解吸附电晕束电离质谱法快速检测微量雌激素.pdf

第 4 卷 第 3 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.4 No.3 2013 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2013 基金项目:国家自然科学基金项目(21275049)Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(21275049)*通讯作者:陈波,教授,主要研究方向为分离分析化学,具体分析对象为食品和中草药。E-mail:dr-*Corresponding author:CHEN Bo,Professor,Key Laboratory for Chemical Biology&Traditional Chinese Medicine Research,Ministry of Education,Hunan Normal University,No.36,Lushan Road,Changsha 410081,China.E-mail:dr- 解吸附电晕束电离质谱法快速检测微量雌激素 廖 鹏,侯玉兰,吴婷婷,刘 波,王 华,陈 波*(湖南师范大学,化学生物学及中药分析教育部重点实验室,长沙 410081)摘摘 要要:目的目的 建立解吸附电晕束电离质谱(DCBI-MS)快速检测微量雌激素的分析方法。方法方法 通过DCBI-MS 直接分析,对比标准物质一级和二级质谱图,对检测样品中非法添加的炔诺酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮和枸橼酸氯米芬等 6 种雌激素进行快速定性和半定量检测。结果结果 各目标化合物均可在 1 min 内被检出。基于一级分子离子的定量分析,6 种雌激素的半定量检测结果可信,线性关系最差的醋酸甲地孕酮相关系数为 0.9471,而黄体酮则为 0.9998。最低检出值分别是 0.0875、0.045、0.1775、0.05、0.15、0.1 mg/L。结论结论 本方法无需复杂的前处理过程,简便、快速、灵敏度高,可用于保健食品和中成药中违禁添加微量雌激素的快速定性及半定量检测。关键词关键词:解吸附电晕束电离质谱;雌激素;快速检测 Rapid determination of trace estrogens with DCBI-MS method LIAO Peng,HOU Yu-Lan,WU Ting-Ting,LIU Bo,WANG Hua,CHEN Bo*(Key Laboratory for Chemical Biology&Traditional Chinese Medicine Research,Ministry of Education,Hunan Normal University,Changsha 410081,China)ABSTRACT:Obiective A rapid method for detection of the trace estrogens was developed with the desorp-tion corona beam ionization mass spectrometry(DCBI-MS)technique.Methods The rapid qualitative and semi-quantitative identification of 6 kinds of estrogens,including norethindrone,progesterone,medroxyproge-sterone acetate,levonorgestrel,megestrol acetate and clomiphene citrate in samples was performed by compar-ing MS and MS2 spectra of samples with standard substances by DCBI-MS.Results All of the 6 target mo-lecules were detected within 1 min.Quantification was achieved based on the molecular ion in MS spectra of each analyte.The semi-quantitative analysis for 6 estrogens was reliable.The linear coefficient of megestrol acetate was 0.9471 while progesterone was 0.9998.The LOD of 6 kinds of estrogens were 0.0875,0.045,0.1775,0.05,0.15,0.1 mg/L,respectively.Conclusion Without tedious sample pretreatments,the developed DCBI-MS is simple,rapid,sensitive for screening and semi-quantitative analysis of the estrogens additives in health foods and traditional Chinese patent medicines.KEY WORDS:desorption corona beam ionization mass spectrometry(DCBI-MS);estrogen;rapid detection 第 3 期 廖 鹏,等:解吸附电晕束电离质谱法快速检测微量雌激素 731 1 引 言 雌激素主要由卵巢分泌,对人生殖系统功能起重要的维持作用,同时对人生长发育、形体维持方面有显著功效。