血清miR-126、miR...患者中的表达水平及预测价值_林涛.pdf

分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1论著基金项目：四川省科技计划项目（2019YFS0443)作者单位：德阳市人民医院急诊科，四川，德阳 618000通信作者：林涛，Email：血清 miR126、miR381 在脓毒症患者中的表达水平及预测价值林涛何顶秀巫金摘要 目的通过检测微小 RNA 126（miR126）、微小 RNA 381（miR381）在脓毒症患者血清中的表达，评估二者对脓毒症的预测价值。方法选取 2019 年 6 月至 2021 年 12 月 189 例德阳市人民医院已确诊收治的脓毒症患者，按照严重程度分为 79 例脓毒症组、65 例严重脓毒症组和 45 例脓毒性休克组，并选取 180 名健康者作为对照组；受试者工作特征曲线（ROC）分析血清中 TNF、IL6、miR126、miR381 表达水平对脓毒症的预测价值；Logistic 回归分析影响脓毒症发生的影响因素。结果与对照组相比，脓毒症组、严重脓毒症组、脓毒性休克组白细胞计数（WBC）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）、乳酸（Lac）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素6（IL6）水平依次显著增加，差异有统计学意义（F=203.191，655.528，565.808，468.356，497.532，97.385，62.398，P0.05）；miR126、miR381 表达水平在脓毒症组、严重脓毒症组、脓毒性休克组中均显著低于对照组，并随着病情严重程度的增加而显著降低，差异有统计学意义（F=41.349，40.802，P0.05）；多因素分析发现，PCT、CRP、Lac、WBC、HMGB1、TNF、IL6、miR126 和 miR381 均是影响脓毒症发生危险因素（P0.05）；miR126、miR381 联合预测脓毒症发生的 AUC 显著高于 TNF、IL6、miR126 单独预测，差异有统计学意义（Z=1.985，P=0.047；Z=2.121，P=0.034；Z=2.218，P=0.027）。结论脓毒症患者血清中miR126、miR381 表达显著降低，二者联合对脓毒症发生具有一定的预测价值。关键词 脓毒症；微小RNA126；微小RNA381Expression levels and predictive value of serum miR126 and miR381 in patients withsepsisLIN Tao，HE Dingxiu，WU Jin（Emergency Department of Peoples Hospital of Deyang City，Deyang，Sichuan，China，618000）ABSTRACT ObjectiveTo detect the expression of microRNA126（miR126）and microRNA381（miR381）in serum of patients with sepsis，to evaluate the predictive value of the two in sepsis.MethodsAtotal of 189 patients with sepsis admitted to Peoples Hospital of Deyang from June 2019 to December 2021were selected.According to the severity，they were divided into 79 cases of sepsis group，65 cases of severe sepsis group and 45 cases of septic shock group，180 healthy people were selected as the control group.The receiver operating characteristic（ROC）curve was used to analyze the predictive value of serum TNF，IL6，miR126and miR381 expression levels for sepsis；Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of sepsis.ResultsCompared with the control group，white blood cell count（WBC），procalcitonin（PCT），Creactive protein（CRP），lactic acid（Lac），and high mobility in the sepsis group，severe sepsisgroup，and septic shock group Group protein B1（HMGB1），tumor necrosis factor（TNF），interleukin6（IL6）levels increased significantly in turn，and the differences were statistically significant（F=203.191，655.528，565.808，468.356，497.532，97.385，62.398，P0.05）.The expression levels of miR126 and miR381 94DOI:10.19930/ki.jmdt.2023.01.021分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1in the sepsis group，severe sepsis group and septic shock group were significantly lower than those in the controlgroup，and decreased with the severity of the disease，and the