UPLC Post Training培训课程_方法转换.pdf

培训教程(方法转换)Waters 中国有限公司培训中心2006 Waters Corporation方法转换从HPLC 到 UPLC2006 Waters Corporation方法转换考虑因素?四种类别的 HPLC 方法转换包括:长柱转换为短柱从一个色谱柱品牌转换到另一个品牌从一个系统转换为另一个不同的系统同时转换系统和色谱柱?方法转换到 UPLC 系统且使用 UPLC 柱时,UPLC的好处才能够完全体现需要同时转换系统和色谱柱2006 Waters Corporation从HPLC 转换到 UPLCAbsorbance 254 nmMinutes02.65.2123Absorbance 254 nmMinutes0102030123原始 30 分钟 HPLC图转换后 5.2 分钟 UPLC图2006 Waters Corporation实现方法转换:HPLC 到 UPLC?UPLC将会同时提高速度、灵敏度和分离度?详细地描述HPLC方法将会大大简化转换过程?系统地转换会得到最好的结果2006 Waters Corporation关于方法转换的特别提示新的方法与结果将会不同于原始的方法和结果2006 Waters Corporation关于方法转换的特别提示?新的UPLC方法可能会与原来的HPLC方法有所不同.操作条件,比如,流速运行时间表现?但是,新的UPLC 方法必须达到HPLC方法的目标要求相关被分析物的完全分离峰纯度确切地鉴别峰定量的准确度和精密度2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息?仪器比较?选择新的或是目标色谱柱色谱柱化学直径?在几何放大的基础上选择目标条件?评估转换的结果?如需要再进行优化2006 Waters Corporation所需的信息:原始方法?色谱柱色谱柱化学(键合配体,品牌,粒径大小)柱内径?色谱条件流动相流速梯度表：包括再生和再平衡温度?样品稀释浓缩分子量进样体积2006 Waters Corporation所需的信息:原始结果?色谱图峰数目保留分离度?定量检测限定量限线性范围准确度精密度2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息?仪器比较?选择新的或是目标柱色谱柱化学直径?在几何放大的基础上选择目标条件?评估转换的结果?如需要再进行优化2006 Waters Corporation仪器比较:溶剂输送?我们假定:溶剂总是以程序所设定的流速流动百分比组成总是以设定值变化梯度按照所设定的梯度表而运行溶剂组成可以按照所设定的时间达到色谱柱2006 Waters Corporation仪器比较:溶剂输送?然而,色谱系统的不同会影响:保留时间灵敏度重新平衡的时间2006 Waters Corporation所需的信息:原始方法?梯度形成的模式配有梯度比例阀的单泵双泵品牌和型号?系统体积(死体积或滞后体积)值和测量所用方法?进样机理?检测模式2006 Waters Corporation例:原始方法?室温:21-22?流速:1.50 mL/min?分析样品:咖啡因(100g/mL)氢化奎尼丁(33g/mL)3-氨基二苯酮(39g/mL)?分子量:小于 500 amu?样品稀释剂:二甲基亚砜(DMSO)?进样体积:10L?检测波长:254nm?流动相:A:0.05%TFA 水溶液B:0.05%TFA 乙腈溶液2006 Waters Corporation例:原始的梯度表116*曲线9551.51525951.53049551.52035951.50起始%B%A流速时间梯度段2006 Waters Corporation例:原始的色谱柱?固定相:XTerra MS C18?粒径:5 m?内径:4.6 mm?长度:150 mm计算:dp150,000 m5 m=30,000L2006 Waters Corporation例:原始的仪器?Waters Alliance 2695 溶剂管理器低压混合的单泵梯度?Waters Alliance 2695 样品管理器?Waters 2487 TUV/254nm2006 Waters Corporation例:原始的结果Absorbance 254 nmMinutes1230102030分离度(1,2)=12分离度(2,3)=282006 Waters Corporation泵的系统体积检测器进样器色谱柱泵 1较小的系统体积=滞后体积泵 2混合器多泵比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送较大的系统体积=滞后体积单泵2006 Waters Corporation柱头梯度混合器系统体积2006 Waters Corporation系统的时间偏差取决于它的系统体积在混合器处的溶剂配比柱头的溶剂配比进样器仪器的系统体积(管路)将会在溶剂组成开始在柱入口端发生改变前引起一定的时间滞后-导致需要维持一段时间的等度 这将有助于你所见到的分离 时间2006 Waters Corporation系统体积的影响原始系统等度维持梯度曲线峰4是梯度洗脱出来的,因此,它比等度洗脱出来的峰更窄14232006 