如黄体酮可促进排卵并助于受精卵着床,有助孕作用,为妊娠所必需;炔诺酮和左炔诺孕酮有助女性避孕;而甲羟孕酮可用于治疗乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等生殖系统癌症,改善一般状况以及增加患者体重。但是也存在副作用,如奶粉中添加雌激素容易导致儿童性早熟。炔诺酮可使人乳汁分泌减少,并降低乳汁质量,还可能进入乳汁,对哺乳儿产生不良影响;而醋酸甲孕酮可能会干扰人体内分泌、生长发育、免疫系统、生殖系统等正常功能,还可能致癌、致畸1-2。城市女性滥用避孕药,大量使用加入雌激素的美容品,或进食非法添加了雌激素的有关食物、保健品等,都会导致女性体内雌激素水平长期偏高,增加乳腺癌发病概率。2002 年 7 月欧盟还发生了震惊世界的“醋酸甲孕酮污染事件”3。对食品中各种雌激素,现有的检测方法有放射免疫法4、酶联免疫法5、气相色谱法6、高压液相色谱法7、气相色谱/质谱联用法(GC-MS)和液相色谱/质谱联用法(LC-MS),其中包括离子阱质谱8、三重四极杆质谱9和时间飞行质谱10联用方法。这些方法均需要经过繁琐而复杂的样品预处理,其中气相色谱和 GC-MS法还需进行繁琐的衍生化程序,分析效率较低。而敞开式质谱的发展,如 DESI、DART 等11-12技术在无需样品前处理的条件下可对复杂基质样品中痕量待测物进行检测,充分凸显常压质谱快速、简便、准确等优点。解吸附电晕束离子化(desorption corona beam ionization,DCBI)源13-14是较新的一种常压直接离子化技术。DCBI 利用高电场激发受热氦气形成等离子体,在气流和电场的作用下等离子体穿过 DCBI 的环形对电极形成一可见的电晕束。此电晕束将置于样品台上的固体或液体样品进行解吸附并电离,产生的离子被导入质谱仪进行分析。DCBI 源免除了繁琐的样品前处理过程,无试剂消耗等优点,可以实现样品的快速分析。本文利用实验室自制的 DCBI 源,对 6 种在功能保健食品中常见的雌激素药物炔诺酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮和枸橼酸氯米芬进行了快速定性、半定量分析,并与其在 ESI 源下的响应进行对比,以阐明该技术的优越性。2 材料与方法 2.1 试剂与仪器 炔诺酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮和枸橼酸氯米芬标准品(纯度99%,均购自中国药品生物制品检定所,结构如图 1 所示);甲醇 图 1 6 种雌激素的分子结构图 Fig.1 Structure of six kinds of estrogens 732 食品安全质量检测学报 第 4 卷 (HPLC 级,湖南化工研究院精细化工研究所);超纯水系统(美国 Millipore 公司)。标准溶液的制备:精密称取炔诺酮、黄体酮、甲羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮和枸橼酸氯米芬标准品各 0.0100 g,分别置于 9 个 10 mL 容量瓶中,加 5 mL 甲醇,超声 5 min,冷却至室温,甲醇定容至刻度,配制浓度均为 1000 mg/L 的标准储备液。精密量取适量单标储备液,用甲醇稀释成 0.5、5、25、50、100 mg/L 的系列单标标准工作溶液。Thermo Finnigan-LCQ 离子阱质谱,配 LCQ-tune工作站(美国菲尼根公司);DCBI 源(自制),源控制器(岛津分析技术研发有限公司);超声波发生器KQ3200E 型(昆山市超声仪器有限公司);微量进样针(25 L)。2.2 样品制备 空白基质溶液的配制:精密称取一种丸剂(市售保健食品,成份为附子、党参、白术、甘草和干姜)阴性样品 1.0 g,置于 100 mL 容量瓶中,加 50 mL 甲醇,超声 20 min,冷却至室温,甲醇定容至刻度,离心后取上清液备用。混合基质标准溶液的配制:移取 6 种物质的标准储备液各 200 L 于 10 mL 容量瓶中,空白基质溶液定容至刻度,配成浓度为 20 mg/L 的混合基质标准溶液。样品进样方式:液体样品用微量进样针吸取,10 L 进样,处理后的样品均置于 DCBI 源的可见电晕束下进行质谱信号采集。3 结果与分析 3.1 DCBI 源及质量分析器条件优化 以 6 种物质单标的绝对离子强度为标准,对DCBI 源工作电压、解吸附温度等参数进行考察。结果表明以 DCBI 源正离子模式,工作电压 3.5 kV,电离电流 10 A,解吸气(He)流速 0.6 mL/min,载气温度 200 下可以对 6 种药物均获得满意灵敏度。离子阱质谱入口毛细管电压 0 V,毛细管温度 260,管透镜电压 5 V。目标化合物结构信息通过碰撞诱导解离(CID)反应获得,母离子选择宽度为 0.5 Da,碰撞能量依各化合物进行优化。在上述优化的实验条件下,利用 DCBI-MS 对 6 种雌激素进行单标检测,定性分析时间均小于 1 min,检测灵敏度高。