菌体个体小，球状，成团存在。革兰氏染色结果呈紫色。
染色结果符合理论，为革兰氏阳性菌。实验中过程发现如果菌体较多，堆叠较厚，最终染色番红染液的颜色不容易冲掉，造成菌体最终呈现红色，得到错误的染色结果。因此在做革兰氏染色的时候要注意选取菌体的量。

4) 酵母
图4. 酵母，放大倍数100X10=1000倍。菌体个体巨大，卵圆形。革兰氏染色结果呈紫色。
染色结果符合理论，为革兰氏阳性菌。但是拍照后颜色失真较多，故拍摄照片颜色比较偏红，实际观察到的酵母菌体颜色呈现出明显蓝紫色。

5) 未知菌S1
图5. 未知菌S1，放大倍数100X10=1000倍。菌体个体较大，呈棒状。革兰氏染色呈紫色。
染色结果显示未知菌为革兰氏阳性菌。实验过程中出现了组别之前对于未知菌染色结果的差异，但大多数同学的结果鉴定此菌为革兰氏阳性。故本实验结果基本可靠。染色结果呈红色的同学有可能是因为菌体太多，重叠之后番红的颜色不容易冲掉，最终呈现出红色，导致了结果的错误。

6) 牙垢
图6. 牙垢，放大倍数100X10=1000倍。菌体繁多，大部分染色后呈现红色，个体较小，形态为短棒状，一部分染色后呈现紫色，以大团块形式存在。
牙垢中菌种繁多，一部分为革兰氏阳性，一部分为革兰氏阴性。实验中直接用牙签刮牙齿取菌，容易带下较多的食物残渣，影响最终的观察。可以考虑改进实验提前一天将刮下牙垢溶于水后涂平板培养一段时间后取菌体观察。

2. 列表简述染色结果
菌种
菌体形状特征
染色后颜色
革兰氏染色结果
大肠杆菌
菌体个体小，短棒状，分散存在。
红色
阴性
枯草芽孢杆菌
菌体个体较大，呈杆状。
紫色
阳性
金黄色葡萄球菌
菌体个体小，球状，成团存在。
紫色
阳性
酵母
菌体个体巨大，卵圆形。
紫色
阳性
未知菌S1
菌体个体较大，呈棒状。
紫色
阳性
牙垢
菌体繁多，大部分染色后呈现红色，个体较小，形态为短棒状，一部分染色后呈现紫色，以大团块形式存在。
紫色、红色
阳性、阴性

3. 影响微生物革兰氏染色结果的因素
菌龄、细菌密集程度、媒染时间、乙醇脱色程度、热固定温度等会影响革兰氏染色的正确性。
菌龄：革兰氏染色要求菌种被染色时处于活跃生长期。此时菌体的细胞壁成分和结构最为典型，经革兰氏染色液处理后，能正确地反映染色的结果。若菌体细胞未成熟或已经老化，染色结果可能会出现完全相反的情况。
菌龄对革兰氏染色的结果有较大的影响，且与活跃生长期的时间差距越大，影响也越大；菌龄对革兰氏阴性菌的染色结果的影响较阳性菌大。其机理尚待研究，可能与阴性菌细胞壁结构中类脂质的生成、降解变化有关。菌龄提前较之菌龄推迟对染色结果的影响小得多。
涂片质量：根据文献用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作为模式菌研究分析，涂片浓厚时，菌体明显堆积在一起，因大肠杆菌密集不易脱色或脱色不完全而呈G+反应；而枯草芽孢杆菌涂片浓厚时，以至残留大量结晶紫，经番红复染后观察不到典型的蓝紫色而常常呈现紫色。因而无论大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌涂片时均匀分散才能得到正确的结果。
媒染时间：媒染时间过短，不利于初染液结晶紫与细胞之间的结合，因而可能造成阳性菌呈阴性结果；反之，媒染时间过长，容易使阴性菌呈假阳性。媒染时间应控制在60s左右为宜。
乙醇脱色时间：乙醇脱色时间不够，阴性菌可能被染成阳性菌，虽然只差10s、20s，但染色结果相差较大。因此，革兰氏染色要严格控制脱色时间，一般以30～60s为宜。
脱色时间延长只对革兰氏阳性菌的染色结果有影响，对革兰氏阴性菌影响较小。而脱色时间缩短只对革兰氏阴性菌的染色结果有影响，对革兰氏阳性菌无影响。
热固定温度：将已干燥的涂片在火焰上通过3-4次，温度不超过60度，以手背接触不烫为宜。温度低则菌体固定不牢，水洗时易被冲去；温度高菌体会发生变形。

4. 未知菌混合液
未知菌制片染色结果，只发现一种革兰氏染色呈紫色的革兰氏阳性菌，菌体呈棒状。仅从外型和染色结果无法鉴定出其菌种。

5. 牙垢里微生物
牙垢里微生物形态各异，菌体繁多，大部分染色后呈现红色，个体较小，形态为短棒状，一部分染色后呈现紫色，以大团块形式存在。一部分为革兰氏阳性，一部分为革兰氏阴性，以革兰氏阴性菌居多。但是由于食物残渣的影响较大，不易区分食物残渣与菌体，故会给实验结果带来影响和偏差。建议先将牙垢溶于水，涂平板培养一段时间后再调取菌体染色观察，更为合理与准确。

6. 甲紫药水杀菌机理
甲紫药水属三苯甲烷类染料消毒剂，能与微生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，而发挥杀菌作用。主要对革兰阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及铜绿假单胞菌、白色念珠菌、表皮癣菌有杀灭作用，对其它革兰阴性菌和抗酸菌几乎无作用。有实验报告表明动物全身性(或系统性)吸收甲紫可致癌，有的国家规定本品只能用于局部未破损皮肤，严禁内服。
龙胆紫溶液（紫药水）：为C25H30ClN3。龙胆紫为一种碱性阳离子染料，因其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合，影响其代谢而产生抑菌作用。它能抑制革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌、白喉杆菌，对白色念珠菌也有较好的抗菌作用。它杀菌力强，对组织没有刺激性，也没有毒性和副作用。它也能与坏死组织结合形成保护膜，起到收敛作用。

参考文献
[1]陈金春，陈国强. 微生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2005
[2]Michael T. Madigan, John M. Martinko. Biology of microorganism. Eleventh edition. America: Pearson Prentice Hall, 2006
[3] 王芳，宋瑛琳，田明. 革兰氏染色结果的影响因素及原因分析. 实验室科学, 第l期2009年2月
[4]百度百科