鱼精蛋白的研究样本.doc

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鱼精蛋白研究及发展前景
摘要: 鱼精蛋白是存在于各类动物精巢组织中的一种多聚阳离子肽, 具有高效、 安全、 功能性
等特点, 是值得开发的一种新型天然食品防腐剂。对鱼精蛋白的来源、 组成及提取工艺、 抗菌特
性、 缺陷、 毒性和存在的问题及展望等方面进行了简述。
关键词: 鱼精蛋白 防腐剂 毒性 缺陷 前景
当前食品工业中大量使用的防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、 山梨酸及其钠盐、 对羟基苯甲酸酯等等。尽管以上几种化学防腐剂具有不同的杀菌能力, 但同时也具有不同的程度的安全问题。当前消费者越来越倾向于天然无毒食品, 因而从各种动植物中寻找、 提取安全无毒的防腐剂便成了食品添加剂行业最大的热点。在此背景下, 以海产鱼类精巢为原料分离得到的具有广谱抗菌作用的鱼精蛋白, 作为一种天然的食品防腐剂, 越来越成为各国食品行业的关注的焦点。
鱼精蛋白是一种天然抗菌物质, 属于多聚阳离子天然肽类, 自1937年Mc Clean 等报道了鱼精蛋白具有抑菌活性以来, 作为化学行业的替代品便开始在食品行业崭露头角。当前, 鱼精蛋白在食品工业中的应用越来越广泛, 与化学合成防腐剂相比, 具有安全性高、 防腐性好、 热稳定等优点, 而且, 鱼精蛋白还具有很高的营养性与功能性, 例如能降血压、 助呼吸、 促消化、 抑肿瘤、 抗血栓、 强化肝功能、 抑制血液凝固等。
1鱼精蛋白的来源、 组成及提取、 纯化
( 1) 鱼精蛋白的来源和组成
鱼精蛋白又称精蛋白, 是一种碱性蛋白质, 以所谓的鱼精核蛋白的形式存在, 是一种小且简单的球形碱性蛋白质, 分子量小, 一般在一万以下, 一般是由三十个氨基酸组成。当前, 已从许多的鱼类( 鲑鱼、 鲱鱼、 红鳟鱼等) 和哺乳动物类( 如老鼠、 人、 公野猪等) 的成熟精巢中提取出鱼精蛋白。按氨基酸的组成和数量的不同可将其分为三种: ①单鱼精蛋白, 碱性氨基酸只含精氨酸一种; ②双鱼精蛋白, 碱性氨基酸除精氨酸外, 还含有组氨酸或赖氨酸;
③三鱼精蛋白, 碱性氨基酸含有精氨酸、 组氨酸、 赖氨酸三种; 事实上鱼精蛋白的成分不是单一成分, 而是由数种非常类似的成分组成的混合物。
( 2) 鱼精蛋白的提取和纯化
从研究报道的资料来看, 各个国家对鱼精蛋白的研究主要以鲑鱼为研究对象。俄罗斯主要以大马哈鱼和细鳞大马哈鱼精巢为原料。日本以鲣、 鲑、 青鱼为原料。中国鲑科鱼类的产量比较少, 因此以鲑科鱼类的精巢为研究对象有一定困难。从1958年开始, 上海和青岛等地的水产品部门曾经多次从青鱼精巢中提取出鱼精蛋白。1999年, 吴燕燕等成功地从鲅鱼、 罗非鱼等淡水鱼的精巢中提取出鱼精蛋白; 谢俊杰等从鲢鱼精巢中提取出了鱼精蛋白, 且对具有抑菌性的鱼精蛋白进行了纯化和鉴定。
