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固相萃取技术及其应用 Solid-phase Extraction and its Applications 华运有限公司市场销售部 陈小华 博士 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 2目 录 再版序 4 一.引言 5 一.固相萃取的基本原理 8 吸附剂和分析物之间作用力 .8 非极性作用力 .8 极性作用力 .9 离子作用力 .10 多种作用力 .14 三.固相萃取的基本程序 15 萃取柱的预处理 .15 样品的添加 .15 萃取柱的洗涤 .15 萃取柱的干燥 .15 分析物的洗脱 .15 极性指数 .15 溶剂强度 .15 溶剂选择性 .15 固相萃取中应当考虑的几种作用力 .20 建立固相萃取方法 .20 评估萃取问题 .20 评估分析的要求 .22 评估样品的特性 .22 建立初步的萃取方法 .26 建立SPE方法的实例 .30 四.新型固相萃取材料 35 混合型硅胶固相萃取柱 .35 聚合树酯固定相 .35 薄膜型固相萃取柱 .36 固相萃取膜 .39 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 3超临界固相萃取 .39 固相微萃取 .39 五.固相萃取柱的重复使用 .40 六.固相萃取中常见的问题及解决方法 .41 七.固相萃取的自动化 .44 吉尔森自动化固相萃取系统 45 吉尔森固相萃取仪在方法优选中的应用 .50 八.部分固相萃取应用方法 .52 滥用药物的固相萃取 52 常见药物的固相萃取 .55 自动在线SPE-GC/MS萃取分析马尿中的药物 .64 有机磷杀虫剂的SPE固相萃取 .65 有机氯杀虫剂的萃取 .65 非脂肪海水鱼食品中有机氯杀虫剂残留的固相萃取 .66 除草剂固相萃取 .67 氨基甲酸酯杀虫剂的固相萃取 .68 新鲜水果和蔬菜中90种杀虫剂残留的固相萃取 .71 蜂蜜中杀虫剂的固相萃取-气相色谱分析 .75 残留氯霉素(Chloramphenicol)的萃取 .77 动物组织及蛋类中抗菌素的萃取 .81 蜂蜜中磺胺类药物的萃取及分析 .81 克喘速(盐酸克仑特罗)及舒喘宁(沙丁胺醇)残留的检验 .82 水溶液中蛋白质的萃取及浓缩 .84 水溶液中免疫球蛋白G（IgG）的萃取 .84 从血红细胞中萃取血色素 .85 合成寡合苷酸的萃取及纯化 .86 附录一 .87 附录二 .93 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 4再版序 在化学分析和生物工程中，样品前处理或净化是一个急待解决的问题。据统计，人们常常将 60%的时间花在样品处理上。这不但不符合高效率的要求，繁琐的传统样品处理方法也直接影响了最后的分析结果。从八十年代中期固相萃取技术就开始在国外流行，并逐步取代传统的液-液萃取技术。经过多年的发展，固相萃取技术在国内也越来越引起人们的重视，固相萃取技术在样品前处理中的角色也显得日益重要。目前在国际上，固相萃取技术已广泛应用于医药、临床血中药物浓度监测、刑事化验、检验检疫、环保、水质、食品领域中的样品前处理。值得注意的是在生物技术和生物工程领域，人们也开始使用固相萃取技术进行生物样品的纯化。而且，自动化固相萃取仪也越来越被广泛使用，如吉尔森公司生产的ASPEC XL 系列固相萃取系统已经成为包括奥林匹克运动会检测中心在内的许多实验室必备的样品前处理仪器。本人曾于八十年代末九十年代初在荷兰 GRONINGEN 大学药学院研究固相萃取技术在药物分析上的应用，十分希望能把这一技术推广给广大的中国同行。由于工作关系我经常在国内许多单位进行固相萃取及其自动化的技术讲座，得知国内在这方面的详细中文资料太少，许多参加讲座的实验室技术人员都要求我能够提供固相萃取的书面资料。故此，我整理了这本小册子。这本小册子的目的在于抛砖引玉，希望能对国内的同行在实际应用固相萃取技术有所帮助。本册资料面世后得到国内许多同行的认可。由于印刷数量有限，供不应求，我们决定再版印刷，希望能够满足各地的需求。本次再版在内容上进行了必要的修改，并且适当增加了应用方法的篇幅。各位如对本资料有任何意见，我们十分欢迎通过各种渠道向我们提出，以便今后改进。本册资料所提供的资料仅供参考之用，本人及本公司对所有方法不负任何责任。特此声明。陈小华博士 2004 年 4 月于香港 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 5一.引言 在分析化学中，样品前处理是一个十分重要的步骤。样品前处理的好坏不仅直接影响最终分析结果，而且还会影响分析仪器的使用寿命。