3.2 DCBI-MS 快速检测 分别精密量取 6 种物质的标准储备液配成浓度10 mg/L 的标准溶液进行 DCBI-MS 分析。醋酸甲羟孕酮(分子量 386.52)和醋酸甲地孕酮(分子量 384.51)结构相近,分子量相差 2 个单位。图 2 中,在 DCBI源正离子模式下分别形成 m/z 387.42 和 m/z 385.32 的M+H+峰。左炔诺孕酮(分子量 312.45)在 DCBI 源正离子模 图 2 醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮在 DCBI(+)下的一级质谱图 Fig.2 Mass spectra of medroxyprogesterone acetate and megestrol acetate by DCBI-MS 第 3 期 廖 鹏,等:解吸附电晕束电离质谱法快速检测微量雌激素 733 式下形成 m/z 313.47 的M+H+峰,如图 3,选择分子离子 m/z 313.47 进行二级质谱分析,如图 4,调节CID为30%,得到碎片离子有m/z 295.22、m/z 277.24、m/z 245.15、m/z 185.12、m/z 159.09 等,特征碎片离子为 m/z 295.22。而枸橼酸氯米芬(分子量 406.08)则形成 m/z 406.35 的 M+峰,可得到 m/z 370.10、m/z 333.12、m/z 297.19、m/z 269.02、m/z 219.16 等碎片离子,特征碎片离子为 m/z 297.19。黄体酮(分子量 314.46)在 DCBI 源正离子模式下形成质子加合离子峰 m/z 315.43,选择分子离子 m/z 315.43 进行二级质谱分析,如图 5,调节源内 CID 为35%,得到碎片离子有 m/z 297.23、m/z 279.24、m/z 239.15、m/z 215.16、m/z 97.03 等,特征碎片离子为m/z 297.23。而炔诺酮(分子量 298.42)则形成明显的质子加合离子峰 m/z 299.41,选择分子离子 m/z 299.41进行二级质谱分析,如图 6,调节源内 CID 为 33%,可得到 m/z 281.17、m/z 263.19、m/z 223.20、m/z 171.09等碎片离子,特征碎片离子为 m/z 281.17。图 3 左炔诺孕酮和枸橼酸氯米芬在 DCBI(+)下的一级质谱图 Fig.3 Mass spectra of levonorgestrel and clomiphene citrate by DCBI-MS 图 4 左炔诺孕酮和枸橼酸氯米芬在 DCBI(+)下的二级质谱图 Fig.4 Secondary mass spectrometry of levonorgestrel and clomiphene citrate by DCBI-MS 734 食品安全质量检测学报 第 4 卷 图 5 黄体酮在 DCBI(+)下的一级和二级质谱图 Fig.5 MS and secondary mass spectrometry of progesterone by DCBI-MS 图 6 炔诺酮在 DCBI(+)下的一级和二级质谱图 Fig.6 MS and secondary mass spectrometry of norethindrone by DCBI-MS 为考察复杂基质对 DCBI-MS 法快速定性分析的影响,量取 10 L 处理后的空白基质溶液和混合基质标准溶液样品,置于 DCBI 源的可见电晕束下进行质谱信号采集。空白基质和混合基质标准溶液的一级质谱谱图如图 7 所示,基质的引入对 6 种目标化合物的质谱响应影响不大,炔诺酮、左炔诺孕酮、黄体酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、枸橼酸氯米芬分别形成明显的 m/z 299.51、m/z 313.51、m/z 315.49、m/z 385.31、m/z 387.31、m/z 406.40 分子离子峰,杂质峰被目标化合物的分子离子峰压低,所以不影响各目标物的定性检测。第 3 期 廖 鹏,等:解吸附电晕束电离质谱法快速检测微量雌激素 735 3.3 黄体酮和炔诺酮在 DCBI 源和 ESI 源中的响应差异 除枸橼酸氯米芬以外,其余检测的五种物质炔诺酮、黄体酮、醋酸甲羟孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲地孕酮均为甾体类激素,为中低极性化合物,在 ESI离子源下电离比较困难,其中黄体酮和炔诺酮在 ESI源下无响应,但在 DCBI 源下,响应较好。同等浓度(5 mg/L)下黄体酮(分子量 314.46)在 ESI 源正离子模式下几乎看不见其分子离子峰,而在 DCBI 源正离子模式下,黄体酮可形成明显的质子加合离子峰 m/z 315.39。同样,同等浓度下(5 mg/L)炔诺酮(分子量298.42)在 ESI 源正离子模式下也不形成其分子离子峰,而在 DCBI 源正离子模式下,炔诺酮可形成明显的质子加合离子峰 m/z 299.42,在形成炔诺酮M+H+峰的同时,其二聚体离子2M+H+的峰 m/z 597.19也明确检出。由于 ESI 源对样品采取先带电后喷雾的形式,而 DCBI 源采用电晕放电气相离子化,原理类似于 APCI,可增加离子产率,甾体结构化合物容易在 DCBI 源下电离并产生带电荷离子,从而通过质谱进行检测。