湛江地区患病对虾池塘中副溶...型和新型耐药毒株的分离鉴定_吴俊敏.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-056文章编号:2095-1388(2023)01-0059-09湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的 MLST分型和新型耐药毒株的分离鉴定吴俊敏1,2,王艺2,郝婧薇2,王青瑶1,3,张晋1,2,傅松哲1,2,刘鹰1,4(1.设施渔业教育部重点实验室(大连海洋大学),辽宁 大连 116023;2.大连海洋大学 海洋科技与环境学院,辽宁 大连 116023;3.大连海洋大学 水产与生命学院,辽宁 大连 116023;4.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)摘要:为研究湛江地区患病对虾养殖池塘中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的遗传多样性,选择副溶血性弧菌的 7 个管家基因对分离菌株进行 MLST 分型,采用 PCR 法检测 tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1、vcrD2 和 pirAB 毒力基因的携带情况,用纸片扩散法对所有菌株进行药敏试验,选择其中 1 株多重耐药菌株进行全基因组测序,并通过 IslandPath-DIOMB 分析其耐药基因岛来源。结果表明:从患病的对虾池塘水样中共分离出 58 株副溶血性弧菌,通过 MLST 分型共分为 34 个 ST 型;58 株菌株均携带毒力基因 tlh、mam7和 vcrD1,未发现 tdh、trh 和 vcrD2 基因存在,其中,8 株菌株携带引起急性肝胰腺坏死病(AHPND)的毒力基因 pirAB;药敏试验显示,58 株菌株对青霉素耐药率均为 100%,对氨苄西林、克拉霉素和庆大霉素的耐药率较高,其中 ST1740 型的 4 株菌株均为多重耐药,从中选择 ZJ20-3/2020 菌株进行全基因组测序,发现该菌株含有 8 个耐药基因,分别为 blaCARB-41、aadA16、aph(6)-Id、aph(3)-Ib、tet(A)、sul1、dfrA27 和ARR-3,并对青霉素、卡那霉素、四环素和利福平耐药;用 IslandPath-DIOMB 分析发现,ZJ20-3/2020 菌株存在 4 个基因岛。研究表明,湛江地区患病对虾养殖池塘中的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,发现了一个携带 pirAB 的新 ST 型(ST1740)菌株,其携带 4 种来自希瓦氏菌的基因岛且为多重耐药菌株,本研究首次在副溶血性弧菌中发现来自希瓦氏菌属的基因水平转移,这些结果为防治急性肝胰腺坏死病提供了科学依据。关键词:副溶血性弧菌;凡纳滨对虾;药敏试验;多位点序列分型中图分类号:S 917.1;Q 93.3 文献标志码:A 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性菌,广泛分布于世界各地温暖的河口和海洋环境中。近年来,由于海鲜消费的增加,生食或未煮熟海鲜中的副溶血性弧菌正成为急性胃肠炎的主要病因1。2010 年,由副溶血性弧菌引起的凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)急性肝胰腺坏死病(AHPND)在中国首次被发现2-3,随后在越南、马来西亚、泰国和墨西哥等国家的对虾养殖区域也相继发现,严重威胁着全球的对虾养殖业健康发展4-5。在最近的一项研究中,通过对导致出现凡纳滨对虾 AHPND 症状的副溶血性弧菌菌株进行基因组测序,揭示了与 PirAB(PirA、PirB)同源的毒力基因6-7。Tran 等8研究发现,AHPND 病原体是一种特异性的副溶血性弧菌,这种变异菌株因其获得了表达致命毒素(PirAB)的质粒而具有较高的致病性9-10。这些结果表明,PirAB 是导致出现AHPND 症状的主要毒力因子10。除此之外,副溶血性弧菌还拥有许多其他的毒力因子,包括黏附素、热稳定直接溶血素(TDH)及其相关溶血素(TRH)、MAM7、两种型分泌系统(T3SS1 和T3SS2)和两种型分泌系统(T6SS1 和 T6SS2)等11-12。