高效液相色谱法的应用.pdf

发 酵 科 技 通 讯第3 5卷第4期2 0 0 6年1 0月近几年来,高效液相色谱法得到了实用化,发展极为迅速,无论是以分析为目的(如混合物的分离、定性、定量等)还是在以提取为目的(如分离、精制等)各个方面,其利用率都得到了显著的增加。高效液相色谱是一种色谱法,主要用于多成份混合物系统的分离,这种方法使以往的柱色谱达到了高速化。分离性能高,应用性广,较其他一些色谱法具有很多优越性,具有快速方便、灵敏度高、选择性好,可同时分析多种离子化合物。高效液相色谱是用液体作流动相,通过耐压定量泵来输送液体,让可溶于流动相的混合物通过充填有高分离能力的填充的交换柱,从而达到能迅速分离洗脱的目的。另外,从柱上洗脱下来的各种成分主要用光学检测器进行测定,同时可借助于记录仪自动记录洗脱状态的变化。为了适应国际国内市场的需求,我们运用液相色谱快速准确、选择性好的特点,对谷朊粉深加工产品进行研究,不断开发新产品,如对谷朊粉的水解液进行液相色谱测定,发现其中蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等含量较高,可作为食品添加剂进行新产品开发。1氨基酸的具体测定方法1.1测定原理本方法使用衍生剂为6氨基喹啉N(羟基琥珀酰亚胺基)氨基甲酸酯(A Q C),在p H 8 1 0的条件下,可用于各种氨基酸定量反应生成单一产物。该衍生物有很强的紫外吸收,又可被激发发出荧光,因此,可以用紫外检测器检测 m a x=2 4 8 n m,也可用荧光检测器检测,激发波长 E x=2 5 0 n m,发射波长 E m=3 9 5 n m。1.2仪器与试剂1.2.1仪器高效液相色谱仪二元泵紫外可变波长检测器 柱温箱 氨基酸分析柱手动进样器 色谱工作站1.2.2化学试剂及配置1.2.2.1氨基酸标样(2.5 m o L/m L)1.2.2.2A c c Q T a g氨基酸衍生试剂1.2.2.3 E D T A2 N a溶液:称取1 0 0 m g E D T A2 N a溶解于1 0 0 m L纯水中。1.2.2.4稀磷酸溶液:磷酸水=1 11.2.2.5流动相A:称取N a A c3 H2O1 9.0 4 g(或无水N a A c 1 1.4 8 g)溶解于1 0 0 0 m L纯水中,用1 1的稀磷酸溶液调节p H到约5.2,加l m LE D T A2 N a溶液,精确加入三乙胺2.3 7 m L或称取1.7 2 g,边加边搅拌,用稀磷酸调节p H:紫外检测p H=4.9 5;荧光检测p H=5.0 2,用0.4 5 m滤膜过滤,备用(可加0.1 N a N3/1 0 0 m L防止长菌)。使用前超声波脱气2 0 m i n。1.2.2.6流动相B:乙腈:水=3:2,再加0.1 0.2 5 m L丙酮/1 0 0 0 m L,(调整基线),混匀。使用前超声波脱气2 0 m i n。1.3操作步骤1.3.1衍生试剂准备:氨基酸试剂盒有5组试剂,每组包括3个试剂瓶,1#瓶为p H=8.8硼酸盐缓冲液,2 A瓶为衍生剂(A Q C)粉末,2 B瓶为乙腈溶液。临用前,吸1 m L乙腈移入2 A瓶中(事前将瓶振荡,使得粉末完全置于瓶底),盖紧盖子,摇1 0 s,放入5 5 的恒温箱加热使粉末完全溶解(不得超过1 0 m i n)。1.3.2氨基酸标样与样品的衍生高效液相色谱法的应用张顺堂(河南莲花味精集团 项城4 6 6 2 0 0)摘要:本文阐述了高效液相色谱法的简要特点及在谷朊粉深度开发中的应用,用于谷朊粉水解液各种氨基酸的检测,借以及时掌握谷朊粉深加工产品的质量,用于指导生产。关键词:高效液相色谱法 氨基酸 检测5发 酵 科 技 通 讯第3 5卷1.3.2.1氨基酸标样的衍生取氨基酸标样储备液(2.5 m o l/m l),临用时用 纯 水(1 2 5)稀 释 成 氨 基 酸 标 样 工 作 液1 0 0 p m o L/L。