反相高效液相色谱的基本原理及其应用.pdf

万初筒者麟摺色麟恢参颇秘级真应屠韶卒著娜反相高效液相色谱的基本原理及其应用刘桂洋,毛香菊,陈晋阳上海大学化境与化学工程学院,上海武汉大学 化学与分子科学学院,湖北武汉摘要高效液相色谱经过年的发展,在色谱理论研究、仪器研究水平、分析实践应用等方面,已经取得长足的进步本文主要介绍了反相高效液相色谱的基本原理和特点,以及影响因素,并对其在生物化学和生物工程中的应用,在环境监测中的应用,在精细有机合成中的应用进行了举例关键词反相高效液相色谱保留值液相色谱的应用中圈分类法十文献标识码前言更广泛。反相高效液相色谱简介随着高效液相色谱的快速发展,各种新的色谱技术不断涌现。其中,反相高效液相色谱因其良好的选择性,应用的范围不断扩大,显示出很好的应用前景卜。反相高效液相色谱是化学键合相色谱法的一种。化学键合相色谱法是由液液色谱法发展起来的,是为了解决在分离过程中,机械吸附在载体上的固体液的流失问题而发展出来的一种新方法。键合相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成化学键合固定相,化学键合固定相对各种极性溶剂都有良好的化学稳定性和热稳定性。由它制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作,消除了分配色谱法的缺点。根据键合固定相和流动相相对极性的强弱,可将键合色谱法分为正相键合色谱法和反相键合色谱法反相键合色谱法即反相高效液相色谱在正相键合色谱法中,键合固定相的极性大于流动相的极性,适用于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物在反相键合相色谱法中,键合固定相的极性小于流动相的极性适用于分离非极性、极性或离子型化合物,其应用范围也比正相键合相色谱法反相键合相色谱法的分离原理闪”在反相键合相色谱法中使用的是非极性键合固定相。它是将全多孔或薄壳微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链、或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相。如共价结合到载体上的直链碳氢化合物正辛基等。关于反相色谱的分离机理,吸附色谱的作用机制认为溶质在固定相上的保留主要是疏水作用,在高效液相色谱中又被称为疏溶剂作用。根据疏溶剂理论,当溶质分子进入极性流动相后,即占据流动相中相应的空间,而排挤一部分溶剂分子。当溶质分子被流动相推动与固定相接触时,溶质分子的非极性部分或非极性因子会将非极性固定相上附着的溶剂膜排挤开,而直接与非极性固定相上的烷基官能团相结合吸附形成缔合络合物,构成单分子吸附层。这种疏溶剂的吸附作用是可逆的,当流动相极性减少时,这种疏溶剂斥力卜降,会发生解缔,并将溶质分子解放而被洗脱下来。上述疏溶剂作用机制可如图所示。反相色谱中疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去,在色谱柱中滞留时间也长,所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分离。反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的宁淤必刃从铭为口幽勺韶字男娜化合物,亦即非极性基团的化合物。此外,反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流动相的溶剂及其组成和,以影响溶质分子与流动相的相互作用,改变它们的滞留行为。另外,反相色谱中水的流动相中占的比例伸缩性很大,可以从一,从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和烷烃,其链的长短不同,最 长的是十八烷基,这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳氢链的长度而增加,在反相色谱柱中溶质由于疏溶的有机溶剂,以得到不同强度的流动相,这些有机溶剂称为修饰剂。反相色谱中最常用的有机溶剂有甲醇和乙睛,此外,乙醇、四氢吠喃、异丙醇及二氧六环也常被用作修饰剂。