许多分析化学工作者已经认识到样品前处理的重要性，人们在不断研究，改进样品前处理的方法，使之准确、有效、简单、快速。在生物技术领域，特别是在蛋白质组的研究中，能否快速、有效地分离目标蛋白质已经越来越引起人们的注意。样品的前处理可分为一般液体处理和分离提取：A.一般液体处理 1.液体的转移 2.液体的稀释 3.液体的混合 4.标准物的添加 B.分离提取 1.液-液萃取法 2.蒸馏法 2.膜透析法 4.离心/过滤法 5.固相萃取法 6.微波法 7.超声波/离心法 8.超临界液体萃取法 9.生物样品的特殊制备法(水解,蛋白沉淀等)10.加速溶剂萃取法 根据国际LC-GC杂志对世界100多个实验室进行的统计，样品前处理所花费的时间占 整个分析过程的 61%(见图1)。现代的自动化分析仪器使分析工作变的简单、快速。然 而，国内许多拥有现代化分析仪器的实验室却依然使用着古老、繁琐的样品前处理方法。可以说，样品前处理已经成为现代分析中的瓶颈，严重阻碍了分析工作的进行。因此，要提高效率，就必须解决样品前处理的问题。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 6 从色谱分析的整个过程看(见图2)，该统计发现在分析过程中样品前处理产生的误差最大,高达 30%，如果再加上操作误差，人为的因素占了误差来源的近50%。换句话来说，如果我们能够解决人为因素造成的误差，分析误差产生的几率就降低了一半。由八十年代中期开始，一项发展较快的样品前处理技术是固相萃取法(Solid Phase Extraction,SPE)，又有人称之为固液萃取法(Solid Liquid Extraction,SLE)。目前最常使用的是键合硅胶柱及聚合树脂柱。与传统的液液萃取法(Liquid-Liquid Extraction,LLE)比较，SPE 具有明显的优势。首先，在LLE中乳化是一种时常发生的现象。萃取过程一但发生乳化，将严重影响结果的重现性。而在SPE中则不存在这个问题。其次，LLE的另一个主要缺点是回收率的高低在很大程度上取决于操作人员对该技术掌握的熟练程度。也就是说，同数据处理 27%分析 6%采样 6%样品处理 61%样品处理 30%操作 19%色谱柱11%标准曲线 9%仪器 8%色谱 7%积分 6%进样 6%交叉污染 4%图1.分析过程中各步骤所花费的时间 图2.色谱过程中误差来源产生的几率 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 7样一个方法,不同操作者所得到的结果可能差异很大。这将影响方法的推广，也难以进行实研室的质量控制和标准化。而SPE是基于分析物功能团和固相填料功能团之间的作用力将分析物萃取出来的，其萃取结果稳定、方法很容易在实验室之间转移，有利于标准化。此外，固相萃取法还有许多优点：如选择性强、分离时间短、使用有机溶剂少等等。目前在国际上SPE技术已在许多领域里逐渐取代 LLE。SPE的最突出的优点之一是便于自动化，而SPE的自动化使繁所、复杂、费时的样品前处理发生了一个飞跃性的变化。吉尔森公司(GILSON)研制生产的 ASPEC XL 全自动固相萃取系列就是一个典型的代表。该样品处理系列在国内外已经广泛应用于许多领域：如药物学研究、临床药物检测、环保分析、食品/农副产品检验、竞赛药物分析及毒物学分析以及各种生物样品的纯化，如DNA、酶、肽的分离等等。SPE技术的应用已经超出了分析领域，在生物化学、生物工程领域也不断传来应用SPE技术进行多肽、生物酶等的分离纯化的消息。表1.液-液萃取与固相萃取比较 项 目 液-液萃取 固相萃取 适用溶剂 少 多 乳化程度 易 无 有机溶剂用量 多 少 人为影响 大 小 重现性 较差 好 回收率 较低、不稳定 高、稳定 花费时间 长 短 自动化程度 难 易 从表1可以看到固相萃取技术正好弥补了液-液萃取的不足。固相萃取技术在国内也得到越来越多的应用。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 8二.固相萃取的基本原理 固相萃取(SOILD PHASE EXTRACTION，简称 SPE)是一个包括液相和固相的物理萃取过程。在固相萃取过程中，固相对分析物的吸附力大于样品基液。当样品通过固相柱时，分析物被吸附在固体填料表面，其它样品组份则通过柱子。分析物可用适当溶剂洗脱下来。SPE的基本原理和HPLC相同，但目的则完全不同。HPLC是要在短时间内将各化合物分离并保持好的峰形。而SPE是要从复杂的基液中分离人们感兴趣的化合和物并将其浓缩，以便进行进一步的分析。因此，传统的SPE柱填料的颗粒往往比HPLC柱的填料颗粒要大的多(一般在40)，而且是不规则的颗粒以增加接触样品的表面积。