湛江位于中国大陆最南端,因其丰富的海洋资源已成为中国最大的对虾养殖基地,其产量约占全国的 1/513。然而,对该地区对虾养殖池塘内的副 收稿日期:2022-02-26 基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2019YFD0900503);国家自然科学基金(81903372);辽宁省教育厅科研项目(QL202005)作者简介:吴俊敏(1997),女,硕士研究生。E-mail:1159777688 通信作者:傅松哲(1985),男,博士,副研究员。E-mail:fusongzhe 溶血性弧菌遗传多样性一直缺乏系统性研究。邓传燕等14对广东、广西沿海 4 地的鱼苗场取样进行了耐药性分析,发现有 66.7%的菌株同时对 30 种以上抗生素具耐药性,并发现了高耐药菌株。高玉龙等15通过对分离自广东省阳江市养殖区的 88株弧菌进行鉴定和药物敏感试验发现,88 株弧菌属于不同的 13 个种,并且所有菌株均对阿莫西林、四环素等抗生素耐药,同时也显示出多重耐药的性质。马聪等16研究了 20082010 年广东地区 23起副溶血性弧菌暴发患者临床样本和当餐食品分离株的基因型和耐药性,发现 98.6%的分离菌株均携带 tdh 毒力基因。本研究中,通过 20182020年对广东省湛江市和茂名市对虾养殖池塘进行取样,从中分离副溶血性弧菌,并对其进行多位点序列分型(MLST)、毒力基因携带检测情况及耐药性等病原学特性表征,以期为该地区副溶血性弧菌的防治提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料样品:湛江地区凡纳滨对虾养殖池塘的表层水和沉积物。试剂:青霉素、环丙沙星、克拉霉素、氨苄西林、四环素、卡那霉素、红霉素、利福平、庆大霉素、复方新诺明、氧氟沙星和左氟沙星 12 种抗生素药敏纸片购自杭州微生物试剂公司;TCBS 培养基、LB 琼脂培养基、副溶血性弧菌显色培养基和PCR 扩增试剂均购自青岛海博生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1患病对虾池塘水样和底泥的采集分别于20182020 年每年的 5 月和 11 月,在湛江的两个凡纳滨对虾养殖池塘(S1 和 S2)和茂名的一个养殖池塘(Z1)进行取样。采样点坐标分别为 S1(1102397E,210282N)、S2(1105972E,211243N)和 Z1(1109007E,215383N)。分别采集发生急性肝胰腺坏死病的对虾养殖池塘中表层水及沉积物样本。其中,采样点 S1 和 S2 养殖对虾为 3 个月,在养殖期间未换水,水中盐度分别为 1.2 和 1.9,人工投喂饲料,养殖池体积为24 m3;Z1 为全年养殖,不定期换水,水中盐度为13.98,人工投喂饲料。使用水体采集器在池塘四角及中央采集水面表层 0.5 m 处水样各 1.5 L;同时在相同位置,使用采集器采集沉积物样本 200 g装入采集袋中。将采集的所有样品置于 4 冰盒中保存,带回实验室后对水样和底泥样本进行处理。1.2.2 菌株分离纯化在超净工作台上,将表层水样用生理盐水进行梯度稀释后,取 200 L 均匀涂布于 TCBS 琼脂培养基上;取沉积物样本 25 g,加入 225 mL 体积分数为 3%的氯化钠碱性蛋白胨水(361)中增菌 8 18 h,取 200 L 涂布于TCBS 培养基上。将经过处理后的表层水样、沉积物样本置于 37 恒温培养箱内培养 2024 h,观察菌落形态。将培养出的单菌落进行划线纯化,挑取 TCBS 平板上的疑似副溶血性弧菌的蓝绿色单菌落接种到 LB 培养基上,过夜培养后,于-80 超低温冰箱中保存。1.2.3 菌株鉴定 挑取 TCBS 平板上疑似副溶血性弧菌的蓝绿色单菌落,按照 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB 4789.72013 对其进行生化鉴定,生化试验呈阳性的菌株利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取基因组 DNA。对菌株 16S 基因进行 PCR 扩增。PCR 反应体系(共 25 L):DNA 模板 2.5 L,上、下 游引物各 0.5 L,Premix Taq 12.5 L,无菌水 9 L。