实时荧光定量qPCR手册——教你从菜鸟到高手.pdf

北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司北京百泰克生物技术有限公司 Real-time qPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手 Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 2 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 目录目录目录目录 前言前言前言前言.3 一一一一、Real-time qPCR 发展史发展史发展史发展史.3 二二二二、Real-time qPCR 概述概述概述概述.3 三三三三、Real-time qPCR 实验设计实验设计实验设计实验设计8 四四四四、Real-time qPCR 操作操作操作操作过程过程过程过程.9 五五五五、Real-time qPCR 数据分析数据分析数据分析数据分析.16 六六六六、Real-time qPCR 常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析.19 Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 3 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 前言前言前言前言 由于由于由于由于 Real-time qPCR 的众多优点的众多优点的众多优点的众多优点，现在已经是现在已经是现在已经是现在已经是生命科生命科生命科生命科学领域的一项常规技学领域的一项常规技学领域的一项常规技学领域的一项常规技术术术术。越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验的实验的实验的实验，也基本上被也基本上被也基本上被也基本上被 real-time qPCR所代替所代替所代替所代替。由于由于由于由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测电泳检测电泳检测电泳检测，很很很很多没多没多没多没有做过有做过有做过有做过 real-time qPCR 的研究者的研究者的研究者的研究者常常常常常常常常感到高深莫测感到高深莫测感到高深莫测感到高深莫测，不知从何入手不知从何入手不知从何入手不知从何入手；甚至一些甚至一些甚至一些甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑感到迷惑感到迷惑感到迷惑，不知所措不知所措不知所措不知所措。本文就从本文就从本文就从本文就从real-time qPCR 的发展史说起的发展史说起的发展史说起的发展史说起，包括包括包括包括 real-time qPCR 的原理的原理的原理的原理，实验设计实验设计实验设计实验设计，实际实际实际实际操作操作操作操作（以以以以 ABI StepOne 仪器仪器仪器仪器，和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例），），），），数数数数据分析据分析据分析据分析，常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解 real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手！一一一一、Real-time qPCR 发展史发展史发展史发展史 Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的 PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在 Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量 PCR 仪的发展起了至关重要的作用。1995 年，美国 PE 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman技术，1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有 ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM StepOne TM系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4 TM Opticon 系列；Stratagene Mx TM系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Masercycler；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler 和 BIOER 的 LineGene 系列（考虑到其是日资子公司，还是不并入国内企业吧！）。随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。二二二二、Real-time qPCR 概述概述概述概述 1.Real-time qPCR 原理原理原理原理 实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 4 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 Ct 检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。（From Invitrogen）2.Real-time qPCR 的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理 也就是说为什么 Ct 值跟初始模板的量成正比？首先来看一个 real-time qPCR 中的重要参数（具体的后面会讲到）Ct 值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的是 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 5 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 那么为什么说那么为什么说那么为什么说那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢？我们来看我们来看我们来看我们来看 PCR 的扩增方程的扩增方程的扩增方程的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+E)，所以 E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲 PCR扩增效率在 90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 6 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 是引物二聚体造成。3.Real-time qPCR 的种枑的种枑的种枑的种枑 根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为 2 大枑：一枑为探针枑 包括TaqMan探针和 分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。；一枑为非探针枑，其中包括如 SYBR Green I 或者特殊设计的引物(如 LUX Primers)通过荧光染料来只是产物的增加。3.1 Taqman 探针法探针法探针法探针法 Taqman探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5端标记一个报告荧光基团，3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的 53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的枌积与PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。