difference was statistically significant（F=41.349，40.802，P0.05）.Multivariate analysis found that PCT，CRP，Lac，WBC，HMGB1，TNF，IL6，miR126and miR381 were all risk factors for sepsis（P0.05）.The area under the ROC curve（AUC）of miR126 andmiR381 combined to predict the occurrence of sepsis was significantly higher than that of TNF，IL6，miR126alone，and the difference was statistically significant（Z=1.985，P=0.047；Z=2.121，P=0.034；Z=2.218，P=0.027）.ConclusionThe expressions of miR126 and miR381 in the serum of patients with sepsis were significantly decreased，and the combination of the two has a certain predictive value for the occurrence of sepsis.KEY WORDS Sepsis；MicroRNA126；MicroRNA381脓毒症是 ICU 的主要死亡原因之一，其特点是可导致大量炎症介质的释放、刺激免疫细胞活化、损坏机体微循环系统和引发内皮功能障碍，致使器官衰竭1。脓毒症患者多存在应激性溃疡、急性肺损伤、休克等多种并发症，而掌握其发病机制有助于早期诊断和治疗2。有研究表明，微小RNA（MicroRNA，miRNA）对改善内皮细胞损伤和炎症反应有重要作用3。微小 RNA126（MicroRNA126，miR126）可有效保护血管生成和完整。研究发现，miR126 在脓毒症中表达下调，但关于其在脓毒症中的研究多局限于动物研究3，而关于其在脓毒症临床中的研究还甚少。微小 RNA381（MicroRNA381，miR381）是 一 种 肿 瘤 相 关 基因4。脓毒症患者血清 miR381 低表达，增强其表达可抑制脓毒症大鼠炎症及心功能障碍5。近年来有研究表明，高迁移率族蛋白 B1（high mobilitygroup box 1 protein，HMGB1）是脓毒症产生致死效应的重要原因，而 miR126 与 miR381 可起到下调HMGB1 表达的作用6。为探究脓毒症患者血清miR126、miR381 表达及其临床预测价值，本研究通过检测两者在脓毒症患者血清中的表达，探讨其对脓毒症的临床预测价值。1资料与方法1.1临床资料选取 2019 年 6 月至 2021 年 12 月 189 例德阳市人民医院已确诊收治的脓毒症患者作为观察组，年龄为（49.2811.54）岁，男性 99 例，女性 90例；按照疾病严重程度分为：79 例脓毒症组、65 例严重脓毒症组和 45 例脓毒性休克组；选取 180 名健康者作为对照组，年龄为（49.259.54）岁，男性94 名，女性 86 名。纳入标准：根据 Sepsis3.0 对脓毒症患者诊断：序贯器官衰竭评分（Sequential Organ Failure Assessment，SOFA）2、收 缩 压 100mmHg、呼吸频率22 次/min7，临床资料完整；排除标准：患心、肺、肾功能障碍者或其它免疫系统疾病；入组前已接受过免疫抑制治疗；患者依从性差。本研究通过伦理委员会批准，经受试者和家属知情并签署同意书。1.2研究方法1.2.1样品采集及保存患者入院次日空腹抽取静脉血 4 mL，对照组健康体检血液 4 mL。样本均进行 4 000 r/min、10 min离心取上清至-80冰箱待测。1.2.2qRTPCR 法检测血清样本中 miR126、miR381表达水平使用RNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司）提取出各组样本血清中总RNA后反转录成cDNA。以此为模板，采用qRTPCR检测（日本Takara公司）样本中miR126、miR381的表达水平。通过2Ct分析miR126、miR381的表达。引物序列见表1。1.2.3信息收集收集患者白细胞计数（white blood cell count，WBC）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、C 反应蛋白（Creactive protein，CRP）、乳酸（Lactic acid，Lac）、肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor，TNF）、Primer namemiR126miR381U6Forward primer sequence（53）ACACTCCAGCTGGGCATTATTACTTTTGGTACGGAGCCTATACAAGGGCAAGCATTGGAACGATACAGAGAAGATTReverse primer sequence（53）ACACTCCAGCTGGGACTGCAGTGAAGGCACTTACGAGCGATACAAGGGCAAGCGGAACGCTTCACGAATTTG表1实时荧光定量PCR 引物Table 1Real time fluorescent quantitative PCR primers 95分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1白介素6（Interleukin6，IL6）的详细信息；SOFA评分和急性生理与慢性健康评分系统（acute physiology and chronic health evaluation scoring system，APACHEII）8由主治医生评定。对照组详细信息由体检中心获取。1.2.4ELISA法检测血清HMGB1水平根据 ELISA 试剂盒（批号：1531958038，规格：96T，上海将来实业股份有限公司）说明书检测所有受试对象血清中HMGB1水平。