3DNA复制.pptx

第三章、第三章、DNADNA复制复制第一部分：原核生物第一部分：原核生物DNADNA复制（复制（8 8周）周）第二部分：真核生物第二部分：真核生物DNADNA复制（复制（9 9周）周）本次本次课内容内容（原核生物（原核生物DNA复制）复制）一、一、DNA复制的基本特征复制的基本特征(重点重点)（1节）节）1.DNA的半保留复制的半保留复制2.DNA复制的方向性复制的方向性3.DNA的半不连续复制的半不连续复制二、二、DNA复制的反应体系及复制过程（重点）复制的反应体系及复制过程（重点）（2-3节）节）1.DNA复制所需要的酶系复制所需要的酶系2.DNA复制过程复制过程三、三、DNA复制的终止复制的终止四、四、DNA复制的模式复制的模式3-4节节DNA双螺旋模型（双螺旋模型（1953）半保留复制半保留复制DNA复制（复制（p91）DNA复制时复制时亲代双链亲代双链DNA分子分子在在DNA聚合酶等相聚合酶等相关酶的作用下，分别以每条单链关酶的作用下，分别以每条单链DNA分子分子为模板为模板，聚合与模板链碱基可以互补配对的游离的三磷酸聚合与模板链碱基可以互补配对的游离的三磷酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸dNTP，合成合成出两条与亲代出两条与亲代DNA分子分子完全相同的完全相同的子代子代双链双链DNA分子分子的过程。的过程。复复 制制 子子 复制起点：复制起点：DNA上的一个上的一个相对固定的位点，是复制相对固定的位点，是复制起始的位置。起始的位置。从复制起点到复制终点是从复制起点到复制终点是有方向性的。有方向性的。复制起点到复制终点的复制起点到复制终点的DNADNA区段，称为一个复制区段，称为一个复制子（子（replicon）。）。原核生物只有一个复制起点（原核生物只有一个复制起点（单复制子）复制子）一、一、DNA复制的基本特征复制的基本特征1.DNA的半保留复制的半保留复制概念：复制过程中各以双螺旋概念：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板，合成互补的其中一条链为模板，合成互补链，新生的互补链与母链构成子链，新生的互补链与母链构成子代代DNA分子分子全保留复制：全保留复制：两条两条DNA母链保留在一起，作为子链母链保留在一起，作为子链合成的模板。合成的模板。随机分散复制随机分散复制：前两种方式同时或交替出现。：前两种方式同时或交替出现。说明什么？说明什么？DNA复制的三种可能方式复制的三种可能方式热变性后离心热变性后离心半保留半保留复制复制N14N152.DNA复制的方向性复制的方向性DNA复制的方向性复制的方向性复制叉移动的方向性复制叉移动的方向性DNA链延伸的方向性链延伸的方向性 5 3?3 5?复制叉移复制叉移动的方向的方向E.coli低低剂量的剂量的3T-dTTP的培养基的培养基数分钟数分钟高高剂量的剂量的3T-dTTP的培养基的培养基数分钟数分钟提取提取E.coli DNAE.coli DNA 放射自显影放射自显影对不同复制模式的预期结果对不同复制模式的预期结果实际观测结果实际观测结果E.coli DNA 的复制是双向的的复制是双向的DNA复制的方向性复制的方向性复制叉移动的方向性复制叉移动的方向性DNA链延伸的方向性链延伸的方向性 5 3?3 5?聚合反应聚合反应：OHOHRNA引物被引物被水解掉水解掉1.DNA聚合酶只能利聚合酶只能利用引物分子提供的用引物分子提供的3-OH末端来聚合末端来聚合dNTP；2.新生新生DNA单链的单链的5端带有三个磷酸基端带有三个磷酸基团。团。dNTPdNTP：deoxy-nucleotide-tri-phosphate 常见的核苷酸为一磷酸单核苷酸常见的核苷酸为一磷酸单核苷酸（如（如AMP）。一磷酸核苷酸。一磷酸核苷酸可与一分子磷酸结合成二磷酸核苷酸可与一分子磷酸结合成二磷酸核苷酸（ADP）；二磷酸核；二磷酸核苷酸再与一分子磷酸结合成苷酸再与一分子磷酸结合成三磷酸核苷酸三磷酸核苷酸，如，如ATP。强烈的磷酸基团负电荷之间的静电斥力将阻止强烈的磷酸基团负电荷之间的静电斥力将阻止DNA聚合聚合如果复制方向如果复制方向为3 5 3.DNA的半不的半不连续复制复制前导链前导链冈崎片段冈崎片段后随链后随链不不连续复制的复制的发现脉冲脉冲标记实验新合成的新合成的DNA片段几乎都片段几乎都为为1000-2000bp离心离心管口管口离心离心管底管底脉冲追踪脉冲追踪实验脉冲追踪脉冲追踪实验小片段已被连接成了大片段小片段已被连接成了大片段DNA的半不的半不连续复制复制前导链？前导链？冈崎片段冈崎片段 DNA是不连续复制的是不连续复制的：先复制成：先复制成1000-2000bp左右的小片段（冈崎片左右的小片段（冈崎片段），然后再连接成一个长片段。段），然后再连接成一个长片段。两条链都是不连续复制？两条链都是不连续复制？AP切口切口UUUUDNA的半不的半不连续复制复制前导链前导链后随链后随链新合成新合成DNA均为均为1000-2000bp小片段小片段UUUUDNA的半不的半不连续复制复制前导链前导链后随链后随链小片段都被连接小片段都被连接成了大片段成了大片段二、二、DNA复制的反复制的反应体系体系及复制及复制过程程PCR的的组分？