图反相色谱中固定相表面上溶质分子与烷基键合相之间的缔合作用注实心箭头表示缔合物的形成空心箭头表示缔合物的解缔为溶剂膜为非极性烷基键合相为溶质分子的极性官能团部分为溶质分子的非极性部分。影响溶质保留值的三个因素烷基键合固定相对每种溶质分子缔合作用和解缔作用能力之差,就决定了溶质分子在色谱过程的保留值。以下简述影响溶质保留值的二个因素溶质分子结构在反相键合相色谱法中,溶质的分离是以它们的疏水结构差异为依据的,溶质的极性越弱,疏水性也强,保留值越大。根据疏溶剂理论,溶质的保留值与其分子中非极性部分的总表面积有关,其与烷基键合固定相结出的面积愈人,保留值越人。烷基键合固定相的特性烷基键合固定相的作用在于提供非极性作用表面,因此键合到硅胶表面的烷基数量就决定着溶质容量因子的大小。烷基的疏水特性随碳链的加长而增加,溶质的保留值也随着烷基碳链长度的增加而增人。随着烷基碳链的增长,增加了键合相的非极性作用的表面积,其不仅影响溶质的保留值,还影响色谱柱的选择性,即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。流动相性质流动相的表面张力愈大,介电常数愈大,其极性越强,此时溶质与烷基键合相得缔合能力越强,流动相的洗脱强度弱,导致溶质的保留值越大。水作用而滞留的时间也将随着碳氢链的长度而增加。在一般情况下这意味着用碳氢链长的反相色谱柱能得到较好的分辨率,在多数情况下是依靠反复试验选择色谱柱。由于反相色谱法的固定相是疏水的碳氢化合物,溶质与固定相之间的作用土要是非极性相互作用,或者说疏水相互作用,因此溶剂的强度随着极性降低而增加。水是极性最强的溶剂,也是反相色谱中最弱的溶剂。在反相色谱中常常用作基础溶剂,向其中加入不同浓度的、可以与水混应用举例随着技术的不断改进,反相高效液相色谱法获得日益广泛的应用,在高效液相色谱法中也占有重要的地位,一 一。自冬梅等人提出了一种利用反相高效液相色谱法分析米根霉乳酸发酵液中有机酸的方法【。应用反相认值一色谱柱,以磷酸作为流动相,发酵液经稀硫酸预处理后直接进样分离定量,在内把其中的乳酸、苹果酸、富马酸等完全分离定量,各种酸回收率大于分舫砧丁一反初筋对展郝庄禅必纂举妒理麦少 不达交厉卒男雳。其实验结果证明,该方法能将米根霉乳酸发酵液中乳酸、苹果酸和富马酸完全分离并准确定量。本方法具有前处理简单、干扰小、灵敏度高、分析速度快等优点,对于及时测定乳酸发酵过程的变化具有重要意义,是测定乳酸发酵液中各有机酸的快速、有效的定量测定方法。使性质差别较大的维生素都能得到良好分离,使用价格便宜的甲醇一水为流动相,通过改变值等色谱条件,短时间内实现了上述种维生素的分离。该法操作简便、迅速、可靠、测试费用低。在环境分析中,带硝基的有机化合物被泛地用于制造火药,这类化合物的大量使用对环境造成严重的污染。虽然气相色谱法中常用的各类选择性检测器对于这类化合物的检测有很好的选择性及很高的灵敏度,但由于这类化合物的热不稳定性给定量测定带来困难,因此常选用液相色谱法分离检测。等人发展出不六氢一,二硝基一】,一三嚓及其重要衍生物的二极管阵列分离测定方法,这一方法不仅可以对这些化合物定量,而且可以对被测定的化合物提供定性信息】。图是和及其衍生物的典型分离色谱图。图标准有机酸混合液在不同流动相条件下的分离色谱图注表示流动相为让几的比表示流动相为刀的表示 流 动相 为。刀的表示流动相为的。为草酸为苹果酸为乳酸为乙酸为柠檬酸为富马酸。目前,获得紫杉醇比较可行的方法是从红豆杉中进行提取分离,但由于红豆杉中紫杉醇的含量很低,并且存在很多与紫杉醇结构和性质非常接近的紫杉烷伴生物,如二尖杉碱,这种结构上的细微差别使得紫杉醇和三尖杉宁碱的分离十分困难。锥丽娜等人采用正相色谱和反相色谱法相结合的方法,在反相色谱中使用了一种新颖的高分子填料,成功分离提纯了紫杉醇和二尖杉宁碱,纯度达到以上,克服了传统方法的缺点】。李来生等人采用反相色谱法同时测定食品中水溶性维生素、,、和,的含量,采用一,一柱,比甲酸馁一甲酸溶液,含二 乙,胺甲醇为流动 相,流速,内实现了良好分离,乙酞苯胺为内标物。苹果及强化奶粉中维生素平均回收率分别为协和叹户,此试验采用选择性较高的固定相,作用力适中,图和及其衍生物的反相色谱分离图高如瑜等人介绍了用反相液相色谱法定量分析三苯基磷。采用反相液相法,使用化学键合硅胶柱,用乙睛溶解样品,用以上甲醇,水为流动相,流速为,紫外检测器,波长一一分对愁万宁淤众如妙卒男卿,得到了峰形对称,重现性好的分离图。