目前用的最广泛的是键合硅胶柱(BONDED SILICA COLUNM)，其次是聚合树脂柱。图3.固相萃取基本步骤示意图 固相萃取是靠固体填料上的键合功能团与待分离化合物之间的的作用力将目标化合物与基液分离达到样品净化浓缩的目的的。因此，在进行固相萃取时有多种作用力是必须考虑：吸附剂和分析物之间作用力 1.非极性作用力 非极性作用力存在于吸附剂功能团的碳氢键和分析物的碳氢键之间。即 Van der Waals 力。因为大多数有机分子都在一定程度上具有非极性结构。非极性作用力常被用于分析物的分离。最常见的非极性吸附剂是 C8、C18。典型的非极性萃取包括:分析物 干扰物 柱预处理 样品添加 柱洗涤 分析物洗脱 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 9 从血浆或尿液中萃取药物 从水中萃取农药 从血浆中萃取多肽 从尿液或血清中萃取滥用药物 图4.非极性作用力 一般来说，非极性萃取比极性或离子交换萃取选择性差。非极性作用力常被用于同时萃取多种不同的化合物。基液的极性大有利于非极性吸附剂与非极性化合物之间的作用力。如水溶液。相反，这种非极性作用力可被具有一定程度非极性特征的溶剂破坏。2.极性作用力 极性作用力包括：氢键、偶极力/偶极力、诱导偶极力、-等。如：OH、-NH3、-SO3,羰基、芳香环及含氧、氮、硫、磷等杂原子的基团。图5.极性作用力示意图 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 10 典型的极性萃取包括:从血浆中萃取维生素 油脂类的分离 从花生酱中分离黄曲霉素 从机油中萃取添加剂 硅胶本身的性质(没有键合的-OH)决定了极性作用力存在于全部键合硅胶材料，并在非极性溶剂中最明显。非极性环境有利于吸附剂和分析物之间的极性作用力；极性环境有利于破坏吸附剂和分析物之间的极性作用力；环境离子强度大也不利于吸附剂和分析物之间的极性作用力。3.离子作用力 离子作用力是发生在具有相反电荷的分子功能团之间的作用力。对于有机化学来说，人们更加关心的是带电荷的有机化合物。在一定的pH条件下，有机分子可以呈离子状态。这种有机分子被称之为：a.可生成阳离子的功能团 b.可生成阴离子的功能团 常见阳离子的功能团：伯，仲，叔，丁胺类。常见阴离子的功能团：羰基，磺酸基，磷酸基等。典型的离子交换萃取包括:从血浆中萃取儿茶酚胺 从尿液中萃取碱性药物 从土壤中萃取除草剂 从尿液中萃取有机酸 从细胞培养液中萃取核糖核酸酶 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 11 图6.离子作用力 环境的pH对离子作用力影响很大，为了有效地利用离子交换机理将分析物吸附在固相柱上，必需满足两个条件：1.环境的pH必需使分析物和吸附剂带相反电荷。2.环境不能含有高浓度带有和分析物相同电荷的竞争化合物。有机化合物的pKa值是决定环境pH值的重要依据 有机分子功能团的 pKa 值为50%的该功能团在溶液中呈离子化时的pH值。根据 Henderson-Hasselbach 方程 对于弱酸性化合物(阴离子):HA H+A-pH=pKa+log(A-/HA)A-/HA=10pH-pKa=10pH 要用离子交换原理将可生成阴离子的弱酸性化合物 99%吸附在阴离子交换剂上，体系的pH值必需高于该化合物的pKa两个pH单位。要使99%该化合物脱附，体系的pH值必需低于该化合物的pKa两个pH单位。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 12 对于弱碱性化合物则相反，要用阳离子交换剂将99%的弱碱性化合物吸附，体系的pH值必需低于该化合物的pKa两个pH单位。要使99%该化合物脱附,体系的pH值必需高于该化合物的pKa两个pH单位。在应用离子交换作用力进行萃取时还必须考虑离子强度和选择性：离子强度低离子强度有利于分析物的吸附；高离子强度有利于分析物的脱附。选择性离子交换剂选择性的强弱取决于其功能团的性质。如：丁胺(强阴离子交换剂)对柠檬酸阴离子的吸附力为对醋酸根阴离子的250倍。因此，用醋酸根阴离子溶液处理的丁胺吸附剂对分析物的吸附力远比用柠檬酸阴离子溶液处理的丁胺吸附剂强。反之,柠檬酸阴离子溶液是一个好的洗脱剂。全部键合硅胶填料都会存在一定程度的未键合的硅醇基。因此，离子作用力作为附作用力一定存在。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 13 表2.