本试验中用引用信息见表 1,PCR 扩增产物经脉冲场凝胶电泳分析后,选取条带明亮的样品送至生工生物工程(上海)股份 有 限 公 司 进 行 测 序,测 序 结 果 在 NCBI(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对。表 1 本试验中的引物信息Tab.1 Primer information in this experiment目标基因 target引物序列 primer sequence(5-3)16S rDNAF:GAGTTTGATCCTGGCTCAGR:TACGGTTACCTTGTTACGACTTtdhF:CTAAATAGGGCTGTTCGGCTR:GAAAAGGGACAGATGGAAGCtrhF:CTTTTCCTTCTCCAGGTTCGR:CAGAAAGAGCAGCCATTGTGtlhF:AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTGR:GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCmam7F:CTTAGAAAGCATGAGCGCCCTACR:GATGATGGAACCGACCACAATACvcrD1F:ACGCTATTTCGTTTGTCCCTGTCR:GCTTTCTGATTCGGTTTGCTTTTvcrD2F:TATGGCATGTGGTGTCTATTTGR:CGCTACGCAGTGTAGTTTGTACpirAF:TGACTATTCTCACGATTGGACTGL:CACGACTAGCGCCATTGTTA1.2.4 药物敏感性试验采用纸片扩散法,对副溶血性弧菌进行 12 种常见的抗生素药物敏感性试验。挑取纯化培养1824 h 的副溶血性弧菌单菌落06大连海洋大学学报 第 38 卷制成菌悬液,用移液枪吸取 200 L 菌悬液,涂布于 LB 培养基上,将药敏片均匀贴于表面,28 恒温培养箱内培养1824 h 后测量抑菌圈直径。记录各类药物对副溶血性弧菌菌株产生的抑菌圈直径,并根据 CLSI 第三版标准17对结果进行判定。1.2.5副溶血性弧菌毒力基因检测采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取副溶血性弧菌基因组DNA,对分离的 58 株副溶血弧菌进行毒力基因检测,采 用 PCR 对 tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1、vcrD2 和 pirAB 等毒力基因进行检测。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息见表1。PCR 产物于凝胶电泳15 min 后,使用凝胶成像系统分析结果。将明亮条带送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。1.2.6 多位点序列分型 对分离的 58 株副溶血弧菌进行 MLST 分型,首先选择副溶血性弧菌的 7 个管家基因(dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和 tnaA)作为本试验的目的基因,7 个管家基因位点与参数见表 2。引物来源参考 PubMLST 网络数据库,7 对 PCR 引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反应体系(共 25 L)为 Premix Taq 12.5 L,上、下游引物各 0.5 L,模板 2 L,无菌水 9.5 L。PCR 扩增反应条件参照 PubMLST 网络数据库公布的副溶血性弧菌的标准方案进行:96 下预变性 5 min;96 下变性1 min,58 下退火1 min,72 下延伸 1 min,共进行 30 个循环;最后在 72 下再延伸 10 min18。PCR 产 物 送 测 序 公 司 测 序 后,将 序 列 提 交 到PubMLST 官网数据库(http:/pubmlst.org/vparah-aemolyticus/)中进行比对,确定菌株的 ST 型。采用 MEGA 6.0 软件19中的最大似然法进行系统发育分析。1.2.7 基因组 de novo 测序、组装和比较基因组分析 在 58 株分离株中,通过药敏试验发现了 4 株多重耐药菌株,基因型均为 ST1740。对其中的 1 株进行基因组 de novo 测序、组装和比较基因组分析。