食品微生物检验新方法简介.pdf

广州食品工业科技 Guangzhou Food Science and Technology Vol.20 No.2(总80)133 中图分类号：Q 9 3；文献标识码：A；文章篇号:1 0 0 7-2 7 6 4(2 0 0 4)0 2-0 1 3 3-0 5 3 食品微生物检验新方法简介 郑东宏（美赞臣（广州）有限公司 广州 5 1 0 0 0 0）摘 要：食品微生物检验技术水平从传统方法的培养水平向新方法的分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，这是微生物检验技术发展的新趋势。本文向大家介绍了近年来微生物检验几种新方法的概念、检验原理、检验仪器等内容。关键词：乳胶凝集反应；聚合酶链反应(PCR)；VITEK-AMS；ATP 生物发光法 食品是人类生命活动中赖以生存的物质基础，人类对食品最基本的要求是“无毒、无害、有营养”。轻工食品行业的生产厂家都要进行产品质量控制，细菌总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等是细菌检验的重要指标。食品卫生微生物鉴定的传统方法有：形态结构、细胞培养、生化试验、血清学分型、噬菌体分型、毒性试验及血清试管凝聚试验等。近年来，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展。1 抗体的方法 抗体方法在食品微生物检验中应用广，根据检测技术的不同又可分为几类：1.1 乳胶凝集反应 这利用抗原与抗体特异性结合的特性,加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。Aureus Test 用于食品样品中金黄色葡萄球菌的检测,该试剂盒中含有对免疫抗蛋白 A Ig G 和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子,因细菌蛋白 A 和 Ig G 结合,凝聚酶和鞭毛抗原结合,所以当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂盒中时 1 min内将产生凝集反应。该法的灵敏度和特异性均较高。1.2 酶联免疫吸附法(ILISA)这是用于定性或定量测定特异抗原抗体的一种技术,它多采用“夹心式”设计,即用抗体包被的聚苯乙烯孔捕获抗原,用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物,再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果。随着单克隆抗体酶联免疫技术的出现,免疫检测法的特异性有了明显的提高。美国肉食动物研究中心最近采用两个与 E.coli 0157H7 鞭毛蛋白发生特异反应的单抗隆抗体 2B7 和 46E9-9 对 收稿日期:2 0 0 4-3-2 9 E.coli 0157 进行特异性检测。2 核酸方法 2.1 基因探针法 基因探针是能识别特异碱基序列(基因)的一段单链 DNA 或 RNA 分子。经标记了的基因探针与靶细胞杂交后能用特定的方法进行检测。2.2 聚合酶链反应(PCR)PCR 是体外选择性扩增 DNA 或 RNA 的技术。它以待扩增的两条核苷酸链为模板,由人工合成的寡核苷酸介导,通过核酸聚合酶促反应快速扩增核酸序列。它具有快速、灵敏、简单和特异等特点，该技术能在短时间内对特定 DNA序列作百万倍扩增。所以，PCR 于 1985 年问世以来,以惊人的速度广泛应用于生物科学的各个领域。2.2.1 应用实例（用 PCR 检测沙门氏菌）（1）引物设计：Rahn 等根据 inVA 基因设计了一对引物，分别命名为引物 139 和引物 141，分别位于inVA 基因的 287312 位和 571550 位，引物序列分别为：引物139：5,GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA3;引物141：5，TCATCGCACCGTCAAAGGAACC3;扩增片段为 284bp。杨瑞馥等根据鞭毛素基因设计了另外一对引物，扩增片段为 300bp。（2）PCR 反应：将可疑沙门氏菌悬于生理盐水中制成菌悬液，按下述操作进行扩增：1PCR 裂解液2l；4dHTP2l；2引物 2l；菌悬液 5l；石蜡油50l；混匀，97?加热 15min，72?加入 1lTag DNA聚合酶稀释液，作用 3min后，进行正式 PCR 循环，Rahn 等的扩增条件为：94?1min，53?2min，72?3min，35 个循环。杨瑞馥等的扩增条件为：94?1min，55?1min，72?1min，30 个循环。