部分常见化合物离子化功能团的 pKa 值(25)1.NH4 9.3 2.R-NH3(R=alkyl)10.6-10.7 3.OH-CH2CH2NH3 9.5 4.NH2-CH2CH2NH3 10.1 5.CH2=CHCH2NH3 9.5 6.C6H5-CH2-NH3 9.5 7.C6H5-CH2 CH2-NH3 9.5 8.9.C6H5-NH3 9.5 10.C6H5-CH-NH3 9.8 CH3 11.CH3-NH2CH3 10.8 12.CH3CH2-NH2CH2CH3 11.0 13.(CH2)-NH 9.8 14.(CH3CH2)3-NH 10.7 15.OH-CH2CH2-NH-(CH3)2 9.2 16.NH2-CH2CH2-NH-(CH3)2 9.5 17.CH2=CHCH2-NH 8.2 18.OH-CH2CH2-NH 9.8 (CH2CH3)2 (CH2CH3)2 O 19.C6H5NH-0.61 20.C6H5-NH-(CH3)2 5.1 CH3 21.C6H5-NH-CH3 5.1 22.C6H5-NH-(CH2CH3)2 6.6 23.C6H5-NH2-C6H5 0.85 24.COOH 2.4(COO-)CH2 9.9(NH+3)NH2 25.H2CO3 6.3(pka1)26.HCOOH 3.8 10.3(pka2)27.CH3COOH 4.8 28.Cl2CHCOOH 1.3 29.Cl3CCOOH 0.7 30.OHCH2COOH 3.8 31.CH3CH2CH2CH2COOH 4.8 32.CHCOOH 3.68(-COOH)SH 10.41(SH)33.COOH 2.9(pka1)34.C6H5-OH 10.0 CH 5.7(pka2)COOH 35.C6H5-COOH 4.2 36.OH-C6H5-OH 10.0 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 14 4多种作用力 必需强调，几乎全部的键合硅胶都存在多于一种以上的作用力。因此，在考虑固相萃取方法时应该综合考虑各种作用力对萃取过程的影响。表3.常见硅胶固相萃取柱与化合物之间的作用力 功能团 非极性 极性 阴离子交换 阳离子交换 C18 *C8 *C2 *CH *PH *CN *2OH *SI *NH2 *PSA *DEA *SAX *CBA PRS SCX 主作用力 第二作用力 *活性硅醇基 C18 十八烷基(Octadecyl)C8 辛烷基(Octyl)C2 乙烷基(Ethyl)CH 环己基(Cyclohexyl)PH 苯基(Phenyl)CN 氰基(CN)2OH 二醇基(Diol)SI 未键合硅醇基 NH2 丙氨基(Aminopropyl)PSA N-丙基乙二氨-(Ethylenediamine-N-propyl)DEA 丙基二乙氨(Diethylaminopropyl)SAX 三甲氨丙基(Trimethylaminoprooyl)CBA 甲酰基(Carboxymethyl,hydrogen form)PRS 丙磺酸基(Sulfonylpropyl,sodium form)SCX 丙基苯磺酸基(Propylbenzenesulfonly,hydrogen form)固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 15 三.固相萃取的基本程序 固相萃取的基本程序可分为以下五个部骤。但在实际应用时可根据最后分析手段对样品的要求对这五个步骤进行增加或减少。比如，当使用离子交换原理进行样品萃取时就需要增加调节萃取体系pH的步骤。1.固相柱的预处理 2.添加样品 3.固相柱的洗涤 4.固相柱的干燥 5.分析物的洗脱 1.萃取柱的预处理 为保证良好的萃取再现性，固相柱必需用适当的溶液进行预处理。对固相柱进行活化，展开碳氢链增加和分析物作用的表面积。对固相柱进行清洗，除去柱上吸附的对分析有影响的杂质。注意:在加样于固相柱前预处理好的固相柱必需保持湿润。2.样品的添加 将样品加于固相柱中，用正压或负压使样品通过柱子。样品的流速必需控制,对于生物样品，一般在1.5 ml/min。对于以离子交换为作用机理的萃取，样品通过SPE柱的速度应该适当的降低，以保证分析物有足够的时间与SPE柱填料的离子交换功能团发生作用。3.萃取柱的洗涤 用当的洗涤剂选择性地附力弱的脱杂质而留分析物于柱上。洗涤剂的选择也取决于最后的分析手段。4.萃取柱的干燥 如最后的洗脱剂为缓冲溶液或水溶性有机溶剂，而分析手段为反相 HPLC，固相柱上的残留水对分析影响不大。但是，当非水溶性有机溶剂为洗脱剂或分析手段又为GC或GC-MS时，固相柱的干燥就特别重要。5.分析物的洗脱 在选择洗脱溶剂时必须考虑以下几个因素：洗脱剂必需有足够强度，以最小用量将分析物洗脱下来。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 16 洗脱剂必需有足够的选择性只将分析物洗脱，而将吸附力强的杂质保留在柱上。