分？模板模板引物引物dNTPDNA聚合酶聚合酶DNA复制体系复制体系底物：底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；模板模板(template)：解开成单链的：解开成单链的DNA母链；母链；引物引物(primer)：提供：提供3-OH末端的寡核苷酸；末端的寡核苷酸；聚合酶聚合酶(polymerase)其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子引物引物DNA聚合酶只能利用已提供的核苷酸的聚合酶只能利用已提供的核苷酸的3-OH末末端聚合端聚合dNMP，合成，合成DNA链。即链。即DNA复制的起始复制的起始必须先期合成一段引物分子。必须先期合成一段引物分子。这段引物分子是由引物酶（这段引物分子是由引物酶（RNA聚合酶）合成的聚合酶）合成的一段一段10个核苷酸左右的个核苷酸左右的RNA分子。分子。DNADNA复制的引物是复制的引物是RNARNA-证实实验之之1 1M13噬菌体噬菌体DNA侵染大肠杆菌侵染大肠杆菌E.coli并利并利用其中的酶等进行复制用其中的酶等进行复制+链链+链链-链链复制型（复制型（RF型）型）DNA无无 RF型型有有 RF型型有有 RF型型（以上实验证实（以上实验证实M13DNA的复制需要的复制需要RNA的合成）的合成）（该实验证实当复制已经启动后，（该实验证实当复制已经启动后，RNA分子合成与否不会影响复制的进行）分子合成与否不会影响复制的进行）E.coli:Rif s(利福平敏感利福平敏感)加入：利福平加入：利福平培养培养接种接种M13噬菌体噬菌体不能复制不能复制E.coli:Rif r(利福平抗性利福平抗性)加入：利福平加入：利福平培养培养接种接种M13噬菌体噬菌体正常复制正常复制E.coli:Rif s(利福平敏感利福平敏感)加入：利福平加入：利福平培养培养接种接种M13噬菌体噬菌体正常复制正常复制实验之之1 结论 DNA复制需要复制需要RNA合成合成 复制起始的复制起始的RNA由由RNA聚合酶合成聚合酶合成DNADNA复制的引物是复制的引物是RNARNA-证实实验之之2 2（直接直接证据据）提取分离冈崎片段，并用提取分离冈崎片段，并用32P标记标记DNase剩下剩下10-12个核苷个核苷酸的酸的RNARNase(RNase+菌株菌株)RNA引物也被降解引物也被降解RNase(Rnase-突变体突变体)RNA引物不被降解引物不被降解冈崎片段冈崎片段复制完成后，复制完成后，RNA引物被降解引物被降解 无论是前导链还是后随链的引物均为无论是前导链还是后随链的引物均为RNARNA分子，当分子，当DNADNA复制完成后，必须将复制完成后，必须将RNARNA引物分子降解。引物分子降解。冈崎片段之间的缺口由冈崎片段之间的缺口由DNADNA聚合酶聚合酶和和DNADNA连接酶通过连接酶通过缺口平移的方式填补。缺口平移的方式填补。DNA复制的复制的酶学学 1.DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase):拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNA拓扑性质（螺旋方拓扑性质（螺旋方向性）的酶。对向性）的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。能连接磷酸二酯键。可松弛可松弛DNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNA解链。解链。拓扑异构酶拓扑异构酶I（topo I）:主要作用是切开主要作用是切开DNA双链中的一股，使双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结，解链旋转中不打结，DNA变为松弛变为松弛 状态再封闭切口。状态再封闭切口。拓扑异构酶拓扑异构酶II（topo II）:在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断能切断DNA双链，使螺旋松弛。在双链，使螺旋松弛。在ATP参参 与下，松弛的与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接 断端。断端。2.解螺旋酶解螺旋酶(Dna B):复制相关蛋白的基因：复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C dna X Dna A：辨认复制起始位点：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上：辅助解螺旋酶使其在起始点上结结 合并打开双链。合并打开双链。解螺旋酶解螺旋酶(Dna B):在双链在双链DNA解旋解链解旋解链的过程中，的过程中，DnaA找到找到复制起点；复制起点；Dna B在在Dna C的帮助下的帮助下结合于解链区。