Waters Corporation混合阀位置低 更多的管路体积 更多的时间滞后混合阀位置高 较小的管路体积 较少的时间滞后不同的构造会产生不同的时间滞后2006 Waters Corporation系统体积的影响:较小的系统体积较小体积的系统(较短的等度维持时间)初始系统梯度在峰3完全被等度洗脱之前到达了色谱柱峰3和峰4被压缩到了一起2006 Waters Corporation系统体积的影响:较大的系统体积较大体积的系统(较长的等度维持时间)初始系统峰 4 在等度条件下开始洗脱出来,表现为一个较矮较宽的峰.2006 Waters Corporation不同的系统体积对分离的影响较小体积的系统(较少的等度维持时间)较大体积的系统(较长的等度维持时间)初始系统2006 Waters Corporation仪器对比:溶剂输送?低压混合,单泵流动相靠自动配比(Auto Blend)产生较大的系统体积?高压混合,双泵仅仅是预混合溶剂较小的系统体积最小的扩散?测量原始和目标溶剂输送系统的系统体积2006 Waters Corporation测量系统体积:色谱柱离线启动50%100%渐进线黑线:程序设定蓝线:实际观察%0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.0090.00100.00Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.002006 Waters Corporation系统体积:推荐的测量方法?取下色谱柱?用乙腈作 A相,乙腈加 0.05 mg/mL 尿嘧啶作 B相(排除无添加剂混合与粘度问题)?监测 254nm?使用原始方法的流速和在目标系统上预定采用的流速?采集 100%A相的基线 5分钟?在 5.00 分钟时,设定至 100%B,再收集5分钟的数据?测量在100%A和100%B 处吸光度值的差?测量 50%吸光度差所对应的时间?计算梯度开始与50%点处的时间差?用流速乘以时间差即得到系统体积2006 Waters CorporationAU0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.70Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0050%吸光度=0.3582 AU总吸光度=0.7164 AU测量中点处的吸光度2006 Waters Corporation测量系统体积5.69 min.-5.00 min.0.69 minutes50%实测中点时间=5.69 分钟AU0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.70Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00程序设定时间=5.00 分钟系统体积:0.69min.x 1.5mL/min.=1.04mL2006 Waters Corporation系统滞后测试结果?Alliance 2695=1.04 ml?ACQUITY UPLC=0.109 ml?这将会给方法转换带来什么不同吗?Alliance 2695 使用 4.6 x 150 mm 色谱柱ACQUITY UPLC 使用 2.1 x 50 mm 色谱柱2006 Waters Corporation系统体积的偏差都用柱体积(cv)为单位来描述时间混合点处的溶剂组成柱头处的溶剂组成进样 原始系统目标系统 cvcv2006 Waters Corporation系统体积不同对分离的影响较小的系统体积(等度保持时间较短)较大的系统体积(等度保持时间较长)原始系统2006 Waters Corporation系统体积的偏差?用原始柱的柱体积来描述原始系统的系统体积.这是在梯度开始洗脱样品峰前所必需的等度保持2006 Waters Corporation系统体积的偏差?原始系统测量的系统体积=1.04 mL4.6 x 150 mm 柱体积=2.49 mL系统体积=1.04 mL/2.49 mL=0.42 倍柱体积(cv)2006 Waters Corporation系统体积的偏差?用原始柱的体积来描述原始系统的系统体积.这是在梯度开始洗脱样品峰前必需的等度保持时间?用目标柱的柱体积来描述目标系统的系统体积,这是在梯度开始洗脱样品峰前内置的等度保持时间2006 Waters Corporation系统体积的偏差?原始的 Alliance 2695 系统测量的系统体积=1.04 mL4.6 x 150 mm 柱体积=2.49 mL系统体积=1.04 mL/2.49 mL=0.42 柱体积(cv)?目标 ACQUITY UPLC 系统测量的系统体积=0.109 mL2.1 x 50 mm 柱体积=0.17 mL系统体积=0.109 mL/0.17mL=0.64 柱体积(cv)2006 Waters Corporation用柱体积(cv)来描述不同系统体积的差异混合器中的溶剂组成进样 时间原来的Alliance系统目标的 ACQUITYUPLC系统 0.64 cv0.42 cv2006 Waters Corporation对于不同系统体积的补偿?