在选择洗脱溶剂时，可以通过改变溶剂的极性指数、溶剂强度、溶剂选择性来达到最好的分离效果。极性指数(Polarity index P)按照一组溶剂对一组极性和非极性溶质的溶解能力的相对强弱而进行的排列。溶剂强度优先溶解极性较强化合物的能力。溶剂选择性当两个化合物的极性相近时选择性地溶解其中一个化合物的能力。Snyder(J.Chormatogr.9:223;1974)将71种溶剂按质子给予体、质子接受体、和耦极作用力分为八类不同的选择性。A 接受质子能力 D 质子供给能力 P 极性 图7.八类溶剂选择性三角图 IV II VI V VIIII VII 0.25 0.35 0.45 0.55 0.65 0.25 0.35 0.45 0.55 0.65 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A P D P A D 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 17 表4.常见溶剂极性指数和选择性 溶剂 P 值 选择性分组 正己烷 0.0 环己烷 0.0 四氯化碳 1.0 VI 二丁醚 1.7 I 甲苯 2.3 VI 氯苯 2.7 VII 乙醚 2.9 I 二氯甲烷 3.4 V 醋酸乙酯 4.3 VI 异丙醇 4.3 II 氯仿 4.4 VIII 二氧己环 4.8 VI 吡啶 5.3 III 丙酮 5.4 VI 乙酸 6.2 IV 乙腈 6.2 VI 甲醇 6.6 II 水 10.2 VIII 根椐实际需要可用不同的混合溶剂来达到所需的 P值。混合溶剂 A、B 的 P 值可根据如下方法计算：P=aPa+bPb 当 P 值确定后，可利用溶剂不同的选择性有选择地洗脱目标组份。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 18 洗脱强度(Eluotropic strengh)溶剂从某一特指固定相洗脱分析物的强度。它是单位面积溶剂的吸附能(L.R.Snyder et.Al，Introduction to modern liquid chromatography,2nd ed.John Wiley&Sons.Inc.New York,p.365;1979)。用二元混合溶剂来选择不同的洗脱强度。当某一洗脱体系对分析物洗脱力强，但又同时洗脱太多杂质时，可选用洗脱强度相近的另一洗脱体系。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 19 表5.溶剂的洗脱强度 溶剂 洗脱强度()(硅 胶)正己烷 0 戊烷 0 戊烷/异丙基氯(90:10)0.05 戊烷/异丙基氯(75:25)0.10 戊烷/异丙基氯(52:48)0.15 戊烷/异丙基氯(22:78)0.20 戊烷/二氯甲烷(76:24)0.20 戊烷/乙醚(80:20)0.20 戊烷/氯仿(56:44)0.25 戊烷/乙醚(67:33)0.25 戊烷/乙腈(92:8)0.25 戊烷/二氯甲烷(22:78)0.30 异丙基氯/氯仿(50:50)0.30 氯仿 0.31 二氯甲烷 0.32 二氯甲烷/乙#(93:7)0.39 甲基乙基酮 0.40 丙酮 0.43 乙酸乙酯 0.45 乙醚/乙腈(80:20)0.45 乙腈 0.50 二氯甲烷/甲醇(97:3)0.50 二氯甲烷/甲醇(93:7)0.55 吡啶 0.55 二氯甲烷/甲醇(86:14)0.60 乙腈/甲醇(88:12)0.60 异丙醇 0.63 乙醚/甲醇(81:19)0.65 二氯甲烷/甲醇(40:60)0.70 乙醚/甲醇(58:42)0.70 甲醇 0.73 冰醋酸 0.73 水 0.73 洗脱液的体积原则是尽可能小。洗脱液通过柱子的流速对回收率有很大的影响。流速慢有利于提高回收率，但可能会增加杂质。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 20 固相萃取中应当考虑的几种作用力 1.分析物/吸附剂作用力 分析物在固相柱上的吸附或洗脱主要取决于分析物与固相填料的功能团及分子结构。非极性基团和非极性吸附剂作用；极性基团和极性吸附剂作用；离子基团和反电荷离子吸附剂作用。分析物其它要考虑的重要因素：溶解度、离子基团的pKa、稳定性、和基液其它组分作用的程度。2.分析物/基液作用力 这种作用力会影响分析物的吸附。根椐作用基理的不同，基液可能有利于分析物的吸附，也可能不利于分析物的吸附，或阻止分析物的吸附。基液的pH、极性、离子强度都会对分析物的吸附有影响。这些影响可通过稀释基液加以改变。3.基液/吸附剂作用力 这种作用力对分析物的吸附有直接的影响。特别是当基液中含有大量与分析物性质接近的组份时这种影响很大。