结合于解链区。Dna B借助水解借助水解ATP产生的产生的能量，沿能量，沿DNA链链5-3方向移动，解开方向移动，解开DNA的双链。的双链。3.单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSB):SSB与解开的与解开的DNA单链紧密结合，防止单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制在复制 中维持模板处于单链状态。中维持模板处于单链状态。4.引物酶引物酶(primase):合成一小段合成一小段RNA，用来引导，用来引导DNA聚合酶聚合酶起始起始DNA链链的的合成合成。在大肠杆菌，引物酶是。在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。基因的产物。至此，至此，DNA复制的所有准复制的所有准备工作工作已已经完成了！完成了！引发体引发体(primosome):由由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引因子一起形成复合体，再结合引物酶形成物酶形成 较大的聚合体，结合到模板较大的聚合体，结合到模板DNA上，上，这个聚合体称为这个聚合体称为DNA复制的引发体。复制的引发体。5.DNA聚合酶聚合酶(polymerase):催化催化dNTP聚合到核酸链上的酶。聚合到核酸链上的酶。是是DNA复制的主要酶。复制的主要酶。聚合反应机理聚合反应机理：OHOH 聚合反应的特点：聚合反应的特点：(1)以单链以单链DNA为模板为模板(2)以以dNTP为原料为原料(3)引物提供引物提供3-OH(4)聚合方向为聚合方向为53 DNA-pol I:单一肽链的大分子单一肽链的大分子曾被称为复制酶曾被称为复制酶(replicase)含量最多含量最多可被水解成可被水解成两个片段两个片段小片段小片段(N端端)：具有：具有53外切酶活性；外切酶活性；大片段大片段(C端端)：具有聚合活性和：具有聚合活性和35 外切酶活性，也称为外切酶活性，也称为Klenow片段片段，是常，是常用的工具酶。用的工具酶。DNA聚合酶聚合酶I的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3535外切酶活性：外切酶活性：切除错配的核苷酸切除错配的核苷酸5353外切酶活性：外切酶活性：切除引物切除引物 切除突变的片段切除突变的片段DNA聚合聚合酶I的校正功能的校正功能DNA pol的校对作用可将错误的核苷酸切掉，重新加上正的校对作用可将错误的核苷酸切掉，重新加上正确的核苷酸。确的核苷酸。DNApol有两个结构域：大结构域有直径有两个结构域：大结构域有直径2nm裂缝，裂缝，DNA可结合于此而使裂缝关闭，可结合于此而使裂缝关闭，DNA可在裂缝中前后滑动；可在裂缝中前后滑动；小结构域含核苷酸结合部位；当新合成小结构域含核苷酸结合部位；当新合成DNA中含错配核苷中含错配核苷酸时，因双螺旋变形而不能在裂缝中向前滑动，只能后移，酸时，因双螺旋变形而不能在裂缝中向前滑动，只能后移，35外切酶激活，切除错配核苷酸。外切酶激活，切除错配核苷酸。DNA-pol III:由由10种亚基组成的不对称聚合体种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高催化效率最高复制的主要酶类复制的主要酶类 DNADNA聚合酶的种类聚合酶的种类原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶pol-Ipol-IIpol-III5353聚合酶活性聚合酶活性+3535外切酶活性外切酶活性+5353外切酶活性外切酶活性+功功 能能切除引物切除引物填补空隙填补空隙修复合成修复合成不清不清复制的复制的主要酶主要酶错配校正错配校正 6.DNA连接酶连接酶（DNA ligase）连接连接DNA链链3-OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连链连接成完整的链。反应需要接成完整的链。反应需要ATP。DNA复制体复制体DNA的复制有多种酶类共同参与，这的复制有多种酶类共同参与，这些酶类构成些酶类构成DNA复制体，复制体，包括：包括：拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶解旋酶DNA结合蛋白结合蛋白引物引发酶引物引发酶RNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶IIIDNA聚合酶聚合酶I 连接酶连接酶解链解链合成引物合成引物DNA聚合聚合降解降解RNA引物引物DNA复制复制过程的程的酶促反促反应过程（程（p103）RNA聚合酶聚合酶复制体如何移复制体如何移动？DNA复制的回复制的回环模型模型u每一个复制叉均含有一个每一个复制叉均含有一个DNaseIII的二聚体，它可以的二聚体，它可以同时催化前导链和后随链的同时催化前导链和后随链的同时复制。同时复制。