以往鱼精蛋白的提取条件浓硫酸或浓盐酸为提取剂, 柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。近几年来, 经过学者们的不懈研究终于对传统的工艺做出了简化和改进。如将鱼精巢经稀硫酸处理提取粗鱼精蛋白, 再用甲醇或乙醇等有机溶剂沉淀。干燥后溶于温水, 利用冷却的方法析出鱼精蛋白; 或者用浓硫酸或盐酸抽提后经过聚磷酸盐沉淀鱼精蛋白, 而后溶于高浓度的硫酸铵中, 复分解为鱼精蛋白和硫酸盐。在国内, 谢俊杰等利用Nacl沉淀、 硫酸酸解和三氯乙酸沉淀三步操作提取出鲢鱼鱼精蛋白; 徐明生等人也是用Nacl沉淀, 硫酸提取, 可是是采用冷乙醇沉淀和丙酮乙醚洗涤蛋白质的方法。
上述方法所得到的为鱼精蛋白的粗品杂质一般是一些杂蛋白或核酸, 有必要进行进一步的分离纯化。一般采用sephadex葡萄糖凝胶层析; 离子交换等技术进行分离纯化, 然后经过反相高效液相色谱( RP-HPLC) 和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鱼精蛋白纯度及组分的鉴定。当然, 也能够用制备型高效液相色谱进一步蛋白, 再经过等电聚焦电泳、 质谱等测定蛋白质的等电点和分子量。
2鱼精蛋白的防腐性能及抗菌机理
Antohi和popescu等在1979年对鱼精蛋白的抑菌机理做出了探讨, 提出鱼精蛋白的抑菌性是它和微生物的细胞壁相互作用引起的这一假说。Mishara等研究鱼精蛋白的抑菌性时发现鱼精蛋白的加入会马上抑制抑制微生物氧和葡萄糖的消耗, 并由此认为: 鱼精蛋白的抑菌活性可能是它吸附在微生物的表面根据鱼精蛋白作用于微生物细胞的部位不同, 大致可 /10/23认为存在两种可能机理: ( 1) 、 鱼精蛋白作用于微生物细胞壁, 破坏了细胞壁的合成以达到其抑菌效果; ( 2) 鱼精蛋白作用于微生物细胞质膜, 经过破坏细胞的营养物质的吸收来起抑菌作用。
( 1) 作用于微生物细胞壁
这种机理认为: 鱼精蛋白主要是以分子中多聚精氨酸或多聚精氨酸与其它少数几个氨基酸以某种结构或形式和微生物细胞壁结合, 从而破坏了细胞壁的形成, 以达到其抑菌效果。很显然, 微生物的形态是经过细胞壁来维持的, 一旦细胞壁受到破坏, 其形态必定受到影响。Boman 在1993 年就提出鱼精蛋白对细胞的形态有影响, 她们实验发现经鱼精蛋白处理过的细胞, 过一段时间后形状呈肿胀态。
( 2) 作用于微生物细胞质膜
细胞质膜是微生物功能单位和重要的组成部位, 它不可是一层渗透性的屏障, 控制着细菌细胞内外物质的交流, 而且是一个代谢体系, 微生物的许多重要过程( 如物质的运输、 物质的合成等) 都与细胞质膜有关, 如果细胞质膜遭到破坏, 细胞将死亡。Arden 等认为, 微生物细胞质膜是鱼精蛋白作用的对象, 鱼精蛋白经过影响细胞质膜的功能来达到其抑菌效果的。
①对细胞物质吸收的影响选择性地吸收营养物质是微生物细胞质膜的重要功能之一。 Kashket 和Berger 等研究发现, 经鱼精蛋白处理的杆菌, 其脯氨酸含量比没有经处理的杆菌中的脯氨酸含量低, 这表明经鱼精蛋白处理的杆菌在吸收和积累脯氨酸的能力方面明显受到了抑制。进一步研究认为, 鱼精蛋白是经过影响微生物细胞质膜来影响它对脯氨酸的吸收。
②对细胞蛋白质合成的影响蛋白质的合成在核糖体内, 氨基酸等物质被细胞膜吸收后运输到核糖体内并进行蛋白质的合成。实验发现, 加入鱼精蛋白之后, 在很短的时间内微生物积