建立固相萃取方法 固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并不无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可从三个方面考虑：评估萃取中的问题；建立初步固相萃取方法；对方法进行优化。表6给出了如何建立固相萃取方法的示意图。1.评估萃取问题 固相萃取是通过分析物、样品基液、固相担体、溶剂之间的作用力而达到的。要有效地萃取分析物，固相担体对分析物的吸附力必须大于基液。反之，在最后的洗脱时，洗脱溶剂必须能够破坏分析于固相担体之间的作用力。因此，必须认真考虑分析物、基液、固相填料、溶剂之间的作用力。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 21 表6.建立SPE 方法的示意图 评估萃取中的问题评估分析的要求 样品的特性 浓缩的要求 样品需要如何稀释 检测方法的灵敏度如何 干扰物 分子量、功能团、极性、溶解度、pKa 纯度的要求 检测方法的特殊性 有哪些可能的干扰 分析物 分子量、功能团、极性、溶解度、pKa 样品基液 从没有改变的基液中萃取 从固态样品释放分析物(均浆、超声波、消化)基液中的可能干扰物 溶剂的限制 检测方法所接受的水溶性洗脱液 需要的有机洗脱液 建立初步的方法 选择萃取方法(见表7)选择萃取SPE材料(见表7)选择洗脱溶剂(见表4、5)选择样品体积 选择样品基体处理方法 优化SPE方法 用标准溶液检验分析物从SPE柱洗脱的情况 是 否 用没有基液的标准溶液对分析物进行萃取 是 否 检验从基液中萃取分析物的情况 是 否 检测干扰物是否与分析物同时被洗脱 是 否 确认方法 重新评估问题 见解难指南(40页)固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 22 选择一个适当的固相萃取方法必须对分析物合干扰物有足够的认识，最佳的固相萃取方法取决于对样品中的分析物及干扰物的了解。评估固相萃取中的问题应该考虑：分析手段对样品的要求及样品的特点。表6按照样品在水溶液或者有机溶剂的极性、离子化和溶解度系统地对样品的萃取给予指引。该表对建立初步的固相萃取方法是十分有用的。对固相萃取方法进行系统的评估是十分花时间的工作，最好是使用自动化的固相萃取仪进行这项工作。吉尔森的GX-271/274 ASPEC全自动固相萃取仪就是一个很好的选择。2.评估分析的要求 分析要求的评估要考虑分析方法对浓度的要求、对纯度的要求以及对溶剂的限制。萃取所需样品的用量可以通过检测方法的最低检测下限及分析物在样品中的浓度来计算。有时可以通过对洗脱馏份的浓缩来达到所需的浓度。萃取馏份要达到的纯度检测方法及样品基液中的干扰物。如用紫外分光光度法进行定量分析对样品的纯度的要求比GC/MS要苛刻的多。所用的检测手段对萃取过程溶剂的选择也有限制。检测手段决定了萃取中的洗脱液是用水溶性还是有机溶剂。3.评估样品的特性 样品中包括待分析物及含有干扰物的基液。分析物和干扰物的结构、功能、分子量、极性、溶解性、pKa、离子强度等因素对于建立萃取方法都是十分重要的。有许多液体样品都可以不用处理或经过简单的处理就可以直接进行固相萃取。然而，将分析物从复杂样品中释放出来是萃取中较困难的问题，特别是固态样品。常用的释放分析物的方法有：用能溶解分析物的溶剂对样品进行均浆、超声波振荡、消化。对于这种经过溶剂处理的样品在进行固相萃取前必须降低溶剂的强度，以增强分析物在固相萃取柱的保留。可以通过用对样品溶解度有限的溶剂对样品进行稀释达到此目的。对于离子交换和反相萃取必须考虑样品基液的离子浓度和pH值。以下是常见的样品处理方法：蛋白质键合 生物检材样品中的药物检验经常遇到待分析药物与蛋白键合而影响药物的分离与分析。蛋白键合药物在进行固相萃取时会随蛋白质一起通过 SPE 柱而无法被萃取。解决方法：1.超声波震荡 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 23 2.改变样品的pH值 3.加入蛋白改性试剂 e.g.高浓度尿素或甲醇、蚁酸等有机溶剂(离子交换SPE不适用)4.沉淀蛋白(有时可能会造成分析物的共沉淀)脂肪、油脂、饱和碳氢化合物 脂肪、油脂、饱和碳氢化合物这类物质是生物样品中经常见到。如肉类、奶酪制品、内脏组织等。这类化合物最显着的特征就是其非极性的性质。如果分析化合物为极性物质，可以用极性的固相萃取柱除去这类物质。在柱的洗涤时，可以选用非极性的溶剂将残留的脂肪、油脂、饱和碳氢化合物除去。生物样品 血清/血浆 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理：一般在进行固相萃取前，用等体积或更多的水或缓冲液对样品进行稀释。