采用 TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)提取基因组 DNA,将电泳合格的 ST1740基因组 DNA 送至北京诺和基因生物信息技术有限公司,在 Illumina HiSeq 2500 平台进行双末端测序;对 FASTQ 测序文件使用 Trimmomatic 0.36 软件进行质量检测,并将尾端删除得分30 的碱基;使用 SPAdesv 3.2 软件从头组装染色体的重叠群来获得基因组草图,采用在线软件 RAST(http:/rast.nmpdr.org/rast.cgi)对基因组进行注释并归类其功能类别20;利用在线工具 Resfinder(https:/cge.cbs.dtu.dk/services/)确定耐药基因21,采用IslandPath-DIOMB 程序预测基因组岛22。表 2 MLST 分型管家基因位点与参数Tab.2 Locus and parameters of housekeeping gene in MLST typing基因位点gene locus引物序列(5-3)primer sequence(5-3)测序片段长度/bplength of sequenced fragmentsrecAF:GAAACCATTTCAACGGGTTCR:CCATTGATAGCTGTTATACCAAGCACCC767gyrBF:GAAGGBGGTATTCAAGCCAAGCR:GAGTCTACCCTCCACWATGTATA624dnaEF:CGRATMACCGCTTTCGCCCGCCCR:GAKATGTGTGAGCTGTTTGCAT589dtdSF:TGGCCATAACGACATTCTGAGATCCR:GAGCCACCAACGTGTTTATGA478pntAF:ACGGCTACGCAAAGAAAATGCATR:TTGAGGCTGAGCTATACTTGC465pyrCF:AGCAACCGGTAAAATTGTCGR:CAGTGTAAAGAAACCGGCACATTA534tnaAF:TGTACGAAATTGCCACCAAAR:AATATTTTCGCCCGATTCAATCGGA4542 结果与分析2.1 副溶血性弧菌的检出结果20182020 年,从广东省湛江和茂名两个地区受 AHPND 影响的患病对虾养殖池水体及沉积物中共分离出 58 株副溶血性弧菌菌株,2018、2019 和2020 年分别获得副溶血性弧菌 30 株、7 株和 21 株。其中,38 株分离自湛江,20 株分离自茂名。2.2 MLST 分型通过对分离出的 58 株副溶血性弧菌菌株的7 个管家基因进行 MLST 分型,共鉴定出 34 个 ST型。将每个菌株的 7 个管家基因序列合并,用MEGA 6.0 软件构建系统发育树显示,共分为 4 个cluster(图 1)。其中,2018 年分离得到副溶血性弧菌30 株,MLST 分型得到17 种ST 型,包括ST1740、ST1256、ST433、ST2193、ST452、ST2013、ST2192、ST299、ST917、ST1734、ST424、ST215、ST1742、ST2204、ST1513、ST970 和 ST2208;2019 年分离的7 株菌株,可分为 6 种 ST 型,包括 ST558、ST2171、ST180、ST1229、ST1910 和 ST888;2020 年分离的21 株 菌 株,可 分 为 16 种 ST 型,包 括 ST1740、ST558、ST1799、ST180、ST1166、ST1229、ST415、ST1042、ST413、ST2013、ST1160、ST2198、ST414、16第 1 期吴俊敏,等:湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的 MLST 分型和新型耐药毒株的分离鉴定ST1061、ST1481 和 ST1985。不同 ST 型包含菌株数量各不相同。ST917 和ST1740 均 包 含 4个 菌 株,ST180、ST2013、ST1734、ST424 和 ST1513 均包含 3 个菌株,剩余ST 型只包含 1 2 个菌株;34 个 ST 型相对分散,且菌株的基因型多样,同一个 ST 型在不同年份出现,如 ST1740、ST2013 在 2018、2020 年中均有出现,而 ST558、ST180、ST1229 在 2019、2020 年中均有出现(图 1)。