脂联素调控SDF-1α_C...周膜干细胞成骨分化中的作用_李慧.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1论著【摘要】目的研究脂联素通过调控基质细胞衍生因子1（SDF1）/CXC 趋化因子受体 4（CXCR4）信号轴对炎症微环境下牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化中的影响。方法原代培养 PDLSCs 后取第三代细胞进行分组处理，进行成骨分化诱导并用10 ng/mL肿瘤坏死因子（TNF）模拟微炎症环境、用10 g/mL脂联素处理、转染阴性对照（NC）或SDF1的siRNA。成骨诱导第3、5、7 d时，检测碱性磷酸酶（ALP）活性，骨钙素（OCN）、骨保护素（OPN）、SDF1、CXCR4的mRNA表达，SDF1的含量；成骨诱导第21 d时，进行茜素红染色、观察钙盐沉积情况。结果炎症微环境下 PDSCSs 的成骨分化及 SDF1/CXCR4 信号轴的激活均受到抑制；脂联素在炎症微环境下促进PDSCSs的成骨分化及SDF1/CXCR4信号轴的激活；转染SDF1的 siRNA 后，SDF1/CXCR4 信号轴的激活受到抑制，脂联素在炎症微环境下促进 PDSCSs 成骨分化的作用也被抑制。结论脂联素通过激活SDF1/CXCR4信号轴促进炎症微环境下PDSCSs的成骨分化。【关键词】牙周膜干细胞；脂联素；成骨分化；基质细胞衍生因子1；CXC趋化因子受体4DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.03Role of adiponectin regulating SDF1/CXCR4 signal axis in osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells under inflammatory microenvironmentLI Hui，SUN WeiguoDepartment of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Anhui University of Science and Technology，Huainan，Anhui Province 23200，China【Abstract】ObjectiveTo explore the role of adiponectin on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells（PDLSCs）under inflammatory microenvironment via regulating stromal cell derived factor1（SDF1）/CXC chemokine receptor 4（CXCR4）signal axis.MethodsAfter primary culture of PDLSCs，the third generation cells were divided into groups for osteogenic differentiation induction and treated with 10 ng/mL tumor necrosisfactor to simulate micro inflammatory environment，treated with 10 g/mL adiponectin，transfected with negativecontrol（NC）or SDF1 siRNA.Alkaline phosphatase（ALP）activity，the mRNA expression levels of osteocalcin（OCN），osteoprotegerin（OPN），SDF1，CXCR4 and the content of SDF1 on the 3rd，5th and 7th day of osteogenesis induction were detected；nn the 21st day of osteogenesis induction，alizarin red staining was performed andcalcium salt deposition was observed.ResultsThe osteogenic differentiation and the activation of SDF1/CXCR4signal axis in PDLSCs under inflammatory microenvironment were inhibited.Adiponectin promotes osteogenic differentiation and the activation of SDF1/CXCR4 signal axis in PDLSCs under inflammatory microenvironment.Aftertransfection of SDF1 siRNA，the activation of SDF1/CXCR4 signal axis was inhibited，and the role of adiponectin in promoting osteogenic differentiation of PDLSCs under the inflammatory microenvironment was also inhibited.Conclusion Adiponectin promotes the osteogenic differentiation of PDLSCs under inflammatory microenvironment viaactivating SDF1/CXCR4 signal axis.