1.3统计学分析使用 SPSS 16.0 软件进行统计分析；计量资料以（xs）表示，多组样本间使用单因素方差分析比较，进一步两两比较进行 SNKq 检验；计数资料以例表示，两样本之间采用卡方检验进行比较；Pearson 相关性分析 miR126 和 miR381 及二者与各临床指标的相关性；受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）分 析 血清中 TNF、IL6、miR126、miR381 表达水平对脓毒症的预测价值；Logistic 回归分析影响脓毒症发生的影响因素；以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组一般资料比较脓毒症组、严重脓毒症组、脓毒性休克组的WBC、PCT、CRP、Lac、HMGB1、TNF、IL6 与对照组相比依次显著增加，差异有统计学意义（P0.05）；且脓毒症组、严重脓毒症组、脓毒性休克组SOFA 评分、APACHEII 评分依次显著增加，差异有统计学意义（P0.05）。见表2。项目性别（男/女）年龄（岁）WBC（109/L）PCT（g/L）CRP（mg/L）Lac（mmol/L）HMGB1（pg/mL）SOFA 评分（分）APACHEII 评分（分）TNF（pg/mL）IL6（pg/mL）对照组（n=180）94/8649.259.549.462.360.300.097.112.431.590.7110.092.3017.264.6425.226.39脓毒症组（n=79）41/3849.2212.4510.802.10a6.321.90a19.803.52a2.020.57a20.606.72a3.930.8618.044.2020.225.32a28.188.39a严重脓毒症组（n=65）35/3048.9611.3214.962.31ab9.323.07ab25.856.80ab4.350.68ab35.678.76ab5.831.01b25.017.23b25.186.22ab35.1310.69ab脓毒性休克组（n=45）23/2249.8610.2817.382.02abc13.754.10abc34.968.44abc6.221.60abc43.8510.69abc7.221.15bc32.458.69bc31.968.03abc43.5513.35abcF/2值0.0930.065203.191655.528565.808468.356497.532170.21470.32097.38562.398P 值0.9930.9780.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001表2各组一般资料比较（xs）Table 2Comparison of general data of each group（xs）注：与对照组比较，aP0.05；与脓毒症组比较，bP0.05；与严重脓毒症组比较，cP0.05。组别对照组脓毒症组严重脓毒症组脓毒性休克组F 值P 值n180796545miR1261.000.180.880.26a0.770.24ab0.660.18abc41.3490.001miR3811.010.160.900.25a0.790.24ab0.680.22abc40.8020.001表3miR126、miR381在不同程度脓毒症患者血清中的表达（xs）Table 3Expression of miR126 and miR381 in serum ofpatients with different degrees of sepsis（xs）注：与对照组比较，aP0.05；与脓毒症组比较，bP0.05；与严重脓毒症组比较，cP0.05。2.2miR126、miR381在各血清样本中的表达miR126、miR381 的表达水平在脓毒症组、严重脓毒症组、脓毒性休克组中均显著低于对照组，差异有统计学意义（P0.05）；随着病情严重程度的增加，二者的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。2.3脓毒症患者血清中 miR126、miR381 表达与临床指标的相关性miR126、miR381 表达与 WBC、PCT、CRP、Lac、HMGB1、SOFA评分、APACHEII评分、TNF、IL6呈负相关（P0.05）。见表4。2.4脓毒症患者血清中 miR126、miR381 表达相关性分析脓毒症患者血清中miR126与miR381表达呈正相关（r=0.342，P0.001）。见图1。2.5Logistic回归分析影响脓毒症发生的因素多 因 素 分 析 发 现，PCT、CRP、Lac、WBC、HMGB1、TNF、IL6、miR126 和 miR381 均是影响脓毒症发生危险因素（P0.05）。见表5。96分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.12.6TNF、IL6、miR126、miR381预测脓毒症发生的ROC特征曲线miR126、miR381 二者联合预测脓毒症发生的 AUC 显著高于 TNF、IL6、miR126 单独预测（Z=1.985，P=0.047；Z=2.121，P=0.034；Z=2.218，P=0.027）。见表6、图2。3讨论脓毒症是由病毒、细菌等引起的全身性炎症反应，可导致器官功能性障碍2。有研究证明，脓毒症患者内皮细胞的增殖能力显著降低9。近几年脓毒症的发病率和死亡率均有所增加10，因此，需要迫切寻找可用于诊断、评估病情进展的生物标志物。因此，本研究通过检查脓毒症患者血清miR126、miR381 表达情况，探讨其对脓毒症的预测价值。大量研究已证实机体的免疫调节机制可被miRNAs 的异常表达所干扰，且多种已被作为脓毒症预后、诊断的生物标志物1112。miR126能够通过下调 HMGB1 翻译后水平的表达达到抑制内皮细胞炎症和氧自由基的产生的目的12。内皮细胞中miR126 不仅可以预防微血管功能障碍还能使脓毒症患者预后情况得到改善13，其过表达可能治疗脓毒症的一种新的有效策略14。本研究结果表明 miR126表达降低与脓毒症的发生及进展密切相关，其水平降低可能通过促使炎症因子大量分泌，致使病情加重。