MLST 分型结果显示出湛江地区副溶血性弧菌的遗传多样性。图 1 58 株副溶血性弧菌的聚类分析、分型和毒力基因检测 Fig.1 Cluster analysis,typing results and virulence gene detection of 58 strains of Vibrio parahaemolyticus2.3 毒力基因检测tdh 和 trh 是副溶血性弧菌的主要毒力因子,通过 PCR 对 tdh、trh、tlh、mam7、vcrD1 和 vcrD2等毒力基因的携带情况进行检测,并将明亮的样品进行测序。结果显示,58 株菌株均包含毒力基因tlh、mam7 和 vcrD1,未发现 tdh、trh 和 vcrD2 的存在(图 1)。其中,8 株菌株(ZJ-141/2018、ZJ-142/2018、ZJ-143/2018、ZJ20-3/2020、ZJ20-10/2020、ZJ-124/2018、ZJ-125/2018 和 ZJ-126/2018)携带 284 bp 的 pirA(图 2)。MDL2000 marker;1ZJ-141/2018;2ZJ-142/2018;3ZJ-143/2018;4ZJ20-3/2020;5ZJ20-10/2020;6ZJ-124/2018;7ZJ-125/2018;8ZJ-126/2018.图 2 8 株携带 pirA 的副溶血性弧菌琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 8 strains of Vibrio parahaemolyticus carrying pirA26大连海洋大学学报 第 38 卷2.4 副溶血性弧菌的药物敏感性分析从表 3 可见,58 株副溶血性弧菌对青霉素的耐药率为 100%,对环丙沙星、克拉霉素、氨苄西林、四环素、卡那霉素、红霉素、利福平、庆大霉素和复方新诺明 9 种抗生素的耐药率为 5.1%15.5%。其中,对氨苄西林、克拉霉素和庆大霉素的耐药率较高,分别为 15.5%、13.7%和 13.7%。分析表明,64.2%的菌株(包含 ST1740、ST558、ST1166、ST1042、ST2013、ST1160、ST414、ST1061、ST1481 和 ST1958)同时对 2 种以上的抗生素产生耐药性,其中 4 株 ST1740 菌株为多重耐药菌株,对青霉素、氨苄西林、红霉素和复方新诺明 4 种抗生素耐药。表 3 58 株副溶血性弧菌药敏试验结果Tab.3 Drug susceptibility test results of 58 strains of Vib-rio parahaemolyticus抗生素antibiotic耐药(R)resistance中度敏感(I)mediate敏感(S)sensitivity耐药率/%resistance rate青霉素 penicillin5800100环丙沙星 ciprofloxacin313425.1克拉霉素 clarithromycin8232713.7氨苄西林 ampicillin994015.5四环素 tetracycline320355.1卡那霉素 kanamycin6312110.3红霉素 erythromycin318375.1利福平 rifampin418366.8庆大霉素 gentamicin8222813.7复方新诺明 SXT794212.1氧氟沙星 ofloxacin00580左氟沙星 levofloxacin005802.5 1 株多重耐药菌株的测序和比较基因组学分析药敏试验发现,4 株 ST1740 菌株均为多重耐药,且耐药谱相同。因此,本研究中选择其中 1 株菌株 ZJ20-3/2020 进行全基因组测序。结果表明,该基因组为 5.24 Mbp,总的蛋白编码序列(CDs)数目为 5 372,平均 GC 含量为 44.8%。采用在线工具 Resfinder 查找耐药基因,共发现 8 个耐药基因,分别为 blaCARB-41(青霉素抗性基因)、aadA16(卡那霉素抗性基因)、aph(6)-Id(卡那霉素抗基因性)、aph(3)-Ib(卡那霉素抗性基因)、tet(A)(四环素抗性基因)、sul1(利福平抗性基因)、dfrA27(利福平抗性基因)和 ARR-3(利福平抗性基因)。通 过 IslandPath-DIOMB 程 序 发 现,ZJ20-3/2020(ST1740)菌株存在 4 个基因岛。