比较系统体积(用cv来测量)如果目标系统测得一个小于原始系统的等度段?在梯度表中增加一段初始同步时间以便给出同样的梯度同步如果目标系统测得一个大于原始系统的等度段,不作精确的补偿也是合理的,除非该系统具有在实际进样前启动梯度的能力 负同步 2006 Waters Corporation计算初始同步时间?初始同步(柱体积)=原始系统体积 目标系统体积0.42 cv-0.64 cv=-0.22 cv s 初始同步2006 Waters Corporation计算初始同步时间?初始同步(柱体积)=原始系统体积 目标系统体积=0.42 cv-0.64 cv=-0.22 cv s 初始同步(CV)?初始同步体积(mL)=初始同步 cv x 目标柱体积-0.22 cv x 0.17mL=-0.037mL2006 Waters Corporation计算初始同步时间?初始同步(column volumes)=原始系统体积 目标系统体积0.42 cv-0.64 cv=-0.22 cv s初始同步?初始同步体积(mL)=Initial Hold cv x 目标柱体积-0.22 cv x 0.17mL=-0.037mL?初始同步时间=初始同步体积/HPLC 流速=-0.037mL/0.310mL/min=-0.12min.2006 Waters Corporation原始的梯度表116*曲线105150梯度段(分)9.039551.51526.025951.53043.019551.520305951.50Initial梯度段(Col.Vol.)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation缩放梯度曲线-初始同步-0.22-0.1215950.31-0.12梯度同步116*曲线3.331.6750梯度段(min)9.039550.314.9926.025950.319.9043.019550.316.57305950.310Initial梯度段(Col.Vol.)%B%A流速从进样起计时梯度编号?调节流速到 2.1 x 50 保持相同的线速度(几何缩放)2006 Waters Corporation计算 UPLC的初始同步时间?初始同步(柱体积)=原始系统体积 目标系统体积0.42 cv-0.64 cv=-0.22 cv s 初始同步?初始同步体积(mL)=初始同步cv x 目标柱体积-0.22 cv x 0.17mL=-0.037mL?初始同步时间=初始同步体积/UPLC 流速=-0.037mL/0.6mL/min=-0.06min.2006 Waters Corporation缩放梯度表 初始同步时间-0.22-0.0615950.31-0.06初始同步116*曲线3.331.6750梯度段(分)9.039550.314.9926.025950.319.9043.019550.316.57305950.310Initial梯度段(Col.Vol.)%B%A流速时间梯度调节流速到 UPLC 2.1 x 502006 Waters Corporation系统体积的补偿?比较系统体积(用柱体积为单位来测量)?目标系统具有小于原始系统的等度段时在梯度表中增加一段初始同步时间以得到同样的梯度同步?目标系统有大于原始系统的等度段时可以不考虑精确的补偿额外的等度同步的色谱效应通常较小2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息?仪器比较?选择新的或是目标色谱柱色谱柱化学直径?在几何放大的基础上选择目标条件?评估转换的结果?如需要再进行优化2006 Waters Corporation目标柱:ACQUITY UPLC 柱?键合相ACQUITY UPLC BEH C18ACQUITY UPLC BEH Shield RP18ACQUITY UPLC BEH C8ACQUITY UPLC BEH Phenyl?查看色谱柱选择性表找到与之前的柱子最相近的2006 Waters CorporationACQUITY UPLC 柱ACQUITY UPLC BEH C18ACQUITY UPLC BEH C8ACQUITY UPLC BEH Shield RP18Waters 专利技术(氨基甲酸酯极性基团嵌入)ACQUITY UPLC BEH Phenyl2006 Waters Corporation配体选择性紫海胆中的咖啡酸衍生物Minutes0.001.002.003.004.005.0012453BEH C18BEH C8BEH Shield RP18BEH Phenyl1245312453124532006 Waters CorporationWaters Symmetry C18-甲醇Minutes102030400阿米替林二氢苊对羟基苯甲酸丁酯心得安萘尿嘧啶19942006 Waters Corporation用来测量残留硅羟基活性的组分?二氢苊(中性组分)的保留取决于填料中化学键合相的疏水性填料的疏水性越高,保留因子(k)值越高.?阿米替林2006 Waters Corporation用来测量残留硅羟基活性的组分?二氢苊?