【Key words】Periodontal ligament stem cells；Adiponectin；Osteogenic differentiation；Stromal cellderived factor1；CXC chemokine receptor 4脂联素调控SDF1/CXCR4信号轴在炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化中的作用李慧，孙卫国安徽理工大学第一附属医院口腔科，安徽 淮南 23200115解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是牙周组织中参与组织损伤再生及修复的重要种子细胞12。慢性牙周炎会导致牙槽骨损害、牙列缺损或缺失，PDLSCs 在特定条件下向成骨细胞分化有利于牙槽骨的重建和再生。但是，越来越多的学者发现慢性牙周炎患者牙周组织的再生修复能力明显减弱，PDLSCs在局部炎症微环境下成骨分化能力减弱与之密切相关34。因此，增强PDLSCs在炎症微环境下的成骨分化能力有助于在治疗慢性牙周炎过程中促进牙槽骨的重建与再生。脂联素是一种来源于脂肪细胞的细胞因子，有基础视实验研究报道脂联素通过激活基质细胞衍生因子1（Stromal cell derived factor1，SDF1）/CXC 趋化因子受体 4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）促 进 干 细 胞 的 成 骨 分化5；也有临床研究报道慢性牙周炎患者龈沟液中脂联素的含量明显减少6，提示炎症微环境可能抑制脂联素的生成和释放，但脂联素是否在炎症微环境下调节 PDLSCs 的成骨分化尚不清楚。本研究将通过细胞实验对脂联素调控SDF1/CXCR4 信号轴在炎症微环境下 PDLSCs 成骨分化中的作用展开分析。1材料与方法1.1材料脂联素、地塞米松、维生素 C、甘油磷酸钠（Sigma），裂解液、碱性磷酸酶（Alkaline phosphorylase，ALP）活性检测试剂盒、茜素红（上海碧云天），细胞总 RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒（北京天根生化），SDF1 的酶联免疫吸附测试（ELISA）试剂盒（上海酶联生物），等。1.2方法1.2.1PDLSCs 的分离、培养及鉴定正畸拔除的牙齿放入预冷的含有1%青霉素链霉素混合液的MEM 培养基中，转入生物安全柜后用预冷的生理盐水反复冲洗，用手术刀刮取牙根中1/3的牙周膜，加入 1 mL I 型胶原酶（浓度 3 mg/mL），37水浴中震荡消化 15 min，加入等体积含 10%胎牛血清的MEM培养基终止消化，而后在离心机中以800 r/min 的速度离心 5 min，保留细胞沉淀、用含10%胎牛血清的 MEM 培养基重悬，接种在培养皿内，每2 d更换1次培养液直至观察到细胞从组织边缘爬出，当细胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，得到第 1 代 PDLSCs，继续培养和消化直至得到第 3 代 PDLSCs，用流式细胞术检测 CD44、CD90、CD45、CD34 的阳性表达情况以鉴定干细胞特性。1.2.2PDLSCs的分组处理及成骨诱导取第 3 代PDLSCs，接种在6孔培养板中，当细胞融合度达到80%90%时进行分组处理；对照组用成骨分化诱导液（10%胎牛血清、10 nmo/L 地塞米松、0.05mmol/L 维生素C、10 mmol/L 甘油磷酸钠）处理；炎症组用含有10 ng/mL TNF的成骨分化诱导液处理；脂联素组用含有 10 ng/mL TNF 和 10g/mL脂联素的成骨分化诱导液处理。siNC组在成骨分化诱导液中转染 NC siRNA；siNC+炎症组在含有10 ng/mL TNF的成骨分化诱导液中转染NC siRNA；siNC+脂联素组在含有10 ng/mL TNF和 10g/mL 脂联素的成骨分化诱导液中转染 NCsiRNA；siSDF1+脂联素组在含有10 ng/mL TNF 和 10 g/mL 脂联素的成骨分化诱导液中转染SDF1 siRNA。1.4ALP活性的检测成骨诱导分化第3、5、7d时，采用裂解液裂解PDLSCs，裂解后的细胞悬液 1 200 r/min 离心 3min，取上清并采用ALP活性检测试剂盒检测ALP活性，每组设置 4 个复孔，按照说明书操作，根据标准品检测得到的标准曲线计算待测样本的ALP活性。