累氨基酸的能力便停止, 但合成蛋白质的功能却没有停止, 而是继续进行直到消耗完所积累的氨基酸等物质。这表明, 鱼精蛋白并不影响核糖体上蛋白质的合成过程, 而是作用于微生物细胞质膜从而阻断合成蛋白质的”原料”来阻止细胞蛋白质合成的。
③对细胞质膜通透性的影响
许多带正电荷小肽和Nisin(乳酸链球菌素)等的杀菌机理是在细胞膜上形成电势依赖通道, 然后导致细胞内新陈代谢物质的溢流从而使细胞死亡。然而, 并不是所有的肽都能够经过这种改变膜的通透性的方式来杀菌作用的, 从氨基酸和分子组成上看, 鱼精蛋白2/3 以上是由精氨酸组成, 其中绝大部分是阳离子, 整体并不具备两亲性质, 因而无法插入细胞膜中形成膜通道。
3.鱼精蛋白防腐的应用
从鱼类精巢中提取的鱼精蛋白硫酸盐已用于制药行业多年, 如: 用作胰岛素的载体和注射胰岛素的缓释剂已有五十多年的历史 。 鱼精蛋白对肝磷脂具有特异的亲合性, 已用作肝磷脂的解毒剂。眼下, 食品安全事故层出不穷, 老百姓更是谈”剂”色变,这也就导致了食品行业着眼于使用天然防腐剂来代替化学防腐剂倾向避免使用化学防腐剂。鱼精蛋白用作食品防腐剂主要有以下优点:①, 不但能抑制革兰氏阳性菌( 如枯草杆菌、 巨大芽孢杆菌、 地衣型芽孢杆菌、 凝固芽孢杆菌、 胚芽乳杆菌、 干酪乳杆菌等) 、 革兰氏阴性菌(可是对革兰氏阴性菌作用不显著),同时还能抑制酵母菌和霉菌;② 作为一种天然产物, 具有很高的安全性, 且无臭、 无味; 而且是精氨酸丰富的蛋白质, 具有很高的营养性; ③能够耐热, 经高压灭菌而不丧失抑菌活性 , 使其能够与食品热处理并用, 提高加工食品的保存性;④ 在中性和碱性介质中显示出了很强的抑菌能力, 抑菌范围和防腐范围均较广⑤食品中主要营养成分, 如蛋白质、 脂肪、 糖类对鱼精蛋白抑菌活性影响较小, 这有利于其在食品中的应用。鱼精蛋白在抑菌方面的众多优势使其成为一个非常有前景的化学防腐剂的替代品。据何华报道,在奶牛、 鸡蛋、 布丁中添加0. 05 %～0. 1 %的鱼精蛋白,能在15 ℃ 的温度下保存5～6 d ;可是不添加鱼精蛋白的食品,在保存到第4 d 就开始腐败变质 。李来好等在研究鱼精蛋白对延长鱼糕制品的保存期时发现,随着鱼精蛋白添加量的递增,鱼糕的保存期也相应延长。当鱼精蛋白的添加量达1 %时,鱼糕的保存期便趋向稳定,12 ℃和24 ℃的有效保存期分别为8 d 和6 d ,当鱼精蛋白的添加量低于0. 4 %时,在12 ℃或24 ℃条件下,鱼糕的保存期相同,有效保存期为2 d。早在80 年代,日本便已经开始将鱼精蛋白应用于食品保藏中了,当前市场发展很快。日本一些公司如上野制药公司已经把鱼精蛋白作为天然食品保鲜剂和医药品原料,制成各种制品且已经成功上市了。这些制品有CC - 50、 SN - 701、 派卡利恩等。在这些制品中主要的复配成分为甘氨酸、 醋酸钠、 柠檬酸、 焦磷酸钠、 丙氨酸、 富马酸等 。可是想把鱼精蛋白用作食品防腐剂广泛使用也存在一些问题, 如它在中性和碱性介质中抑菌活性良好, 但在酸性介质中抑菌效果较差, 影响其在酸性食品中的应用。
4.鱼精蛋白的缺陷
鱼精蛋白作为一种天然的食品防腐剂, 虽然具有许多常规化学合成的食品防腐剂无可比拟的优