阿米替林(碱性组分,pka=9.4)的保留取决于两个因素:化学键合相的疏水性和残留硅羟基的活性及浓度(碱性化合物较难分析的一个很好的例子)2006 Waters CorporationWaters SymmetryC18-甲醇k二氢苊=(tr二氢苊-to)/tok二氢苊=18.69totr二氢苊Minutes102030400阿米替林二氢苊保留因子(k)2006 Waters CorporationWaters SymmetryC18-甲醇Minutes102030400阿米替林二氢苊=k 阿米替林/k 二氢苊=1.15相对保留因子()计算2006 Waters Corporation残留硅羟基活性的测量结果时间(分)50传统 C18现代 C18中性化合物碱性化合物中性化合物碱性化合物0较大的 较小的?较大的相对保留因子()表明很高的硅羟基影响?较小的相对保留因子()表明较小的硅羟基影响两种柱子具有相同的疏水性2006 Waters Corporation柱选择性对比表(甲醇)-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5(ln amitriptyline/acenaphthene)(ln k acenaphthene)硅羟基活性降低疏水性增加Symmetry C18ln k二氢苊=2.93ln 阿米替林/二氢苊=0.142006 Waters CorporationWaters SpherisorbODS2-甲醇ln k 二氢苊=2.69ln 阿米替林/二氢苊=1.91Minutes501001500阿米替林二氢苊对羟基苯甲酸丁酯心得安萘Symmetry 在25 分钟高 Phase Separations,19782006 Waters Corporation-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.5柱选择性对比表(甲醇)(ln 阿米替林/二氢苊)(ln k 二氢苊)硅羟基活性降低疏水性增加SymmetryC18Waters SpherisorbODS22006 Waters CorporationACQUITY UPLCBEHXBridgeShield RP18第二代杂化颗粒技术允许 HPLC 方法首先转化为XBridge 柱的方法(基于选择性考虑),然后再有效地转换到 UPLC.反相柱选择性表YMC-Pack ODS-AYMC Jsphere ODSH80ACQUITY UPLCBEHXBridgeC18(ln k acenaphthene)SunFire C18YMC-Pack PolymerC18Hypersil CPS CyanoYMC-Pack CNWaters Spherisorb S5 PHypersil BDS PhenylNova-Pak PhenylYMC-PackPhenylHypersil PhenylInertsil Ph-3YMC-Pack Pro C4YMCbasicSymmetry C8YMC-Pack Pro C8Nova-PakC8XTerraMS C18Symmetry C18YMC-PackPro C18Inertsil ODS-3Nova-PakC18YMC JsphereODSL80Nucleosil C18Waters Spherisorb ODS2Waters Spherisorb ODS1Resolve C18Bondapak C18YMC-Pack ODSAQYMC Jsphere ODSM80Inertsil CN-3Waters Spherisorb S5CNNova-Pak CN HPSymmetryShield RP8SymmetryShield RP18XTerra RP8XTerra RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5(ln amitriptyline/acenaphthene)XTerraMS C8Luna C18(2)XTerraPhenylLuna Phenyl HexylChromolithTMRP-18AtlantisdC18Zorbax XDB C18ACT Ace C18Zorbax SB C18SunFire C8LunaC8(2)ACQUITY UPLCBEH XBridgeC8ACQUITY UPLCBEH XBridgePhenyl2006 Waters Corporation现代“C18区域”(ln k acenaphthene)XTerraMS C18Hypersil Elite C18Inertsil ODS-3Hypersil HyPurity Elite C18Luna C18YMC-Pack Pro C18Zorbax Eclipse XDB C18Zorbax Rx C18Prodigy C18Symmetry C18SymmetryShield RP18Supelcosil LC-ABZ+PlusSupelcosil LC DB-C18XTerra RP18Luna C18(2)Polaris C18-A-0.200.20.40.60.811.522.533.5(ln amitriptyline/acenaphthene)1.01.2AtlantisdC18YMC-Pack ODSAQ放大图ACQUITY UPLCBEHXBridge C18 ChromolithTMRP-18Nucleosil C181.5SunFire C8SunFire C18ACQUITY UPLC BEHXBridgeShield RP18ACQUITY UPLCBEHXBridge PhenylACQUITY UPLCBEHXBridge C82006 Waters Corporation目标柱的规格?