细胞凋亡诱导及检测边晔.docx

Hela细胞的凋亡诱导及检测
生05 边晔 2010030026
周二班 同组同学：解智博
一、 实验背景
1. 细胞凋亡
细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。
2. DAPI染色
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。

二、 实验步骤
1. 细胞凋亡诱导
1) 取Hela细胞（35mm平皿中培养）镜检，观察细胞形状、数目、密度、污染状况等。
2) 吸弃皿中的培养基，再加入1ml PBS溶液洗去残余培养基，弃掉培养皿中液体。
3) 加入1.5ml新鲜的完全培养基，加入150ml H2O2，至终浓度为0.8mmol/L。
4) 标记，放入1号培养箱中培养。第二天检测细胞凋亡情况。

2. 细胞凋亡检测
1) 取前一天加过氧化氢培养的hela细胞，加入200ml胰酶消化3分钟，再加入适量PBS溶液并反复吹吸至细胞分散，转移到1.5mL EP管中，1000rpm离心5分钟
2) 吸出上清，于沉淀中加入100ml甲醇，冰箱中固定10分钟
3) 1000rpm离心5分钟
4) 弃上清，加100ml PBS洗涤沉淀细胞
5) 1000rpm离心5分钟
6) 弃上清，加50mlPBS溶液，0.5ml DAPI染液，室温染色10分钟
7) 1000rpm离心5分钟
8) 弃上清，加100ml PBS洗涤
9) 1000rpm离心5分钟
10) 弃上清，加15ml PBS重悬细胞
11) 取15ml悬液于玻片上并于正置荧光显微镜下观察并拍照

三、 实验结果与分析
1. 细胞凋亡检测

图1：细胞凋亡检测（10x40）

图2：细胞凋亡检测（10x40）
如图所示细胞中，可以见到较为分散且数量较少的染色亮斑；而且染色较深的区域呈弥散状，散布在细胞的各个位置，经确认应为处于凋亡细胞。但由于从诱导到检测的培养时间不足20小时，所以观察到的凋亡细胞比例较低。如果24小时后再检测，可能观察到的凋亡细胞会变多。

四、 讨论
1. 凋亡检测注意事项
1) 为使得细胞充分接触固定液，应轻柔用移液器混合、悬浮细胞，以获得较好的固定效果。
2) 经过多步离心，经常出现到了某一步就看不到沉淀在哪儿的情况了，但只要记住离心管放置位置，这样就能知道细胞被离到哪一侧，用枪头吸去液体的时候就不用担心误把细胞吸走了。
3) 染色时时间可以稍长一些，并注意避光，这样染色效果较好。
4) 制片时为防止长时间等待拍照而干片，可多取一些悬液，15~20ml左右即可。
5) 完成细胞染色到最终的观察中间经历的时间不可过长，否则可能导致染色的效果不好；细胞不应当在紫外灯下经历太长时间，否则可能导致荧光淬灭。

五、 实验总结
本实验是以细胞传代培养为基础，紧接着HE染色做的。因此主要的培养操作已在前一报告中记录。本次试验的重点是凋亡的检测，包括一系列离心步骤及染色，荧光观察等等。学习了DAPI染色技术，了解了对DNA染色的方法，对细胞凋亡有了更直观的了解，也熟悉了荧光显微镜的使用，更进一步熟悉了显微拍照技术。本实验中由于离心后操作不当，导致细胞损失较多，希望以后类似实验中加以注意与避免此类状况。

六、 参考文献
1. 《细胞生物学实验指导》，王宏英等，2009 年9 月，清华大学生物与技术系；
2. 教师PPT