点, 但同时也存在一些应用上的缺陷, 如: ①对革兰氏阳性菌抑制效果明显, 而对革兰氏阴性菌效果不明显。现在有实验证明, 经过与0.4﹪甘氨酸、 0.8﹪ 醋酸钠复配后, 能明显增强鱼精蛋白对革兰氏阴性菌的抑制作用; ②鱼精蛋白的溶解性不是很好。现在使用大豆卵磷脂等乳化剂与鱼精蛋白复配, 不但可解决鱼精蛋白在食品介质中溶解性不好的问题, 而且可明显增强鱼精蛋白的抑菌性能; ③鱼精蛋白在中、 碱性介质中有良好的抗菌活性, 但在酸性环境下其抗菌效果较差, 限制了在众多酸性食品中的应用.可是能够经过与山梨酸钾复配, 这样不但扩大了抗菌效果的pH 值范围, 还使二者的抗菌活性产生协同作用, 可降低灭菌温度, 缩短灭菌时间。
5.鱼精蛋白的毒性
到当前为止, 还没出现鱼精蛋白使用过程中发生对人体有毒害的事件。对鱼精蛋白的安全性研究表明: 鱼精蛋白LD50 > 10 g /kg, 按化学物质毒性分级, 可认为鱼精蛋白属于无毒物质; 积蓄系数> 5, 可认为鱼精蛋白为弱积蓄性物质; 对雄性小鼠骨髓微核率没有增加作用; 对小鼠睾丸初级精母细胞染色体未发现有致畸和致突变作用: 经过各种毒理实验证明, 鱼精蛋白实际无毒、 弱蓄积性, 无染色体畸变作用( 包括体细胞染色体畸变和生殖细胞染色体畸变) , 也无基因突变作用。因此能够认为, 鱼精蛋白是一种对人体无害的、 高度安全的、 具有很高营养性和功能性的新型食品防腐剂。
6.鱼精蛋白的发展前景
随着生物技术的不断发展, 鱼精蛋白分子水平上的研究已日益成为热点和焦点。迄今为止, 国内外学者在鱼精蛋白分子水平方面做了大量研究工作, 主要有以下两种思路。一种是采用蛋白质分子设计的方法, 即在深入了解鱼精蛋白空间结构以及结构和功能关系的基础上, 借助基因操作技术和计算机辅助技术, 设计和改造蛋白。如邓超等采用生物信息学及计算机辅助手段, 在互联网美国国立生物技术信息中心( NCBI) 数据库中比对了鲑形目鲑精蛋白的保守序列, 研究设计了鲑鱼精蛋白新的氨基酸序列, 提高了其耐酸及抑制革兰氏阴性菌的能力, 成功地人工设计合成了抑菌活性有所改进的鱼精蛋白。另一种则是利用微生物重组, 表示目的蛋白的方法, 即经过PCR 技术获得鱼精蛋白的编码基因, 以大肠杆菌等为宿主微生物, 进行大量表示鱼精蛋白。杜荣茂经过PCR 技术扩增了鱼精蛋白的DNA 片段, 同源性高达97. 1%, 仅有3 处编码基因变异, 然后以E. coli 为重组表示宿主和pET30a 为表示载体, 进行IPTG 诱导表示, 成功构建了鱼精蛋白的融合蛋白表示系统, 采用SDS － PAGE 电泳确定得到了目的蛋白。
7.鱼精蛋白发展的瓶颈
鱼精蛋白的原料虽说是利用价值较低的各类动物的成熟精巢组织, 特别是鱼类精巢, 但从经济角度来看, 可实际利用的鱼类不多, 而且鱼精蛋白的提取、 纯化过程也较为复杂, 还没实现大规模工业化生产, 使得鱼精蛋白的供应有限, 限制了它广泛使用的可能性。因而寻找一种新的生产途径来提高鱼精蛋白的产量、 降低其成本势在必行。
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