BLAST 检索发现,4 个基因岛均与希瓦氏菌 NCTC12093 中的相应序列具有 99%的 DNA 序列一致性。通过比较基因组学分析表明,ZJ20-3/2020 菌株共有 40 个contigs,4 个基因岛分别位于基因组片段 9、23、25 和 28 位置,其中,两个基因岛含有耐药基因,基因岛 2 编码 aadA16、aph(6)-Id、aph(3)-Ib、tet(A)和 tet(R),基因岛 3 编码 sul1、dfrA27 和ARR-3 等基因(图 3)。3 讨论3.1 MLST 在副溶血性弧菌流行病学中的应用多位点序列分型(MLST)是一种基于所选管家基因序列多态性对病原菌进行分型的通用方法。在这种分型方案中,每个独特的基因片段被分配到一个不同的等位基因号,每个管家基因座的等位基因组合被分类为序列类型(ST)23。Hossain 等24利用该方法研究发现,从美国鲇中获得的嗜水气单胞菌菌株与中国患病草鱼中分离出的嗜水气单胞菌具有高度相似的基因组,表明美国鲇分离株来自亚洲起源的嗜水气单胞菌菌株。因此,这项技术有可能提高研究者对病原体传播的认识,并确定病原体的来源。Fu 等25通过对 20082017 年分离的 233 株副溶血性弧菌菌株的全基因组分析,发现 233 株菌株可分为 84 种 ST 型,并发现 AHPND 的传播模式包括两个步骤,即副溶血性弧菌在养殖区域的传播和其携带的 AHPND 相关质粒在弧菌属间的水平转移,同时也表明副溶血性弧菌菌株具有高度的遗传多样性。孙明玉等9对12 株致病性副溶血性弧菌MLST 分型发现,从广东分离的致病性菌株的新序列型 ST1740 与 ST975 的遗传关系最为相近。王瑶华等26通过 MLST 分型从 16 株 AHPND 致病菌中发现了 9 个 ST 型,其中包含了 2 个未知型和 2 个未报道过致病性副溶血性弧菌的相关序列型。陈伟冰等27通过对茂名市涉水产品中分离出的 44 株副溶血性弧菌菌株进行 PFGE、MLST 分型,发现44 株副溶血性弧菌菌株分为 44 种不同的 PFGE 带型,其中 30 个 ST 型,呈现一定的遗传多样性。本研究中,通过对湛江和茂名地区 58 株副溶血性弧菌菌株进行 MLST 分型,发现了 34 个 ST 型,其中ST1256、ST433、ST2193、ST2192、ST299、ST2198、ST215、ST2204 和 ST970 等 9 个 ST 型菌株在陈伟36第 1 期吴俊敏,等:湛江地区患病对虾池塘中副溶血性弧菌的 MLST 分型和新型耐药毒株的分离鉴定在 ZJ20-3/2020 菌株中发现了 4 个额外外源性的基因岛,如方框图所示。图中绿线表示存在同源关系。基因岛 4 中的数字表示 DNA 相似性。Four additional genomic islands are found in ST1740 strain which is indicated in the box panel.The green line in the figure indicates the existence of a homologous relationship.The number in gene island 4 indicates DNA similarity.图 3 副溶血性弧菌 ZJ20-3/2020(ST1740)菌株及其携带的 4 个来自希瓦氏菌的基因岛Fig.3 Vibrio parahaemolyticus ZJ20-3/2020(ST1740)and its four gene islands from Shewanella冰等27的研究结果中也存在,表明这些 ST 型可能是该地区的主要流行亚型。3.2 副溶血性弧菌毒力基因鉴定副溶血性弧菌可产生几种类型的溶血素,包括耐热 直 接 溶 血 素(TDH)、TDH 相 关 溶 血 素(TRH)和不耐热溶血素(TLH)。TDH 在副溶血性弧菌的致病性中起着至关重要的作用28。然而,TRH 和 TLH 也是副溶血弧菌菌株重要的毒力因子。tlh 基因与 tdh 基因不具有同源性,被认为是副溶血弧菌的特异性基因29,所有的副溶血弧菌都会产生 tlh 基因。为验证对虾养殖池塘是否也存在致病性副溶血性弧菌菌株,本研究中对湛江与茂名地区分离出的副溶血性弧菌进行了毒力基因检测,结果发现,58 株菌株均包含毒力基因 tlh、mam7 和vcrD1,未发现 tdh、trh 和 vcrD2 的存在。