1.5基因mRNA表达的荧光定量PCR检测成骨诱导分化第 3、5、7 d 时，使用细胞总RNA 提取试剂盒分离提取细胞中的总 RNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒将总 RNA 反转录为 cDNA，使用荧光定量检测试剂盒对 cDNA 中 OCN、OPN、SDF1、CXCR4 的 mRNA 表达进行检测。OCN、OPN、SDF1、CXCR4 的引物序列见表 1。按照试剂盒说明书配置 PCR 反应体系、设置 PCR反应程序，以 Tubulin 为内参，计算 OCN、OPN、SDF1、CXCR4的mRNA相对表达水平。1.6细胞因子含量的ELISA检测成骨诱导分化第 3、5、7d 时，吸取 PDLSCs 的培养基，采用 ELISA 试剂盒检测 SDF1 的含量，每组设置4个复孔，按照说明书操作，根据标准品检测得到的标准曲线计算待测样本中 SDF1 的含量。16解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.16040200432103 d5 d7 d3 d5 d7 d1231233210OPN的mRNA相对表达ALP活性(mol/min)OCN的mRNA相对表达1233 d5 d7 d*#*#*#*123ABCD#*#*图 2脂联素促进炎症微环境下 PDLSCs 成骨分化A.各组细胞 ALP 活性的比较；B.各组细胞 OCN mRNA 表达的比较；C.各组细胞 OPN mRNA 表达的比较；D.各组细胞钙盐沉积的比较（茜素红染色，400）。1.对照组；2.炎症组；3.脂联素组。*与对照组比较，*P0.05；#与炎症组比较，#P0.05基因OCNOPNSDF1CXCR4上游引物（53）TACGTATCGTAGCTAGCACGTATCAGTCGATCGTAAGCTAGCGTAGCTAGCTATCGTACGATGCTAGCGCTA下游引物（53CTAGCTAGCTAGTCGTACCGTACGCGTAGCTAGCTACGTAGCTACGATCGTAGACGTAGCATTAGCTAGCTA表1本文基因的引物序列1.7茜素红染色成骨诱导分化第21 d时，用4%多聚甲醛室温固定PDLSCs 30 min，磷酸盐缓冲液冲洗后每孔加入 0.2%茜素红溶液 1 mL，室温孵育 1 h 后磷酸盐缓冲液清洗3次，在显微镜下观察钙盐沉积情况。1.8统计学方法采用SPSS24.0软件对实验数据进行统计学处理，计量资料以均数标准差（MeanSD）表示，组间比较采用单因素方差分析，P0.05 表示组间差异有统计学意义。2结果2.1PDLSCs干细胞特性的鉴定PDLSCs 表面干细胞标志基因 CD44、CD90 的阳性表达率均超过99%，髓细胞标志基因CD45及内皮细胞标志基因 CD34 的阳性表达率均低于1%，提示分离培养的 PDLSCs 符合间充质干细胞的特性（图1）。3002001000Count-103010310410530015010050Count-10301031041051051.0K800600400200Count-1030103104400300200100Count-1030103104105ABCD图1PDLSCs干细胞特性的鉴定A.CD44 表达的流式细胞术检测；B.CD90 表达的流式细胞术检测；C.CD45 表达的流式细胞术检测；D.CD34表达的流式细胞术检测2.2脂联素对炎症微环境下PDLSCs成骨分化的调控作用成骨诱导后3 d、5 d、7 d时，炎症组PDLSCs早期成骨 ALP 活性及 OCN、OPN mRNA 表达均低于对照组（P0.05）；脂联素组 PDLSCs 早期成骨 ALP活性及OCN、OPN mRNA表达均高于炎症组，成骨诱导后 3 d、5 d、7 d 的 ALP 活性，成骨诱导后 3 d、7 d 的 OCN mRNA，成骨诱导后 5 d 的 OPN mRNA表达均高于炎症组，差异均存在统计学意义（P0.05）（图2A2C）。17解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1403020100培养基中SDF1的含量（ng/mL）123*#3 d5 d7 d2.01.51.00.50.0SDF1的mRNA相对表达123*#3 d5 d7 dCXCR4的mRNA相对表达2.01.51.00.50.0123#3 d5 d7 dABC*图3脂联素促进炎症微环境下PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴激活A.各组细胞培养基中SDF1含量的比较；B.各组细胞SDF1 mRNA 表达的比较；C.各组细胞CXCR4 mRNA 表达的比较。1.对照组；2.炎症组；3.脂联素组。*与对照组比较，*P0.05；#与炎症组比较，#P0.05403020100培养基中SDF1的含量（ng/mL）12347 d3 d5 d*#*#*#SDF1的mRNA相对表达2.01.51.00.50.012347 d3 d5 d#*#*#CXCR4的mRNA相对表达2.52.01.51.00.50.012347 d3 d5 d*#ABC图4转染SDF1 siRNA对脂联素促进炎症微环境下PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴激活的影响A.