我们将此方法用二苯基磷生产的二艺条件选择和生产质量的定量测定,得到满意的结果。本方法适用于业二苯基磷产品的定量分析。由于手性化合物的物理、化学性质相同,实现它们的分离就比较困难,如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体,但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物,即外消旋体。对于手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效,而另一种对映体却无药效,因此对手性药物对映体的拆分也是高效液相色谱分析的热点。等人通过改变色谱柱的固定相,在色谱柱内装填由林硅胶作基体的手性固定相,群殴独特的选择性使得右旋体和左旋体得以分离。图为使用亲和色谱手性固定相分离一肾上腺素受体阻断药心得安对映体的分析图谱。泛应用,相信会有更好应用前景。参考文献【于世林著 高效液相色谱方法及应用 北京化学工业出版社,一【幻【美 斯奈德,柯克兰”著 高潮等译现在液相色谱法导论北京化学工业出版社,一巧展望通过以上例子,可以看出反相高效液相色谱法通过将不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶载体表面的游离经基上,而生成不同极性的化学键合固定相,从而使这种方法的选择性得到提高且具有针对性。反相高效液相色谱所具有的柱效高、使用寿命长、重现性好,几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性,并可用于梯度洗脱操作的优点,使得在生物化学与工程,医药研究,食品分析,环境污染和精细化等领域都得到了广【美著 李玲颖等著现代液相色谱】天津南开大学出版社,一【王俊德,商振华,郁蕴露编著高效液相色谱法北京中国石化出版社,一【达世禄编著 色谱学导论【】武汉武汉大学出版社,【金恒亮编 高压液相色谱法北京原子能出版社,一【朱彭龄、云自厚、谢光华编著现代液相色谱时兰州兰州大学出版社,一一【英辛普森主编 许征帆译,实用高效液相色谱法北京中国建筑丁业出版社,一【下俊德,商振华,郁蕴露编著 高效液相色潜法 北京中国石化出版社,下【俞淮乐等编译 高效液相色谱固定相北京科学出版社,一梦四,幻孔祥虹,李建华反相高效液相色谱法测定果汁中的有机酸理化检验一化学分册,一【彭霞,胡晓燕 离子对反相色谱法同时测定钢铁及合金中错和铅冶金分析【,一【白冬梅,赵学明,胡宗定应用反相高效液相色谱法测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸工业微生物,一【摊丽娜等正相色谱和反相色谱法分离提纯东北红豆杉中紫杉醇和三尖杉宁碱分析化学学报,一下转第页分护必工一朦,窟卒男 辉涂料涂覆标记等五项标准已于月份报批由国家安全生产监督管理总局提出的一项标准制订项目油漆与粉刷作业安全规程安监总政法号通知送审稿,四项标准修订项目涂装作业安全规程术语一一、涂装作业安全规程粉末静电喷涂工艺安全一一、涂装作业安全规程涂漆工艺安全及其通风净化一守、涂料涂覆标记一一经本分标委会组织会议审查通过。根据审杏会议要求,经修改完成报批稿,己年月日将报批稿及有关材料上报给全国安全生产标准化技术委员会。雨涂报甘标准化工作科学发展座谈会在京召开月日国家标准委在京召开标准化作科学发展座谈会。国家质检总局党组成员、国家标准委土任纪正昆在座谈会上指出要牢固树立个观念一是要牢固树立服务观念,明确标准化作的指导思想和定位,倡导“三个服务”即标准化工作必须服务于经济建设、服务于社会需求、服务于科学发展二是要牢固树立科学的观念,解决工作方式方法的问题,在作中要坚持科学、客观、公正、协调的原则二是牢固树立法制观念。纪正昆提出,当前要抓好件大事一是制定好国家技术标准战略发展纲要,作为今后全国标准化作科学发展的纲领和方向二是进一步健全和完善国家标准体系,形成系统完善、重点突出、层次分明、相互衔接、适应国家经济建设和社会发展需要的国家标准体系三是尽快修改出台新的标准化法,拓展法的调整范围,更好地对标准的制定、实施和监督实行法制管理。陈俊玲几转第页【李来生,张江华反相高效液相色谱法测定食品中水溶性维生素的含 量分析测试学报,靳东月反相色谱在环境分析中的应用,中山大学学报论从,场【高如瑜,祝凌燕,反相液相色谱分析三苯幕磷精细石油化工,一一,一一一,一,一,一一一分淤常