本研究结果与 Song 等30和檀利军等31的研究结果一致,这些研究者从患者中分离的大多数临床菌株均携带 tdh 基因,且携带 tdh 基因的环境菌株的检出率远低于临床菌株。近年来的研究也表明,临床来源的副溶血性弧菌分离株中 90%为 tdh或 trh 阳性,而环境来源的分离株中只有 0.2%10%含有 tdh 和 trh 基因30,32。值得注意的是,本研究中 pirAB 阳性检出率为13.8%,其中,ST415、ST424 和 ST1740 型菌株均为阳性(图 1)。孙明玉33通过荧光原位杂交探针法检测到 12 株 AHPND 致病性副溶血弧菌菌株均携带 pirAB。贾丹34对 20132016 年分离自中国沿海地区发病对虾养殖场的菌株进行了分析,发现 pirAB 阳性检出率为 33.11%,出现最多的血清型为 O1 K25(23.33%),其余类型较为分散,无明显优势型。本研究中,pirAB 阳性检出率稍低于前人研究,可能原因是近年来 pirAB 毒力基因正在向亲缘关系较远的非副溶血性弧菌中转移。陈营等35通过对江苏、福建和海南等省的对虾养殖基地样品进行分析,发现副溶血性弧菌中的 pirAB 毒力基因已经向哈维弧菌(Vibrio harveyi)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)转移,也证明了这一推断。3.3 副溶血性弧菌基因组中首次发现来自其他属的基因岛本研究中药敏试验结果显示,58 株副溶血性46大连海洋大学学报 第 38 卷弧菌对青霉素耐药率为 100%,对氨苄西林、克拉霉素和庆大霉素的耐药率较高,对环丙沙星、四环素和红霉素的耐药率较低,64.2%的菌株同时对2 种以上的抗生素产生耐药性,其中,4 株 ST1740型菌株为多重耐药菌株。对其中 1 株 ST1740 型菌株进行了全基因组测序发现,该菌株共含有 8 个耐药基因。本研究中,进一步解析了耐药基因的分布,发现其存在 4 个来自希瓦氏菌的基因岛,其中 2 个基因岛携带了多个耐药基因。这些耐药基因的存在也验证了其多重耐药的表型主要是由基因组中携带的耐药基因所决定。基因的水平转移,特别是耐药基因的水平转移是副溶血性弧菌在养殖环境中进化的重要驱动因素。副溶血性弧菌 O3 K6 血清型大流行的出现与副溶血性弧菌密切相关,其通过连续获得 7 个来自霍乱弧菌(Vibrio cholera)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)的基因岛,最终演变为能适应人体环境的大流行基因型36。致病性弧菌中存在大量来自溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和其他未知来源的基因岛37,但来自希瓦氏菌的基因岛并不常见,仅有少数研究对此进行了报道,如 Efimov 等38通过对以色列鳗鱼养殖场分离的创伤弧菌进行基因组测序,发现其存在 biotype 2型和 biotype 3 型两种基因型。系统发育分析表明,这两种基因型在进化上同源,但 biotype 3 型获得了一个来自希瓦氏菌的基因岛,毒力得到增强。本研究中,在 1 株多重耐药副溶血性弧菌基因组中同时发现其含有 4 种来自希瓦氏菌的基因岛,这是首次在副溶血弧菌中发现来自其他属的基因岛。这可能与养殖过程中大量使用抗生素有关。抗生素的使用提供了一个较强的选择压力,迫使副溶血性弧菌从其他物种获得耐药基因岛,以适应投加不同抗生素的养殖环境。4 结论1)通过对湛江和茂名地区的对虾养殖池塘中分离的 58 株副溶血性弧菌菌株进行分子分型和表型表征,表明该地区对虾养殖池塘中的副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性。2)在 4 株多重耐药菌株中发现了一个携带pirAB 的新 ST 型(ST1740),随后的基因组测序发现,该基因组中携带 4 种来自希瓦氏菌的基因岛,这也是首次在副溶血性弧菌中发现来自希瓦氏菌属的基因岛。耐药基因岛的发现,揭示了菌株获得耐药性的原因。参考文献:1LETCHUMANAN V,YIN W F,LEE L H,et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility of Vibrio parahaemolyticus isolated 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