有学者发现脓毒症患者血浆中的miR126表达水平与患者疾病严重程度和预后正相关15，该结果与本研究结果相异，可能是由于地区偏见，以及样本量的差异造成的，除此之外受试对象年龄、是否患有其他疾病也会导致结果的差异性。最近有研究表明，miR381 的过表达可以通过抑制 IKKNFB 途径的炎症反应来抑制脊髓损伤大鼠炎症损伤的加重16。HMGB1可促进脓毒症的发生发展，Liu 等研究发现 miR381 可以通过下调 HMGB1 减少多发性肌炎的炎症17。本研究结果表明miR381可能通过下调HMGB1的表达参与脓毒症的发生机制，并且与病情程度相关。指标WBCPCTCRPLacHMGB1SOFA 评分APACHEII 评分TNFIL6miR126r 值-0.501-0.445-0.375-0.578-0.585-0.412-0.387-0.453-0.601P 值0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001miR381r 值-0.448-0.444-0.378-0.645-0.512-0.352-0.340-0.536-0.412P 值0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001表4miR126、miR381与临床指标的相关性Table 4Correlations between miR126，miR381 andclinical indicators因素PCT（g/L）CRP（mg/L）Lac（mmol/L）WBC（109/L）HMGB1（pg/mL）miR126 表达miR381 表达TNF（pg/mL）IL6（pg/mL）值0.3550.4690.7020.6950.8220.8940.7040.6250.561S.E.值0.1430.1620.1730.1660.1850.1400.1550.1680.145wald2值6.1588.37316.47117.51119.72040.81920.63413.85814.986OR 值1.4261.5982.0182.0032.2742.4462.0221.8691.75395%CI1.0771.8871.1632.1951.4382.8321.4472.7731.5823.2681.8593.2181.4922.7401.3452.5981.3192.329表5Logistic 回归分析影响脓毒症发生的因素Table 5Logistic regression analysis of factors affecting theoccurrence of sepsis0.90.80.70.60.50.40.3miR1260.200.300.400.500.600.700.80miR381图1相关性分析Figure 1Correlation analysis表6TNF、IL6、miR126、miR381预测脓毒症发生的诊断价值Table 6Diagnostic value of TNF，IL6，miR126 andmiR381 in predicting the occurrence of sepsis项目TNFIL6miR126miR381二者联合AUC（95%CI）0.723（0.6830.783）0.718（0.6960.759）0.719（0.6670.771）0.735（0.6840.786）0.796（0.7510.842）截断值21.042 pg/mL32.026 pg/mL0.9130.825敏感度（%）0.8170.8720.7220.8700.717特异性（%）0.6770.6030.6560.5560.75700.20.40.60.81.01特异性1.00.80.60.40.2敏感度曲线来源miR126miR381TNFIL6miR126+miR381参考线图2ROC 特征曲线Figure 2ROC characteristic curves 97分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1除此之外，miR126、miR381 均与 WBC、PCT、CRP、Lac、HMGB1、TNF、IL6 水平、SOFA 评分和 APACHEII 评分成负相关。该结果进一步表明，二者可能通过调控炎性因子的分泌来调控炎症反应，从而参与脓毒症的进展。本研究还发现，miR126、miR381 存在正相关性，表明二者可能通过协同作用共同参与脓毒症的发生。多 因 素 分 析 发 现，CT、CRP、Lac、WBC、HMGB1、TNF、IL6、miR126 和 miR381 均是影响脓毒症发生危险因素。这表明 miR126、miR381 可作为临床监测指标用以跟踪病情发展状况。ROC 结果发现，miR126、miR381 联合预测脓毒症发生的 AUC 高于 TNF、IL6、miR126 单独预测。该结果表明 miR126、miR381 有作为脓毒症新的生物标志物的潜能。临床可通过检测二者水平来评估脓毒症进程，帮助临床医生及时作出相应的诊疗策略，以达到改善患者预后的目的。综上所述，本研究发现 miR126 和 miR381 表达水平在脓毒症患者血清中显著降低，二者联合对脓毒症发生具有一定的预测价值。本研究为脓毒症的早期预测和病情监测提供了新的方向，由于目前受试人员预后相关资料不全，因此未进行预后情况分析，但在后续研究中将以此为重点进行深入探究。参考文献1Armstrong BA，Betzold rd，May AK.Sepsis and SepticShock StrategiesJ.Surg Clin North Am，2017，97（6）：13391379.2Novosad SA，Sapiano MRP，Grigg C，et al.Vital signs：epidemiology of sepsis：prevalence of health care factors and opportunities for prevention J.Morb Mortal Wkly Rep，2016，65（33）：864869.3徐洁欢，向琳，李耀军，等.miRNA381 在恶性肿瘤中的研究进展 J.中国当代医药，2020，27（21）：2225.4Chen 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