内径?通常用 2.1mm?只有在特殊情况下用 1.0mm 严格的样品限量流路直接接至MS?柱长如果主要目标是速度?以50 mm 柱长为起点(L/dp=29,500)如果主要目标是分离度?以100 mm 柱长为起点(L/dp=58,900)2006 Waters Corporation目标柱规格 ACQUITY UPLC柱?从 4.6 x 150 mm XTerra MS C18(5 m颗粒)柱缩放到2.1 x 50 mm ACQUITY UPLC BEH C18 柱(1.7 m 颗粒)2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息?仪器比较?选择新的或是目标柱色谱柱化学直径?在几何放大的基础上选择目标条件?评估转换的结果?如需要再进行优化2006 Waters Corporation目标条件:参数?参数流动相温度几何缩放?进样量?流速?等度方法只需要调整流速和进样量?梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化2006 Waters Corporation目标条件:流动相?用完全相同的流动相添加剂pH离子强度有机溶剂组成百分比?只有在评估几何转换之后需要优化时再做修改2006 Waters Corporation目标条件:温度?温度直接影响每一个色谱机理?在方法转换当中温度一定要保持一致?溶剂预热是必需的溶剂在原来柱中的时间是1.66分钟溶剂在优化的目标柱中的时间是15秒热传递的时间很少?ACQUITY UPLC 柱稳定装置可用于调谐大约0.5 到 0.75 mL/min的流速2006 Waters Corporation溶剂预热的影响Absorbance 254 nmMinutes01.53.0黑色=带柱稳定装置蓝色=不带柱稳定装置注意:对于不同峰的影响不同2006 Waters Corporation目标条件：进样量?用完全相同的样品同样的浓度同样的稀释倍数?计算对应于柱体积的进样体积2006 Waters Corporation进样体积不变的缺点4.6 x 150 mm2.1 x 50 mm20 L 进样量/2.49 mL=0.8%20 L 进样量/0.17 mL=12%2006 Waters Corporation计算进样体积缩放 10 L 进样量从 4.6 x 150 mm到 2.1 x 50 mm目标进样体积=原来的进样体积 X目标柱体积原始柱体积0.0680.172.49=10 L x3.14 x 1.12 x 503.14 x 2.32 x 150=10 L x10 L x=0.7 L2006 Waters Corporation目标条件：进样量?用同样的样品同样的浓度同样的稀释倍数?计算对应于柱体积的进样体积建议在ACQUITY UPLC 上的最小进样体积为0.5-1L如果计算出的进样体积太小?用起始强度的流动相稀释5-10倍在2.1 x 50mm 柱上最大进样体积为5L2006 Waters Corporation目标条件：流速?调节流速,由于线速度一定,因此流速与柱内径的平方成比例?对于小颗粒的填料可调节线速度2006 Waters Corporation几何缩放流速的计算1.5 mL/min.X 2.124.62=0.31 mL/min.缩放 1.5 mL/min 流速从4.6x150mm 到2.1x50mm目标流速=原始流速 x r2目标 r2原始简化为:目标流速=原始流速 xd2目标d2 原始2006 Waters CorporationWaters 制备计算器2006 Waters Corporation进样体积和流速:用制备计算器测定2006 Waters Corporation目标条件:流速?与柱内径平方成比例地调节流速,保持线速度不变?对于小分子,调节线速度2006 Waters Corporation几何缩放流速:相同的线速度2006 Waters Corporation几何缩放流速:相同线速度2006 Waters Corporation传统的流速“加倍”2006 Waters Corporation等度分离2006 Waters Corporation等度分离2006 Waters CorporationHPLC 条件2006 Waters Corporation计算2006 Waters Corporation等度 UPLC 条件比传统的“双倍”流速略高一点2006 Waters Corporation目标条件:梯度表?以柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间?