3.2 分子信标法分子信标法分子信标法分子信标法 分子信标分子信标分子信标分子信标：一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 7 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 3.3 SYBR Green 法法法法 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR GreenI 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR Green 荧光染料，SYBR Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。3.4 LUX primers 法法法法 LUX(light upon extention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 8 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 4.Real-time qPCR 和常规和常规和常规和常规 PCR 的区别的区别的区别的区别?实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测?敏感性高?需要样品少?特异性高?精确定量 三三三三、Real-time qPCR 实验设计实验设计实验设计实验设计 实验设计其实比实验本身更重要实验设计其实比实验本身更重要实验设计其实比实验本身更重要实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍好的实验设计可以事半功倍好的实验设计可以事半功倍好的实验设计可以事半功倍，节省时间节省时间节省时间节省时间！尤其做生物实验尤其做生物实验尤其做生物实验尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料一定要查询尽可能完全的相关资料一定要查询尽可能完全的相关资料一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路整理好思路整理好思路整理好思路，设计好实设计好实设计好实设计好实验路线验路线验路线验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化当然实验过程中出现各种各样的变化当然实验过程中出现各种各样的变化当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识但有足够多的背景知识但有足够多的背景知识但有足够多的背景知识，就可就可就可就可以分析原因以分析原因以分析原因以分析原因，才有可能创新才有可能创新才有可能创新才有可能创新。对于一个对于一个对于一个对于一个 real-time qPCR 而言而言而言而言，首先就是实验材首先就是实验材首先就是实验材首先就是实验材料的处理和料的处理和料的处理和料的处理和准备准备准备准备；然后引物设计然后引物设计然后引物设计然后引物设计，这步至关重要这步至关重要这步至关重要这步至关重要，好的引物是实验本身成功的好的引物是实验本身成功的好的引物是实验本身成功的好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析进行实验和数据分析进行实验和数据分析进行实验和数据分析（这一部分单独说明这一部分单独说明这一部分单独说明这一部分单独说明）。）。）。）。1.实验材料的处理和准备实验材料的处理和准备实验材料的处理和准备实验材料的处理和准备 以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免 RNA 的降解（尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮枑 的 样 品 储 存 液，比 如 百 泰 克 的RNAfixer（Cat.No.RP1301 http:/ 一般一般一般一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则引物的设计遵循下面一些原则引物的设计遵循下面一些原则引物的设计遵循下面一些原则：?扩增产物长度在 80-150bp。?引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。?产物不能形成二级结构。?产物长度一般在 1530 碱基之间。?G+C 含量在 40%60%之间。?碱基要随机分布。?引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。?引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。?引物 5端可以修饰。?引物 3端不可修饰。?引物 3端要避开密码子的第 3 位。Taqman 探针的设计稍有不同探针的设计稍有不同探针的设计稍有不同探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成一般有公司设计合成一般有公司设计合成一般有公司设计合成。遵循下面一下原则遵循下面一下原则遵循下面一下原则遵循下面一下原则：Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 9 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852?尽量靠在上游引物；?长度 3045bp，Tm 比引物高至少 5；?5端不要是 G，G 会有淬灭作用，影响定量 四四四四、Real-time qPCR 操作过程操作过程操作过程操作过程（本操作过程以本操作过程以本操作过程以本操作过程以 ABI StepOne 定量定量定量定量 PCR 仪和北仪和北仪和北仪和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例京百泰克生物技术有限公司的试剂为例京百泰克生物技术有限公司的试剂为例京百泰克生物技术有限公司的试剂为例）1.RNA 提取提取提取提取和反转录和反转录和反转录和反转录 在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：1.全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。2.使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。3.在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行 RNA 的提取。百泰克是以开发和生产 RNA试剂盒为特长的公司，有多种 RNA 提取试剂盒（http:/ 是从组织细胞中提取 RNA 的操作步骤。如果是进行一步法 real-time qPCR（以总 RNA 或 mRNA为模板），就直接按照说明书在 MasterMix 里加入 RNA 和引物就可以放在仪器上进行反应。如果是两步法（以 cDNA 为模板）。反转录一般取 1g 或者 2g的总 RNA，20l或者 50l的反应体系，按说明书操作即可。BOX2 是百泰克的Super RT Kit(Cat.No.PR 6601http:/ 配制配制配制配制 一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做 3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100-400mM；模板如果是总 RNA一般是 10ng-500，如果 cDNA，通常情况下是 1l 或者 1l 的 10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 10 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 根据所用 MasterMix，模板和引物的不同就行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1.MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。