进出口化妆品眼刺激性试验--体外中性红吸收法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法犗 犮 犮 狌 犾 犪 狉 犻 狉 狉 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀狋 犲 狊 狋 狅 犳 犮 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犖 犲 狌 狋 狉 犪 犾 狉 犲 犱狌 狆 狋 犪 犽 犲犪 狊 狊 犪 狔 狊 犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本部分按照 给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：史喜菊、马贵平、曾静、程树军、李冰玲、李炎鑫、刘全国、刘旭辉。犛 犖犜 进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法范围本部分规定了用体外中性红吸收法检测化妆品眼刺激性潜力的操作方法。本部分适用于可溶性表面活性剂和以表面活性剂为基础的化妆品原料及配方产品。本部分适用于眼刺激性较弱的产品测试，对于难溶、易挥发、有色和对溶酶体有反应的物质不适用。本部分是化妆品眼刺激性潜力的预筛选试验，可作为体外眼刺激试验组合方法或系列方法的一部分，对化妆品的眼刺激性进行最终分类。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 化妆品体外替代试验实验术语、定义和缩略语 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。细胞成活力细胞群体总活性的度量参数，在此以 处的光吸收值（）表示。相对细胞成活力被试物 质 细 胞 成 活 力 与 阴 性 对 照 细 胞 成 活 力 的 比 值，在 此 以 处 的 相 对 光 吸 收 值（）表示。缩略语下列缩略语适用于本文件。：细胞培养液。：中性红。：二甲基亚砜。：磷酸盐缓冲液（细胞洗涤液）。：十二烷基磺酸钠。：能使 细胞对中性红的吸附能力减少 的被试物质的浓度。犛 犖犜 方法原理化妆品的眼刺激性是评价化妆品卫生质量的一项重要毒理学指标，通常情况下，对眼睛有损害的物质也可以产生细胞毒性效果，因此可通过测试细胞毒性大小反映受试物的眼刺激性。中性红是细胞活力标记物，可以被活细胞吸附并在细胞溶酶体中积蓄，当细胞表面或溶酶体膜改变时，导致中性红吸附减少。死细胞不能积蓄中性红，故不被染色。因此，化妆品体外眼刺激性试验中性红吸收法（，）是通过检测化妆品对小鼠成纤维细胞（）吸附中性红能力的抑制效果，由此反映受试物对细胞膜结构、细胞器功能、物质和能量代谢以及由此导致的细胞增殖和存活力的影响，据此推测其眼刺激性强度。在该试验中，细胞先与受试物孵育，再加入中性红染料继续孵育，加入中性红解除物质溶解细胞中的结晶物终止反应，在波长 测定其吸光度值（），由浓度 反应曲线测得吸光度降低 的受试物浓度，即 作为毒理学评价指标。设备 培养箱（，）。恒温水浴箱（）。酶标仪。振荡器。超纯水仪。超净工作台（无菌操作）。倒置显微镜。全自动血球计数仪。微量可调移液器（、）及相应的吸头。试剂和材料 试验用细胞本部分推 荐 使 用 小 鼠 成 纤 维 细 胞 系 ，来 源 于 美 国 培 养 物 保 藏 中 心（，）或欧洲细胞培养物保存中心（，）。应该定期检查细胞是否被支原体污染，尽可能使用传代次数最低的 细胞系，通常要小于 代。培养的适宜条件为 、的湿环境下温育。细胞洗涤液配制见 。细胞培养液配制见 。处理培养液配制见 。犛 犖犜 中性红培养液配制见 。中性红解除物配制见 。阳性对照阳性对照为 ，一般做个稀释度，分别为 、和 ，每个稀释度做个重复（浓度曲线图参见附录）。阴性对照阴性对照为不加被试物质对照，其余处理相同，做个重复。空白对照细胞培养液对照，在 孔板的周围孔中只加入细胞培养液。