将每一分段计算为一定数量的柱体积?计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间?计算在UPLC 的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间2006 Waters Corporation原始的梯度表116*曲线9551.51525951.53049551.52035951.50Initial%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation原始的梯度表116*曲线105150梯度段(min)9551.51525951.53049551.520305951.50Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation梯度段:用柱体积来描述对于1.5mL/min 在 4.6 x 150mm 柱上运行15分钟梯度体积=流速 x 时间=1.5mL/min x 15min=22.5mL柱体积=x r2x L =3.14 x 2.32 x 150 =2.49mL梯度段(cv)=梯度体积柱体积22.5 mL2.49 mL=9.03 cv梯度段=2006 Waters Corporation原始的梯度表116*曲线105150梯度段(min)9.039551.51525951.53049551.520305951.50Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation原始的梯度表116*曲线105150梯度段(min)9.039551.51526.025951.53043.019551.520305951.50Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation目标条件:梯度表?以柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间?将每一分段计算为一定数量的柱体积?计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间?计算在UPLC 的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间2006 Waters Corporation几何缩放116*曲线0梯度段(分)9.039550.3126.025950.3143.019550.31305950.310Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度?缩放到 2.1 x 50 mm 柱,在 0.31 mL/min流速下2006 Waters Corporation缩放梯度分段时间保持同样的梯度段(cv)?原始步骤2:15 min 以1.5 mL/min梯度段9.03cv?计算目标步骤 2:?min 以 0.31 mL/min保持梯度段(9.03cv)?目标柱体积(2.1 x 50)=0.17mL?梯度分段体积=梯度段(cv)x 目标柱体积=9.03cv x 0.17mL=1.54mL?梯度分段时间=梯度分段体积/流速=1.54mL/0.31 mL/min=5 min2006 Waters Corporation转换梯度表到2.1x50 mm柱?在相同线速度下调节流速到 2.1 x 50mm柱116*曲线5.00梯度段(分)9.039550.31526.025950.3143.019550.31305950.310Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation转换梯度表到2.1x50 mm柱116*曲线3.331.675.00梯度段(min)9.039550.31526.025950.3110.0043.019550.316.67305950.310Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度?在相同线速度下调节流速到 2.1 x 50mm柱2006 Waters Corporation梯度分离2006 Waters CorporationUPLC 梯度分离2006 Waters CorporationHPLC 方法信息2006 Waters CorporationHPLC 梯度方法2006 Waters CorporationHPLC 梯度方法2006 Waters CorporationHPLC 梯度方法2006 Waters Corporation计算2006 Waters CorporationUPLC 方法2.1 mm ID1.0 mm ID2006 Waters Corporation几何缩放到 UPLC 方法2006 Waters Corporation2.1 x 50 mm 几何缩放2006 Waters Corporation调整梯度表到2.1x50 mm柱116*曲线3.331.675.00梯度段(分)9.039550.31526.025950.3110.0043.019550.316.67305950.310Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度?