用微量注射 器精确吸取1 0 L工作液,加入微量内衬管小瓶底部,用另一根微量注射器精确吸取p H 8.8的硼酸盐缓冲液7 0 L,加入小瓶中,在旋涡振荡器上混合后,再用一根微量注射器精确吸取A Q C溶液2 0 L,将小瓶放在旋涡振荡器上边震荡混合边加入A Q C溶液,用封口胶带将瓶口封好,放到5 5 恒温箱内保温5 1 0 m i n,取出放置至室温,待H P L C系统稳定后上机分析。1.3.2.2样品的衍生取待测样品,使氨基酸的总浓度为1 0 n m o l,用微量注射器精取1 0 L,其余操作方法同标准工作液。1.3.2.3色谱条件见表1氨基酸分析柱或C 1 8柱:检测波长:2 4 8 n m柱温:3 7 进样量:1 0 L1.4测定结果样品来源于谷朊粉水解实验,其测定结果见表2。2结果与讨论2.1快速、方便该方法的衍生反应应是在瞬间定量完成,过量的衍生试剂不稳定,对分析没有影响,样品处理方法简单,生成的衍生物稳定性好(室温下放置一周)。2.2检测灵敏度高用紫外检测器,检测灵敏度可达P m o l级,最低可达0.2 0.3 P m o l,而且,所有的氨基酸均能检出。2.3方法重现性较好,应用范围广R S D一般可达4%2%,分析周期约3 7 m i n,适合于饲料、农产品等水解液中氨基酸,以及氨基酸输液等复方制剂中氨基酸的测定。2.4衍生试剂的保存A Q C试剂配好后,应封口置干燥器中保存,该试剂与水会发生反应,一份H2O要消耗两份A Q C,而且形成的化合物在乙晴中溶解度小,加热也不溶解。一般配好后,衍生剂在一个月内是稳定的。2.5流动相A的p H值流动相A的p H对测定结果影响较大,尤其对A s p、S e r、G l u、G l y、H i s这五个氨基酸的影响较大,微小的p H变化,对这五个氨基酸的分离有较明显的影响,尤其是G l u、G l y、H i s,因此,要求p H值精确到小数点第二位。2.6样品应衍生充分样品及标准品衍生好后,将小试管放在5 5 恒温箱中加热5 1 0 m i n,目的是让酪氨酸衍生安全。综上所述,液相色谱法的检测技术,在谷朊粉深度开发应用方面相当广泛,可以指导生产,对提高新产品的质量、降低生产成本都具有重要的意义。随着高科技的发展,我们相信液相色谱法在谷朊粉深加工生产中将得到更大的发展。时间(m i n)流速(m l/m i n)01 51.211 71.0241.031 11.0421.0511.0621.0A(%)1 0 09 39 06 66 600B(%)071 03 43 41 0 01 0 0水解液1#水解液2#天门冬氨酸未检出5.2 2丝氨酸1 2.5 0未检出谷氨酸2 9.3 55.5 0甘氨酸2.9 25.2 9组氨酸5.0 31 6.2 2精氨酸4.8 05.9 3水解液3#2.8 61.3 03.3 06 1.4 30.4 00.8 8水解液4#未检出未检出1.8 7未检出8.4 34.1 7苏氨酸1.6 01.4 10.1 84.5 9丙氨酸1.0 22.0 9未检出未检出脯氨酸1 3.1 75.5 31.1 06.3 1胱氨酸1 3.5 17.7 73.6 0未检出酪氨酸3 5.4 0未检出2.0 36.5 2缬氨酸1 9.1 82 1.7 51 5.8 82 3.8 8蛋氨酸2 3.8 62 5.6 22 7.2 12 3.0 0赖氨酸8.2 71.8 70.1 93.0 9异亮氨酸7 5.9 47 2.9 86 4.1 86 3.0 1亮氨酸3 7.9 03 2.9 03 4.1 93 1.8 4苯丙氨酸1 9.5 26.2 50.7 00.8 7测定结果(m g/1 0 0 m L)样品编号表2谷朊粉水解液测定结果表1流动相A:流动相B梯度表6