缓冲液和pH的选择取决于待分析物的性质。如果标准样品的回收率高，血清/血浆样品的回收率低，就应该考虑由于蛋白键合引起的问题。全血 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理：全血的处理与血清、血浆大致相同。所不同的是全血中存在血红细胞。血红细胞是有化学活性的，许多药物及天然产物都会进入血红细胞以致无法被SPE柱吸附。在SPE之前必须破坏血红细胞，将药物/天然产物释放出来。如超声波振荡；添加有机溶剂；用缓冲液稀释。如果标准样品的回收率高，血样的回收率低，就应该考虑血红细胞及蛋白键合的问题。尿液 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理：尿液在固相萃取前必须首先用至少等体积的水或缓冲液进行稀释。与血浆/血清相同，在萃取时必须考虑蛋白质存在的问题。在处理尿液时还必须考虑的另一个问题是各种高浓度盐的存在。尿液样品的这种特性经常会妨碍选用离子交换模式作为首选SPE方法。解决这个问题的方法之一是先用非极性SPE柱将待分析物与尿液中的盐分离；然后再用离子交换的方法进行萃取。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 24 生物组织 常用的萃取模式：非极性、极性或离子交换(取决于样品前处理的方法)样品前处理：生物组织样品的第一步处理是粉碎均浆。均浆的溶剂取决于生物组织的性质。脂肪组织经常用非极性到中极性有机溶剂均浆；对于以蛋白质为主的组织，可用更极性的有机溶剂均浆。如甲醇或乙醇/缓冲液混合液。均浆后可通过离心或过滤除去颗粒固体。之后，上层清液用适当的溶剂稀释后即可以进行SPE萃取。水解也是常用的生物组织处理方法。日常产品 牛奶 常用萃取模式:非极性、离子交换 样品前处理：牛奶一般是用缓冲液或水稀释后直接进行SPE萃取。如有蛋白问题，可通过蛋白沉淀方法将其除去。奶酪 常用萃取模式:非极性、离子交换 样品前处理：奶酪的化学性质与牛奶相似，但含有更高的脂肪及低溶性物质。奶酪一般需要进行均浆，所用的试剂取决于所用的SPE方法。农产品 谷物 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理：谷物样品可用极性溶剂粉碎均浆，然后用水或缓冲液进行稀释。橙子 常用的萃取模式：非极性、极性、离子交换 大豆 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理大豆样品可用有机溶剂粉碎均浆，然后用水或缓冲液进行稀释。菜油 常用的萃取模式：极性 固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 25 样品前处理：因为菜油的非极性特征，一般都用非极性 肉类 肉类 常用的萃取模式：极性 样品前处理：由于熏肉含有极高的脂肪，最简单的方法是用有机溶剂粉碎均浆。肝脏 常用的萃取模式：非极性、极性、离子交换 样品前处理：处理肝组织的一个主要困难是乳化。在饱和的氯化钠溶液中进行均浆可减少乳化。均浆后的样品需稀释后进行萃取。另一种选择是在非极性有机溶剂中均浆。脂肪/油类 常用的萃取模式：极性 样品前处理这类样品的非极性特征十分显着，一般可用非极性有机溶剂进行稀释。糖酒类 酒、软饮 常用的萃取模式：非极性、离子交换 样品前处理：这类样品极性很强，一般用水或缓冲液稀释，必要时要调节pH。咖啡、茶 常用的萃取模式：非极性、极性、离子交换 样品前处理：速溶咖啡/茶可直接溶于水，过滤后调节pH。糖 常用的萃取模式：非极性 样品前处理：糖可用水或缓冲液稀释。巧克力 常用的萃取模式：极性 样品前处理：巧克力和含高脂肪，可作为非极性样品处理。固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 26 化妆品-软膏类 常用的萃取模式：非极性、极性 样品前处理：这类化妆品可分为油性和水性。油性的可溶于非极性有机溶剂；水性的可溶于甲醇或其它极性有机溶剂，然后再用水或缓冲液稀释。香波 常用的萃取模式：非极性、极性 样品前处理：香波主要成份是表面活性剂。一般样品通过硅藻土过滤可除去表面活性剂。石化产品 常用的萃取模式：极性 样品前处理：因为石化产品有强非机性特征，通常用非极性有机溶剂进行稀释，如环己烷、石油醚。建立初步的萃取方法 建立初步的萃取方法要考虑：-选择萃取模式-选择SPE柱担体-选择溶剂-如果需要选择基液的处理方法-综合评估初步萃取方法得到的信息-对萃取方法进行优化 1.选择萃取模式 无论是样品净化、样品浓缩或除去基液，最佳的固相萃取方法取决于所要求的分析物浓度、样品基液的复杂程度及样品中的分析物和干扰物的特性。