在相同线速度下调节流速到 2.1 x 50mm柱2006 Waters Corporation目标条件:梯度表?以柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间?将每一分段计算为一定数量的柱体积?计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间?计算在UPLC 的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间2006 Waters Corporation估算优化的UPLC流速?考虑 1.7 m 目标颗粒(2.1 mm ID 柱)?假定温度和粘度可以传递?根据 van Deemter 曲线和近似分子量调节流速 0.6 mL/min 对于小分子?平均 500 dalton(分子量)的分子 0.1 mL/min 对于大分子(因为扩散较慢)?例如,2,000 dalton 肽2006 Waters Corporation色谱原理:质量传递/扩散多孔颗粒被分析物分子流动相吸附平衡与谱带展宽相关的扩散2006 Waters Corporationvan Deemter 曲线/1500 da 肽肽00.00050.0010.00150.0020.002500.020.040.060.080.10.120.140.160.180.2u cm/secH cm3.5um 填料1.7um 填料250 L/min2.1 mm 柱25 L/min2.1 mm 柱2006 Waters Corporation增加线速度-UPLC2006 Waters CorporationUPLC 转换?转换到 2.1 x 50 mm 流速 0.6 mL/min116*曲线0梯度段(分)9.039550.626.025950.643.019550.6305950.60Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation缩放梯度分段时间保持同样的梯度段(cv)?原始步骤2:15 min 以1.5 mL/min梯度段9.03cv?计算目标步骤 2:?min 以 0.6 mL/min保持梯度段(9.03cv)2006 Waters Corporation缩放 UPLC 流速梯度时间以维持梯度段不变(cv)?原始步骤2:15 min 以 1.5 mL/min梯度段 9.03cv?计算目标步骤 2:?min以0.60 mL/min 保持梯度段(9.03cv)?目标柱体积(2.1 x 50)=0.17mL?梯度区间体积=梯度段(cv)x 目标柱体积=9.03cv x 0.17mL=1.54mL?梯度区间时间=梯度区间体积/UPLC 流速=1.54mL/0.60 mL/min=2.61min2006 Waters CorporationUPLC 转换?转换到 2.1 x 50 mm 柱 UPLC 流速 0.6 mL/min116*曲线2.610梯度段(分)9.039550.62.6126.025950.643.019550.6305950.60Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters CorporationUPLC 转换?转换到 2.1 x 50 mm 柱 UPLC 流速 0.6 mL/min116*曲线1.74 0.872.61 0梯度段(分)9.039550.62.6126.025950.65.2243.019550.63.48 305950.60Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation计算2006 Waters CorporationUPLC 方法2.1 mm ID1.0 mm ID2006 Waters Corporation用传统的“加倍”法转到UPLC方法2006 Waters Corporation增加线速度-UPLC2006 Waters Corporation用传统的“加倍”法转到UPLC方法UPLC 流速 0.6 ml/min2006 Waters Corporation用传统的“加倍”法转到UPLC方法2006 Waters CorporationUPLC 转换?转换到 2.1 x 50 mm 柱 UPLC 流速 0.6 mL/min116*曲线1.74 0.872.61 0梯度段(分)9.039550.62.6126.025950.65.2243.019550.63.48 305950.60Initial梯度段(cv)%B%A流速时间梯度2006 Waters Corporation优化到 UPLC:方法选择2006 Waters Corporation优化到UPLC:相同峰容量时的最短分析时间2006 Waters Corporation相同峰容量的最短分析时间2006 Waters Corporation优化到 UPLC相同时间内最大峰容量2006 Waters Corporation相同时间内最大峰容量2