最后一次循环后，广州食品工业科技 Guangzhou Food Science and Technology Vol.20 No.2(总80)134 再于 72?延伸 5min。扩增后，电泳观察结果，试验结果表明，PCR 法能检出 107个杂菌污染标本中 35 个沙门氏菌的存在。此外，PCR 技术在食品卫生微生物检验中的应用很广泛，可直接检测标本中的大肠杆菌，检测痢疾杆菌、金葡菌各种毒素、小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌、乳酸杆菌等食品中常见的微生物。利用 PCR检测食品中的微生物，多数情况下因样品中存在着不同程度的干扰因子或抑制因子,影响 PCR 的扩增效率,导致假结果的产生。为克服这一缺陷,可将 PCR 与其它一些化学或分子生物学技术联合使用,以提高反应的特异性。但不能有排除或代替常规微生物检验方法。常规检验方法中如涂片染色镜检,分离培养及生化、血清鉴定,抗原测定以及动物试验等仍然有它们的优势,是目前重要的不可缺少的微生物检验方法,绝对不能用核酸扩增技术来代替一切,这些老方法仍要不断深入研究及改进。3 仪器法 随着微生物快速检测法的不断发展,很多检验技术日趋成熟和完善,并被人们进一步开发、研制成自动或半自动微生物检测仪。3.1 免疫磁性微球 免疫磁性分离技术不但广泛用于医学的各个领域,而且在食品卫生检测方面的应用也见端倪。由于食品检样常为固液多相混合体,采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术,可以达到快速分离的目的。免疫磁性分离方法,是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病微生物发生特异性结合,载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病微生物不但得到分离,而且也得到浓集。免疫磁性分离技术以其特有的性能,在食品卫生检测和研究中取得了较好的结果。食品一旦受到污染,所含微生物种类很多,但能够引起人类疾病的致病微生物所占比例可能很小。单纯将致病微生物分离出来检验,常规方法存在很大的难度。以往多先用选择性增菌培养基进行增菌,使目的菌的数量足够多时,才能在选择性培养基平板上分离出来。从采样到鉴定需要数天。无论是在商检部门还是在临床上食物中毒的救治,检验结果的滞后与事件的紧迫性很不协调。免疫磁性微球的出现和应用,使得上述问题迎刃而解。磁性微球与配体即某种微生物的特异性抗体产生稳定的偶联。检验时可将这种带有特异性抗体的免疫磁性微球加到待检验标本的液体中,相应的微生物就会与抗体发生特异性结合。在较强的外加磁场作用下,结合有这种微生物的磁性微球就会向磁极方向移动,并聚集在容器的内壁。稍后将标本液体移出,撤去磁场,收集磁性微球。可以将微生物从磁性微球上解离下来,或直接进行 PCR 或荧光染色等检验。有些细菌可直接与r3+结合,使菌体产生磁响应性,从而得到分离。免疫磁性分离技术与常规检验方法相比具有显著的优点,可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物,并节省许多时间。3.2 电阻电导检测器 原理是当细菌生产繁殖时，将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质，改变培养液的导电度，这样，测量电阻和导电度的变化，就可推算出样品原来的含菌数。Bactometer是利用电阻抗,电容抗或总阻抗等三种参数的自动微生物监测系统,它能快速测定样品中细菌的污染程度,从而快速提供品质控制的信息。另外,该仪器能通过测定代谢物产生的速度将菌体的数量与其活动相结合,使检验结果达到预测保藏质量和卫生安全的作用。3.3 VITEK-AMS 该系统为用于微生物鉴定及药敏试验的设备,其原理是将微生物数码鉴定的方法与计算机技术结合起来,实现了从读数、编码、解码、打印结果的鉴定全过程的自动化。根据不同的试卡,Vitek 可以鉴定各种革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、奈瑟菌、酵母菌、芽胞杆菌等约 300 余个种(属)的微生物,还可以进行临床细菌的药敏试验。其特点为：（1）鉴定细菌类型广。（2）具有最大的准确性；国内外报导鉴定最常见的细菌准确率 98.4。（3）鉴定时间短。鉴定细菌需610h，鉴定真菌需 1618h。（4）高度可重复性。AMS内的记忆系统，采用计算机处理，可随时补充最新的鉴定程序软件。（5）仪器操作方便，不需要专业细菌人才，只要有一定的英语基础即可短期完成培训。