2.更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4.所有成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品至少 3 个平行孔。BOX 1：从组织中提取总从组织中提取总从组织中提取总从组织中提取总 RNA 1.用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品，保存于液氮内样品需要用研钵磨碎，每50100mg组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。2.将匀浆样品剧烈震荡混匀，在 15-30C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解。3.可选步骤可选步骤可选步骤可选步骤：4C 的条件下 12，000rpm 离心 10 分钟，小心取上清转入一个新的 RNase-free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉。脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在 28C 的条件下以 12,000rpm 离心 10 分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量 DNA，而上层的超浮游物含有 RNA。4.每 1mlRL 加 0.2ml 氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡 15 秒并将其在室温下孵育 3 分钟。5.于 412，000rpm 离心 10 分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 存在于水相中。水相层的容量大约为所加 RL 体积的 60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。6.加入1倍体积70乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。7.10，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。8.加500l 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。9.加入700l漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。10.加入500l漂洗液RW，12,000 rpm 离心60秒，弃掉废液。11.将吸附柱RA放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留以免漂洗液中残留以免漂洗液中残留以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应乙醇抑制下游反应乙醇抑制下游反应乙醇抑制下游反应。12.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位在吸附膜的中间部位在吸附膜的中间部位在吸附膜的中间部位加50-80l RNase-free water（事先在 65-70水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30l RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。洗脱体积越大洗脱体积越大洗脱体积越大洗脱体积越大，洗脱效率越高洗脱效率越高洗脱效率越高洗脱效率越高，如果需要如果需要如果需要如果需要 RNA 浓度较高浓度较高浓度较高浓度较高，可以适当减少洗脱体积可以适当减少洗脱体积可以适当减少洗脱体积可以适当减少洗脱体积，但是最但是最但是最但是最小体积最好不少于小体积最好不少于小体积最好不少于小体积最好不少于 30l，体积过小降低体积过小降低体积过小降低体积过小降低 RNA 洗脱效率洗脱效率洗脱效率洗脱效率，减少减少减少减少 RNA 产量产量产量产量。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 11 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 BOX2：cDNA第一链合成第一链合成第一链合成第一链合成 1按以下组分配制反转录反应液 Total RNA or Poly(A)RNA 0.2-2g Oligo(dT)(50M)1l dNTP Mixture(10mM each)1l RNase-free dH2O Up to 14l 2.在PCR仪上进行以下反应:65C,5min,然后置于冰上急冷。3.在上述PCR管中加入以下反转录反应液：上述变性、退火后反应液 14l 5First-strand Buffer 4l M-MLV Reverse Transcriptase(200U/l)1l RNase Inhibitor(40U/l)1l Total 20l 4.在PCR仪上按以下条件进行反转录反应:30C 10min 42C 30-60min 6.cDNA 立刻进行实验或者 4 度（-20 度）保存。BOX3：两步法两步法两步法两步法 real-time qPCR 体系体系体系体系配制配制配制配制 组成成分 20 l 体系 25 l 体系 50 l 体系 终浓度 2 Premixture 10 l 12.5 l 25 l 1 上游 Primer 100-400nm 下游 Primer 100-400nm 模板 pg-ng 灭菌蒸馏水 Total 至 20 l 至 25 l 至 50 l 扩增扩增扩增扩增程序程序程序程序 循环数 Step 温度 时间 检测 说明 1 1 95 2 min off 起始模板变性 35-45 1 95 15 sec off 模板变性 2 60-68 20-60 sec on 退火/延伸 溶解程序溶解程序溶解程序溶解程序 循环数 Step 温度 时间 检测 1 End 55-65 10-20sec On End 95 10-20sec Off Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 12 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 说到反应体系的配制，不得不说到参比或者校正染料（reference dye，passive dye）。常用的是 ROXTM（现在已经是 ABI 的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测 PCR 产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把 ROXTM配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROXTM染料校正。比如Bio-RAD 的 系 列 仪 器 就 不 需 要。百 泰 克real-time qPCR系 列 产 品（http:/ PCR 仪，体系配制和反应程序如 BOX3.通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要想常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断 PCR 产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。3.