u后随链的模板后随链的模板DNA以倒退的以倒退的方式从方式从DNaseIII中将模板中将模板DNA释放出来，新冈崎片段释放出来，新冈崎片段的的DNA单链与前导链一样，单链与前导链一样，以相同的方向完成复制。以相同的方向完成复制。三、三、DNA复制的复制的终止止三、三、DNA复制的复制的终止止终止序列可被终止序列可被Tus蛋白（蛋白（tus基因编码）识别，并基因编码）识别，并结合于其上，它只让一侧复制叉通过，并可能阻结合于其上，它只让一侧复制叉通过，并可能阻止止DnaB的解链作用，使的解链作用，使DNA复制在终止位点终复制在终止位点终止。止。聚合反应聚合反应：OHOH 3553 3553OHOHOHOHOH5末端缩短末端缩短线性性DNA复制后出复制后出现5末端末端缩短短线性性DNA分子如何避免分子如何避免5端端缩短，短，保保证生物体的世代繁衍呢？生物体的世代繁衍呢？T7噬菌体通噬菌体通过形成共形成共联体避免体避免5末端末端缩短短167bp正向重复序列正向重复序列（丰足末端）（丰足末端）55RNaseIII识别位点识别位点T7噬菌体通噬菌体通过形成共形成共联体避免体避免5末端末端缩短短形成共联体形成共联体3OHDNA聚合酶聚合酶IIIRNAIII切割切割3OHDNA聚合酶聚合酶IIIDNA连接酶连接酶腺病毒腺病毒-2：末端起始复制：末端起始复制CGGC103-106bp IS腺病毒腺病毒-2：末端起始复制：末端起始复制SSB：单链结合蛋白：单链结合蛋白TP：末端结合蛋白：末端结合蛋白pTP：末端结合蛋白前体：末端结合蛋白前体腺病毒腺病毒-2：单链置置换式复制式复制红色红色单链单链的复的复制起制起始始蓝色单链复制起始蓝色单链复制起始腺病毒腺病毒-2：末端起始复制：末端起始复制腺病毒复制不需要引物酶合成腺病毒复制不需要引物酶合成RNA引物，引物，从而避免了从而避免了5末端切除引物分子后形成末端切除引物分子后形成的的5末端缩短的现象。（末端缩短的现象。（p109）四、四、DNA复制的模式复制的模式（1 1）从新起始复制方式）从新起始复制方式（de nova initiationde nova initiation）3H3H3HABCBAC3H 复制复制/凯恩斯模型凯恩斯模型 （model/Cairns model model/Cairns model）从新起始方式的主要特征从新起始方式的主要特征每次复制均从一个固定的复制起点起始每次复制均从一个固定的复制起点起始前导链连续合成，后随链由冈崎片段连接而成前导链连续合成，后随链由冈崎片段连接而成环形环形DNA分子，真核线性分子，真核线性DNA分子的复制属于这一类分子的复制属于这一类型型（2 2）滚环复制（共价延伸方式）复制（共价延伸方式）Rolling-circle ModelRolling-circle Modelp105滚环复制的特征复制的特征复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释放出放出5端和端和3端。端。3端作为前导链合成的引物，前导链连续合成。端作为前导链合成的引物，前导链连续合成。5端游离出来，以作为后随链合成的模板。端游离出来，以作为后随链合成的模板。前导链的合成不需要另外合成的前导链的合成不需要另外合成的RNA引物。引物。前导链与亲本链总是连接在一起。在旺盛合成前导链与亲本链总是连接在一起。在旺盛合成时期，前导链不断合成，相互也连在一起，并时期，前导链不断合成，相互也连在一起，并作为新的后随链合成的模板。作为新的后随链合成的模板。（3 3）D-D-环复制复制 （置（置换式）式）p106p106（线粒体（线粒体DNA）D-环复制的特征复制的特征环状环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且模板的两条单链的复制起点位置不同且相距甚远。相距甚远。复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连续合成前导链，并置换另一条模板单链。连续合成前导链，并置换另一条模板单链。当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、连续的合成。单向、连续的合成。两条链的复制完成有先后。两条链的复制完成有先后。由于合成的是环状由于合成的是环状DNA分子，故最先合成的分子，故最先合成的5末末端可以与最后合成的碱基的端可以与最后合成的碱基的3-OH连接起来，按碱连接起来，按碱基配对的原则，补平因基配对的原则，补平因RNA引物切除后造成的引物切除后造成的5末端缩短现象。末端缩短现象。问答答题（1-6班分班分别回答一回答一题）1.DNA复制的特点是什么？复制的特点是什么？2.请简述请简述DNA复制的过程？复制的过程？3.线性线性DNA复制为什么会造成复制为什么会造成5末端缩短？末端缩短？4.避免避免DNA复制过程中复制过程中5末端缩短的机制有哪几种末端缩短的机制有哪几种（简述）？（简述）？5.DNA复制为什么必须从复制为什么必须从5到到3?6.DNA复制过程需要哪些酶，它们的作用分别是什复制过程需要哪些酶，它们的作用分别是什么？么？