2.样品净化 当样品中的分析物的极性比杂质大时应该用正相SPE柱。在正相SPE中，样品可用比硅胶担体极性弱的二氯甲烷溶解。当样品通过SPE柱子的时候，极性分析物被吸附在硅胶柱固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 27 上，而非极性的杂质与溶剂的亲合力大，所以与溶剂一起通过柱子。然后用极性更大的溶剂(e.g.甲醇)将极性分析物从SPE柱上洗脱下来。这样，极性分析物就被从极性较弱的杂质中分离出来了。当杂质的极性比分析物大时，用反相SPE柱会更为有效。样品溶解于极性介质中(e.g.甲醇/水或乙#/水)。当样品通过非极性SPE柱时，极性的杂质由于对极性基液的亲合力大，会与极性基液一起通过SPE柱而不被保留。极性较弱的化合物则被吸附在反相SPE柱上。这些化合物可以通过非极性溶剂(e.g.环己烷、二氯甲烷)洗脱。3.样品浓缩 通过SPE柱可对样品进行浓缩。常见的是对大体积水样中的痕量有机化合物进行浓缩。在实际应用中，人们常常使用这种方法进行环保检测大体积水样的处理。用SPE柱可对500 mL至1L甚至更多的水样进行处理。通过这样的方法可对样品进行500倍的浓缩，使之符合检测分析的浓度范围。然而，由于大量的水样通过SPE柱会破坏SPE柱的吸附条件，为了保证SPE柱的萃取环境不破坏，在样品中最好加入1%的甲醇，混合均匀，然后在过柱。4.除去样品基液 有时候纯化分析物的目的可以通过SPE柱对杂质的吸附得以达到。从血浆或尿液中分离寡核苷酸CYCLOSPORINE就是一个很好的例子。首先将样品溶液通过C18柱，CYCLOSPORINE和杂质都被吸附在柱子上，经过3mL70%甲醇/水和3mL1%丙酮/环己烷洗涤之后，用乙酸乙酯/甲醇溶液(3/1)对样品进行洗脱。然后，将洗脱液通过一个极性硅胶柱。极性杂质被吸附在柱子上，而CYCLOSPORINE就通过柱子被收集。5.选择SPE固定相 SPE固定相的选择取决于分析物的特性和分析方法。表8列出了八种不同样品的分离机理。另外，该表还给出了建议选用的SPE柱及洗脱液。在实际工作中可参考表8快速选择适当的固相萃取柱。选择SPE柱同时要考虑可能干扰分析物的杂质的分离。如果杂质的极性比分析物低，可选用正相SPE柱；反之则可选用反相SPE柱。样品中杂质的性质可用于分析物的纯化。例如碳水化合物和多糖类溶于极性溶剂，因此在通过非极性SPE柱时，不会被SPE柱吸附。蛋白固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 28 质分子量很大，不能进入键合担体60的微孔。因此一般蛋白质在键合SPE柱上不会被保留。如果分析物键合在蛋白质上，再样品通过SPE柱时分析物就会与蛋白质一起流出柱子而没有被保留。在这种情况下，必须先将被蛋白质键合的分析物释放出来，使分析物呈游离状态，然后才能被SPE柱有效的吸附。释放蛋白质键合分析物的方法有调节样品基液的pH值，对蛋白质进行改性。也可以向样品中加入有机溶剂(如甲醇、乙腈等)，使主要的蛋白质沉淀。离心后的上清液必须用水或缓冲液进行稀释以降低甲醇或乙腈的浓度。否则，分析物将不会被保留在SPE柱。用三氯乙酸对蛋白质进行沉淀也是一个行之有效的方法。如果通过这种方法处理的样品pH值太低而不利于SPE萃取时，应该对样品的pH值进行调节。在极性基液中的无机盐是常见的杂质。这些极性杂质很容易通过非极性SPE柱。如果这些杂质浓度高就不能用离子交换的方法进行萃取，因为这些高浓度的离子会和分析物争夺SPE担体的吸附位置。肉类和动物组织样品都含高脂肪。这些样品较易溶于非极性溶剂中，在用极性吸附柱对这类样品进行萃取时，中等极性的分析物被吸附在SPE柱上，而非极性的油脂就会随非极性有机溶剂通过SPE柱。6.选择洗脱液 在前面我们已经详细讨论了在选择洗脱液时应该考虑的因素。溶剂的极性、洗脱强度及溶剂选择性等参数都是选择合适的洗脱溶剂应该考虑的。7.样品基体的处理 如前所述固相萃取的一个难题是从复杂的样品基体中将分析物释放出来。固体样品就是一个明显的情况，而分析物必须呈液态方能进行固相萃取。因此，必须用强溶剂对样品进行均浆或超声波振荡。无论原始样品是液体还是经过处理后成为液体，都应该对样品进行处理以降低分析物在样品溶液中的溶解度。固体样品的非极性分析物在用反相SPE柱萃取前可用甲醇、异丙醇或乙腈进行均浆。离心后的上清液应该加入70-90%的水稀释后才进行SPE萃取。如果SPE萃取是在正相柱上进行，固体样品就应用非极性溶剂进行均浆(如环己烷、石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿固相萃取技术 华运有限公司市场销售部 29 等)。如果样品基体是油脂性的，可用环己