仪器设置仪器设置仪器设置仪器设置 所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne 为例，详细看一下反应设置：A首先是实验目的选首先是实验目的选首先是实验目的选首先是实验目的选择择择择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B.实验方法的选择实验方法的选择实验方法的选择实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 13 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 C.目的基因的设置目的基因的设置目的基因的设置目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D.样品的设置样品的设置样品的设置样品的设置:包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E.对照组和内参基因的设置对照组和内参基因的设置对照组和内参基因的设置对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备的。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 14 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 F.反应程序的设置反应程序的设置反应程序的设置反应程序的设置：PCR 反应程序的设置要根据不同公司的 MasterMix。比如BioTeke 的 95 2分钟就可以激活 DNA 聚合酶（ABI 的需要 10 分钟）。循环反应是 9515秒，6015秒的 40 个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G.反应体系的设置反应体系的设置反应体系的设置反应体系的设置：Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 15 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 A-G 这五个步骤这五个步骤这五个步骤这五个步骤简单设置好简单设置好简单设置好简单设置好，可以保存可以保存可以保存可以保存，修改修改修改修改反应程序反应程序反应程序反应程序或者立刻进行反应或者立刻进行反应或者立刻进行反应或者立刻进行反应。需要注意一点需要注意一点需要注意一点需要注意一点 ABI 仪器的需要加仪器的需要加仪器的需要加仪器的需要加 ROX 参比染料的参比染料的参比染料的参比染料的，默认默认默认默认的是的是的是的是 ROX。有些有些有些有些公司是把公司是把公司是把公司是把 ROX 或者其他染料配制在或者其他染料配制在或者其他染料配制在或者其他染料配制在 MasteMix 里面里面里面里面；也有的是单独分开也有的是单独分开也有的是单独分开也有的是单独分开。要根要根要根要根据不同公司的据不同公司的据不同公司的据不同公司的 MasterMix 进行这一个步骤的选择进行这一个步骤的选择进行这一个步骤的选择进行这一个步骤的选择。BioTeke 的的的的 MasterMix 里没里没里没里没有参比染料有参比染料有参比染料有参比染料，所以选择所以选择所以选择所以选择“none”。设置好之后设置好之后设置好之后设置好之后，就可以把配置好的就可以把配置好的就可以把配置好的就可以把配置好的 PCR 管放进仪器管放进仪器管放进仪器管放进仪器，点击点击点击点击 RUN！Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 16 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852 五五五五、Real-time qPCR 数据分析数据分析数据分析数据分析 1.Real-time qPCR 常见参数常见参数常见参数常见参数?基线基线基线基线（baseline）通常是 315 个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线?阈值阈值阈值阈值（threshold)自动设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。?Ct 值值值值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取 Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。?Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。?Rn：Rn是 Rn 扣除基线后得到的标准化结果（Rn=Rn 基线）。2.影响影响影响影响 Ct 值的关键因素值的关键因素值的关键因素值的关键因素?模板浓度模板浓度模板浓度模板浓度 模板浓度是决定 Ct 的最主要因素。控制在一个合适范围内，使 Ct 在 15-35之间。?反应液成分的影响反应液成分的影响反应液成分的影响反应液成分的影响 任何分子的荧光发射都受环境因素影响-比如溶液的 pH 值和盐浓度。?PCRPCRPCRPCR 反应的效率反应的效率反应的效率反应的效率 PCR 反应的效率也会影响 CT 值。在 PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与 PCR 扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR 效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在 90-110%之间都是可以接受的。3.如何评估实时定量如何评估实时定量如何评估实时定量如何评估实时定量 PCR 反应的效果反应的效果反应的效果反应的效果?PCR 扩增效率扩增效率扩增效率扩增效率：为了正确地评估 PCR 扩增效率，至少需要做 3 次平行重复，至少做 5 个数量级倍数(5 logs)连续梯度稀释模板浓度。?R2值值值值：另一个评估 PCR 效率的关键参数是相关系数 R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果 R2 等于 1，那么你可以用 Y 值（Ct）来准确预测 X 值（量）。如果 R2 等于 0，你就不能通过 Y 值来预测 X 值。R2值大于 0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。Real-time qPCR 手册手册手册手册-手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手 17 北京百泰克生物技术有限公司 E-mail: Tel:[phone] 62979408 82783852?精确度精确度精确度精确度:标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果 PCR 反应效率是 100%，那么 2 倍稀释点之间的平均 Ct 间隔应该恰为 1 个 Ct 值。要以 99.7%的几率分辨 2 倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于 0.167。标准偏差越大，分辨 2倍稀释的能力就越低。为了能够在 95%以上的情况下分辨出 2 倍稀释，标准偏差必须小于等于 0.250。?灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度：无论 CT 绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约 37%不含有拷贝，仅有约 37%含有 1 个拷贝，约 18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。评价荧光评价荧光评价荧光评价荧光 PCR 结果的标准结果的标准结果的标准结果的标准 因素因素因素因素 建议建议建议建议 指标指标指标指标 效率 5 个数量级梯度稀释 Slope -3.3 R2 0.99 精密度 至少 3 个重复 标准差 38）?扩增效率低:反应条件不够