各组细胞培养基中SDF1含量的比较；B.各组细胞SDF1 mRNA表达的比较；C.各组细胞CXCR4 mRNA表达的比较。1.siNC组；2.siNC+炎症组；3.siNC+脂联素组；4.siSDF1+脂联素组。*与siNC组比较，*P0.05；#与siNC+炎症组比较，#P0.05；与siNC+脂联素组比较，P0.05#*成骨诱导后 21 d 时，茜素红染色显示炎症组PDLSCs晚期成骨的钙盐沉积强于对照组；脂联素组PDLSCs晚期成骨的钙盐沉积弱于炎症组（图2D）。以上结果表明炎症微环境下 PDLSCs 的成骨分化受到抑制，脂联素对炎症微环境下PDLSCs的成骨分化具有促进作用。2.3脂联素对炎症微环境下PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴的调控作用成骨诱导后3 d、5 d、7 d时，炎症组PDLSCs培养基中 SDF1 的含量及细胞中 SDF1、CXCR4的 mRNA 表达均低于对照组（P0.05）；脂联素组PDLSCs培养基中SDF1的含量及细胞中SDF1、CXCR4 的 mRNA 表达均有不同程度地高于炎症组，成骨诱导后5 d的培养基中SDF1，成骨诱导后 3 d、7 d 的细胞中 SDF1、CXCR4 的 mRNA 表达均高于炎症组，差异均存在统计学意义（P0.05）（图3A3C）。以上结果表明炎症微环境下 PDLSCs 中 SDF1/CXCR4信号轴受到抑制，脂联素对炎症微环境下PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴具有激活作用。2.4SDF1/CXCR4 信号轴在脂联素调控炎症微环境下PDLSCs成骨分化中的作用成骨诱导后 3 d、5 d、7 d 时，siNC+炎症组PDLSCs培养基中SDF1的含量及细胞中SDF1、CXCR4 的 mRNA 表达均有不同程度地低于 siNC组，成骨诱导后5 d、7 d的培养基中SDF1的含量，成骨诱导后3 d、7 d的细胞中SDF1mRNA，成骨诱导后3 d、5 d、7 d的CXCR4 mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）；siNC+脂联素组PDLSCs培养基中SDF1的含量及细胞中SDF1、CXCR4的mRNA表达均有不同程度地高于siNC+炎症组，成骨诱导后5 d、7 d的培养基中SDF1的含量，成骨诱导后3 d、5 d、7 d的SDF1、CXCR4的mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）；siSDF1+脂联素组PDLSCs培养基中SDF1的含量及细胞中SDF1、CXCR4的mRNA表达均有不同程度地低于siNC+脂联素组，成骨诱导后5 d、7 d的培养基中SDF1的含量，成骨诱导后 3 d、5 d、7 d 的细胞中 SDF1mRNA，成骨诱导后3 d、5 d的CXCR4 mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）（图4A4C）。以上结果表明转染SDF1 siRNA削弱了脂联素激活炎症微环境下PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴的作用。成骨诱导后 3 d、5 d、7 d 时，siNC+炎症组18解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1806040200ALP活性（mol/L）OPN的mRNA相对表达OCN的mRNA相对表达43210123412343 d5 d7 d3 d5 d7 d3 d5 d7 d*#*#*34B12AD432101234*#*#*#*C#图5转染SDF1 siRNA对脂联素促进炎症微环境下PDLSCs成骨分化的影响A.各组细胞ALP活性的比较；B.各组细胞 OCN mRNA 表达的比较；C.各组细胞 OPN mRNA 表达的比较；D.各组细胞钙盐沉积的比较（茜素红染色，400）。1.siNC 组；2.siNC+炎症组；3.siNC+脂联素组；4.siSDF1+脂联素组。*与siNC 组比较，P0.05；#与siNC+炎症组比较，P0.05；与siNC+脂联素组比较，P0.05PDLSCs早期成骨ALP活性及OCN、OPN mRNA表达均有不同程度地低于siNC组，成骨诱导后5 d、7 d的早期成骨 ALP 活性，成骨诱导后 3 d、5 d、7 d 的OCN、OPN mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）；siNC+脂联素组PDLSCs早期成骨ALP活性及 OCN、OPN mRNA 表达均有不同程度地高于 siNC+炎症组，成骨诱导后5 d、7 d的早期成骨ALP活性，成骨诱导后3 d、5 d、7 d的OCN、OPN mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）；siSDF1+脂联素组 PDLSCs 早期成骨 ALP 活性及 OCN、OPN mRNA表达均有不同程度地低于siNC+脂联素组，成骨诱导后5 d、7 d的早期成骨ALP活性，OCN mRNA，成骨诱导后3 d、5 d的OPN mRNA，差异均存在统计学意义（P0.05）（图5A5C）。