所以某些化合物存在 ESI 不能检出而DCBI 可以检出的现象,可知 DCBI 对于质谱检测物质的研究和应用是不可或缺的。3.4 DCBI-MS 二级质谱扫描确证与半定量分析 分别将 6 种 1000 mg/L 的雌激素标准储备液稀释成系列浓度,如将黄体酮储备液配制成 0.09、0.9、4.5、9、45 mg/L等浓度进行分析。以分子离子m/z 299.42(炔诺酮)、m/z 315.39(黄体酮)、m/z 387.42(醋酸甲羟孕酮)、m/z 313.47(左炔诺孕酮)、m/z 385.32(醋酸甲地孕酮)、m/z 406.35(枸橼酸氯米芬)进行定量分析。用各物质的萃取离子流图中峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,得出线性方程及相关系数。结果见表 1,线性关系最差的醋酸甲地孕酮 R2=0.9471,而黄体酮的相关系数则为0.9998。选择低、中、高浓度重复进样五次,RSD 值在9.25%62.51%,如黄体酮其 0.09 mg/L 浓度下的RSD 值为 21.13%,而 45 mg/L 浓度下的 RSD 值则为16.79%,因此可视为一种半定量分析方法。图 7 空白基质和混合基质标准溶液在 DCBI(+)下的一级质谱图 Fig.7 Mass spectrometry of a negative samples and a negative samples spiked with drugs by DCBI-MS 表 1 DCBI-MS 方法中 6 种目标物的线性范围和检出限 Table 1 Calibration curves and detection limits of six targets detected by DCBI-MS 化合物名称 线性范围(mg/L)线性方程 相关系数 检出限(mg/L)炔诺酮 0.087521.87 Y=3.4434X6.328 0.9993 0.0875 黄体酮 0.0945 Y=4.6194X+2.9068 0.9998 0.045 醋酸甲羟孕酮 1.77535.4 Y=1.6643X+0.1532 0.9947 0.1775 左炔诺孕酮 0.10927.25 Y=14.23X30.176 0.9876 0.05 醋酸甲地孕酮 1.537.5 Y=0.5891X+2.6106 0.9471 0.15 枸橼酸氯米芬 1100 Y=0.6767X+1.1866 0.9899 0.1 736 食品安全质量检测学报 第 4 卷 DCBI 源是敞开式离子源,进样易受到气流、进样路径、进样速度以及环境温度等的影响,因此定量检测时相对标准偏差都较大,但其能在合理的浓度范围内给出较可靠的定量值。可视 DCBI-MS 为一种半定量分析方法,能为进一步的准确定量分析提供有力的依据。4 结 论 本文建立了 6 种雌激素 DCBI-MS 快速筛选及半定量分析方法。单样检测时,分析时间不超过 1 min。利用一级质谱对 6 种雌激素进行检测,并用分子离子进行半定量分析。6 种目标化合物线性关系良好,最低检测限可达到 0.045 mg/L。该方法无需复杂前处理过程,快速、准确、灵敏度高,适用于不同复杂基质中雌激素的快速检测。鉴于空白基质加标样品的成功检出,可以合理推论该方法适用于检测类似基质样品中非法添加的雌激素。该方法不仅可用于保健食品中违禁药品的检测,对复杂基质样品中其他违禁添加物的检测也有借鉴意义,有望为保健食品中违禁激素类药物的筛查和相关部门的现场执法提供可靠的检测手段。参考文献 1 Sun CH,Peng SG.The effect of environment hormone in meat on human health J.Meat Hyg,1999,1:910.2 Chen XH,Sheng XF,Jin MC.Simultaneus determination of eight progesterone derivatives residues in milk by ultra-fast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry J.Chin J Health Lab Technol,2010,20(11):26712675.3 Gu ZW,Hong Q,Liu ZB.Medroxyprogesterone acetate once again get European into the food safety crises J.Chin J Environ Occup Med,2002,19(5):280.4 Mu H,Li L,Zhou L.Determination for estradiol contents in the powder of blastoderm of mutton by radioimmunoassay method J.Chin Publ Health,2002,18(3):364365.5 Yan XF,Guo ZH,Zuo WX,et al.Detection of clenbuterol in animal feed by ELISA J.Chin J Vet Drug,2003,37(12):1618.6 Wang J,Hu JG,Li JH.Assay 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