被试物质被试物质应在使用前制备，溶解在处理培养液里，也可以用 或乙醇作为溶剂溶解被试物；必要时，可以使用涡旋混合器或超声波处理或 加热等来帮助溶解。被试物以 倍的最终浓度溶解在适当溶剂里（被试物质的最大浓度不能超过 ，最高浓度的 范围应该在 ），再用处理培养液稀释，培养液中溶剂的终浓度要维持在（体积分数）的恒定水平。一般要求做个浓度稀释，首次测试时浓度范围要广，从 ，此后可以缩小范围，从 ，每个稀释度做个重复。试验步骤 用细胞培养液准备浓度为 细胞 的细胞悬液，在 孔板的周边孔中只加培养液（孔）作为空白对照。其余孔中加入细胞悬液（孔），使细胞终浓度达到 细胞孔。于 、条件下培育，至细胞长成单层。弃掉培养液，每孔加入 （）洗涤次。再分别于相应孔内加入个稀释度的被试物质及阳阴性对照（孔），每个稀释度要做个重复。于 、条件下继续培养。在倒置显微镜下观察细胞，记录因被试物的细胞毒效应引起的细胞形态学变化。每孔加入 洗涤细胞，轻轻移去洗液；再分别于每孔加入 含中性红的培养液，于 、条件下继续培育。培育结束后，移去中性红培养液，每孔加入 洗涤细胞。弃掉洗涤液，每孔加入 中性红解除物（乙醇乙酸溶液），持续振荡 ，直至中性红被吸附形成均匀的溶液。测量终溶液 处光密度值（，以 为参照），与没有用被试物质处理的对照样品比较，根据浓度 反应曲线推断，计算能抑制 中性红吸附的被试物质的浓度，该 值就是毒性终点（表示为 或者 ）。犛 犖犜 结果评价 数据处理每个样品的最终 值都要从原始值中减去空白对照孔的 值以减小背景误差。采用式（）计算平均值：犖（）式中：平均 ；各个重复 之和；犖 重复个数。采用式（）计算相对值：（）式中：相对 ，；被试物质的平均 ；阴性对照的平均 。犐 犆 的计算以被试物质各个浓度为横坐标、相对 值（）为纵坐标做浓度 反应曲线，从曲线上计算使 值等于 时所对应的被试物质的浓度即为该物质的 值（）。结果有效性判定阴、阳性对照满足下述条件时，该试验才有效：）阴性对照的 。）阳性对照（）的 ，的置信区间在 范围内。结果解释眼刺激物细胞毒性结果的解释是通过与阳性对照值的比较来预测眼刺激性潜力的相对大小。因此，本实验的结果主要用于眼刺激性及其刺激潜力的预测或筛选，不能作为眼刺激性的最终判定依据，需要与其他眼刺激试验的体外方法组合测试，才能对化妆品的眼刺激性潜力进行最终分类。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）试剂的配制犃 无犆 犪、犕 犵离子的犘 犅 犛洗涤液（犿 狅 犾犔，狆 犎 犘 犅 犛）加蒸馏水至 犃 细胞培养液（含 新生牛血清）按三蒸水袋（）溶解粉剂（产品），过滤除菌，分装保存。使用前加入双抗（终浓度为 青霉素，链霉素），加入 新生牛血清，并用 溶液调节 值至 左右。犃 处理培养液（含新生牛血清）按三蒸水袋（）溶解粉剂（产品），过滤除菌，分装保存。使用前加入双抗（终浓度为 青霉素，链霉素），加入新生牛血清，并用 溶液调节 值至 左右。犃 青链霉素液（双抗）在无菌室内将青霉素 、链霉素 溶于 灭菌水中，分装于小瓶，保存备用。犃 新生牛血清（犉 犆 犛）灭活 ，分装，保存备用。犃 犖 犪 犎 犆 犗溶液 溶于 灭菌双蒸水，经 蒸汽灭菌 ，冰箱保存备用。犃 中性红储存液（犿 犵犿 犔）中性红 蒸馏水犛 犖犜 用前配制，室温避光保存个月。犃 中性红培养液（犵犿 犔）中性红储存液 （含新生牛血清）使用前应该将中性红培养液在 过夜孵育，并以 犵离心 以去除中性红晶体。犃 中性红解除物（乙醇乙酸溶液）冰醋酸乙醇 蒸馏水 使用前配制，储存时间不能超过。犃 犇犕 犛 犗分析纯级犃 冰醋酸分析纯级犃 乙醇分析纯级犛 犖犜 附录犅（资料性附录）犛 犇 犛浓度反应曲线图犅 犛 犇 犛浓度反应曲线犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口化妆品眼刺激性试验体外中性红吸收法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷印数 书号：定价 元