成骨诱导后21 d时，茜素红染色显示siNC+炎症组PDLSCs晚期成骨的钙盐沉积弱于siNC组（P0.05）；siNC+脂联素组PDLSCs晚期成骨的钙盐沉积强于siNC+炎症组；siSDF1+脂联素组PDLSCs晚期成骨的钙盐沉积弱于 siNC+脂联素组（图5D）。以上结果表明SDF1 siRNA削弱了脂联素激活炎症微环境下促进PDLSCs成骨分化的作用。3讨论慢性牙周炎发病过程中存在牙槽骨、牙周膜等牙周支持组织的损伤和破坏，组织工程技术能够通过种子细胞的定向分化能力诱导牙周支持组织再生、被视作治疗慢性牙周炎的新方法78。PDLSCs是参与牙周组织再生的重要种子细胞，在特定条件下向成骨细胞分化能够实现牙槽骨的再生和修复。但是，慢性牙周炎的牙周组织存在慢性炎症反应，局部持续存在的微炎症环节对PDLSCs的成骨分化具有抑制作用9。TNF刺激时建立炎症微环境常用的方法3，10，本研究通过细胞实验也证实TNF模拟的炎症微环境显著抑制PDLSCs的成骨分化，TNF使细胞中ALP活性、成骨标志基因OCN及OPN的表达、钙盐沉积强度均明显下降。正因为 PDLSCs 在炎症微环境的成骨分化能力减弱，所以促进PDLSCs在炎症微环境下成骨分化具有重要意义。脂联素是一种具有增加胰岛素敏感性、抗炎、抗氧化、促进成骨分化作用的细胞因子，高糖、高脂、炎症等刺激均显著抑制脂联素的生成，进而削弱脂联素在多种病理生理过程中的生物学作用1113。有研究报道慢性牙周炎患者龈沟液中脂联素的含量明显降低6，提示炎症微环境对牙周组织中脂联素的生成具有抑制作用，进而可能削弱脂联素在慢性牙周炎发病过程中促进成骨的作用、不利于牙周组织的再生和修复。有研究报道10 ng/mL脂联素显著促进干细胞的成19解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1骨分化5，本研究在炎症微环境抑制PDLCSs 成骨分化的过程中外源性添加了 10 ng/mL 的脂联素，通过观察成骨分化情况可知脂联素促进炎症微环境下PDLCS的成骨分化。脂联素所发挥的生物学作用依赖于不同的下游信号轴进行信号转导，在干细胞分化的调控中脂 联 素 通 过 SDF 1/CXCR4 信 号 轴 发 挥 作用5，14。另有多项研究证实，SDF1/CXCR4信号轴在干细胞归巢、迁移、成骨分化中均起到促进作用1517。SDF1 是 CXC 趋化因子家族的成员，与CXCR4以配体受体结合的方式发挥调控作用，本文结果表明10 ng/mL脂联素在炎症微环境下促进PDLSCs中SDF1/CXCR4信号轴激活，细胞中SDF1、CXCR4的mRNA表达及培养基中SDF1的含量均有不同程度的增加。进一步在脂联素处理的同时转染 SDF1 的 siRNA，脂联素促进 SDF1/CXCR4 信号轴激活的作用有不同程度的减弱，同时脂联素在炎症微环境下促进PDLSCs成骨分化的作用也有不同程度的减弱，表明脂联素在炎症微环境下促进PDLSCs成骨分化的作用与激活SDF1/CXCR4信号轴有关。综上所述，在炎症微环境下PDLSCs的成骨分化能力减弱、SDF1/CXCR4信号轴的激活受到抑制；外源性使用脂联素进行干预能够通过激活SDF1/CXCR4信号轴的方式促进PDLSCs在炎症微环境中成骨分化。作者贡献声明李慧参与论文撰写、采集数据，孙卫国负责对论文的知识性内容作批评性审阅、统计数据利益冲突所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道参考文献1TomokiyoA，WadaN，MaedaH.Periodontalligament stem cells：Regenerative potency in periodontium J .StemCells Dev，2019，28（15）：974985.2Onizuka S，Iwata T.Application of periodontal ligamentderived multipotent mesenchymal stromal cell sheets for periodontal regenerationJ.Int J Mol Sci，2019，20（11）：E2796.3Yang N，Li Y，Wang G，et al.Tumor necrosis factor suppresses adipogenic and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cell by inhibiting miR21/Spry1 functional axis 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