3.4 VIDAS 全自动免疫分析仪 VIDAS 全自动化荧光酶标免疫测试系统的特点和优点为：全自动操作，所有样品的洗涤、结合、基质读数及报告说明等都是全自动操作；快速测定：由样品进入仪器计算，约需 12.5h 即可出结果及报告，容量大，可同时测定 30 个标本。mini-VIDAS 全自动免疫分析仪,具有两个独立的试验仓,每个仓有 6 个通道,可同时进行不同的试验。将增菌的样品液经水浴处理后直接注入仪器的一次性试条中,仪器将在 50 min内显示结果。该仪器现在能检测沙门氏菌,大肠杆菌广州食品工业科技 Guangzhou Food Science and Technology Vol.20 No.2(总80)135 等 6 种常见的致病菌,很适用于检验机构对样品的初筛。3.5 ATP生物发光法 3.5.1 ATP生物发光法的原理、步骤和特点 ATP广泛存在于各种活的生物体中，活的菌体中也有 ATP，细菌死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP将很快被分解掉。因此，通过测定样品的 ATP浓度，即可推算出活菌数。检测步骤包括：棉拭取样、样品ATP萃取、添加荧光素和荧光素酶混合物、测定生物发光量、求出ATP浓度和活菌数。通常，细菌表层有细胞膜和细胞壁包裹，故样品未经处理是不能测定ATP的。测定时需先将样品与微生物用 ATP 提取试剂混合，使细胞膜和细胞壁开孔，提取出 ATP。然后，再与荧光素和荧光素酶生物发光试剂作用，用荧光仪测定 ATP与发光试剂反应的生物发光量。ATP生物发光法的优缺点如表 1 所示。表 1 A T P 生物发光法的特点 优点 缺点 1.可作即时性测定 1.有时灵敏度达不到要求 2.测定范围广 2.受游离 ATP 和体细胞干扰 3.可自动化操作 3.受盐等成分干扰 4.操作简便、快速 4.不能作细菌鉴定 5.可作活性测定 3.5.2 ATP生物发光法存在的问题及其解决方法 如表 1 所示，ATP生物发光法存在的首要问题是灵敏度有时达不到卫生学要求。从灵敏度角度讲，ATP生物发光法要求样品中细菌浓度最低不少于 1000 个/ml，但这种灵敏度有时达不到卫生学要求。另外，在食品细菌学检验时，还可能存在非细菌性 ATP和其他成分干扰的问题。为了提高灵敏度，可采用过滤法和前培养法并用的方法。过滤法的步骤大体如下：采用0.45m的滤膜过滤样品，细菌颗粒和 0.45m 的固体粒子将保留在滤膜上，过滤的样品越多，滤膜上的细菌就越多，即可达到浓缩细菌的效果，提高灵敏度（见表 2）。表 2 样品量、浓缩倍数及细菌检测下限 样品量（ml)浓缩倍数 细菌检出下限（个/ml)0.2 1 1000 2 10 100 20 100 10 200 1000 1 2000 10000 0.1 随着食品、生物技术的发展，检验微生物的方法还将继续推出，继续缩短检验时间,提高检验效率,使检验结果的灵敏度和特异性也有了保证。但这些新方法中仍存在不同程度的假阳性反应，需结合常规微生物检验方法，这些常规方法也随着食品技术的发展不断得到改进。参考文献 1 王祖农主编.微生物学词典.科学出版社,1990:199。2 Y.S.He.American Society for Microbiology.62(9)3325.1996 3 林万明主编.临床基因探针诊断实验技.上海科学技术出版社,3.1 993。4 林万明主编.PCR 技术操作和应用指南.人民军医出版社,1993 5 Rahn K.etal Mol Cell Probes 1992;6:271 6 Ruurd T.Aarsman et al.Applied and Environ-mental Microbiology.59(8)2713.1993。7 Vitek ams operators manual Brief Introduction for New Method in Food Microbe Testing Henry.Zheng(Meadjohnson(GZ)Ltd.,Guangzhou,51000)Abstract:It is the new trend in technology developing for food microbe testing,striding forward molecule level base on incubation level with developing apparatus,automatization and standardization.This article introduces several new methods in microbe testing,focus on concept,principle and apparatus.Keywords:Latex cohesion reaction;PCR;VITEK-AMS;ATP Bioluminescence