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杏仁核脑片场电位的记录及其应用
【摘要】 目的： 探讨基底外侧杏仁核离体脑片场电位的记录及其应用. 方法： 制备杏仁核脑片，在脑片上记录场电位,观察其药理学特性并引导杏仁核的长时程增强. 结果： 在脑片保持良好活性及记录系统噪音幅度小于 mV的前提下，应用国产微电极放大器及记录系统即可记录到稳定可靠的杏仁核场电位,大小约为海马CA1场电位的1/10；在灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸受体拮抗剂氰基2硝基喹啉2，3二酮10 μmol/L和N甲基D天冬氨酸受体阻断剂D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV)100 μmol/L后，场电位几乎完全被阻断. 应用两串高频刺激刺激外囊，在BLA可引导LTP. 结论： 杏仁核脑片可记录到稳定可靠的场电位，适用于研究杏仁核的突触可塑性等功能及探讨杏仁核在神经疾病中的作用及其机制.
【关键词】 杏仁核；场电位；长时程增强
0引言
杏仁核与学习记忆、情绪、情感密切相关［1］，而且参与精神分裂症、抑郁、癫痫和创伤后应激障碍等多种神经系统疾病的病理过程［2-3］. 然而杏仁核深藏于大脑深部，被复杂精细的神经结构包绕［4］，很难直接探测到杏仁核神经元的活动. 脑片是研究杏仁核功能比较理想的标本. 脑片上记录神经细胞的活动方式主要有膜片钳、传统的细胞内和场电位记录，前两者对仪器设备要求较高，而场电位记录对设备要求相对简单，并可以反映神经细胞的功能状态，易于推广. 我们采用国内的设备系统，制备杏仁核脑片，在脑片上记录场电位,观察其药理学特性并引导杏仁核的长时程增强，以探讨杏仁核场电位的记录及其应用.
1材料和方法
材料健康SD大鼠24只，雄性，体质量200～250 g，所有动物均在12 h光照/黑暗周期环境中饲养，自由摄食及饮水. D，L2氨基5磷酸基戊酸(APV), 氰基2硝基喹啉2，3二酮(CNQX),谷氨酸(美国Sigma公司)；微电极放大器,RM 6240数据采集系统，其余化学产品均为国产分析纯.
方法
杏仁核脑片制备将SD大鼠以氟烷麻醉后断头，迅速取脑，放置在低于4℃的冰冷人工脑脊液中并进行修块. 人工脑脊液中各种离子成分及其浓度(mmol/L)为：NaCl 124，KCl ，CaCl2 ，MgCl2 ，NaH2PO3 ，NaHCO3 25,葡萄糖11. 人工脑脊液始终充以950 mL/L O2和50 mL/L CO2，～ 用振动切片机把含有杏仁核或海马的大脑部分切成脑片，厚度500 μm. 脑片实验记录前在常温人工脑脊液中孵育至少1 h.
杏仁核脑片场电位记录将脑片移至界面型记录槽(自制)，通过尼龙网与槽内人工脑脊液接触，以1～2 mL/min持续灌流脑片,脑脊液温度控制在(30±1)℃，用950 mL/L O2和50 mL/L CO2混合气体弥散在脑片周围. 在解剖显微镜下将双极不锈钢刺激电极置于外囊，记录微电极置于基底外侧杏仁核(basolateral amygdale, BLA)区，其尖端置于脑片表面下约200 μm处. 刺激电极与记录部位之间的距离约为2 mm. 微电极内充灌3 mol/L NaCl溶液，阻抗为2～5 MΩ. 场电位经微电极放大器放大后，输出信号用数据采集系统RM6240进行信号的记录、分析和处理. 场电位记录基线稳定20 min后才开始下一步的实验. 场电位的斜率用平均基础值标准化. 常规刺激的单相方波信号由RM6240的程控刺激器产生. 刺激方波的波宽为 ms，频率为 Hz，并调整刺激强度使突触反应等于最大突触电位的一半. LTP的引导应用两串频率为100 Hz的高频刺激，每串持续1 s，串间隔为10 min. 记录海马场电位时刺激电极放置于海马区的Schafer侧支通路上，记录电极位于海马CA1区.
药物加入实验过程中应用的药物均加入到灌流脑片的人工脑脊液中.
统计学处理:采用统计分析软件进行数据录入和整理，实验数据用x±s表示，组间采用方差分析. 为差异具有统计学意义.
　　2结果
杏仁核与海马场电位的比较海马CA1区场电位的幅度为(±) mV. BLA的电位为(±) mV，其放大倍数为海马的10倍，杏仁核的场电位只有海马CA1场电位的1/10.
杏仁核场电位的药理学特性在灌流的人工脑脊液中加入 μmol/L谷氨酸,可见场电位明显增大，洗去谷氨酸后场电位基本恢复至基线的水平(图2A). 灌流液中加入α氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)受体拮抗剂CNQX 10 μmol后，场电位的幅度显着下降，进一步加入N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体阻断剂APV100 μmol后，场电位几乎消失,洗去CNQX和APV后，场电位基本恢复至加药前的水平(图 2B).
杏仁核LTP的诱导在场电位记录稳定10 min后，间隔10 min应用两串高频刺激外囊，同时观察场电位幅度和斜率的变化情况. BLA场电位的幅度和斜率的变化趋势一致(表1)，两串高频刺激后，场电位明显增大，之后场电位逐渐下降，高频刺激15 min后场电位基本稳定，但仍显着大于基础值,这种增强作用持续30 min以上. 通过对场电位斜率用基础值标准化后，可见两串高频刺激后30 min增强的场电位的斜率仍然维持在基础值的(±)％(n=9, ，图3).表1两串高频刺激前后场电位幅度和斜率的变化
3讨论
杏仁核又称杏仁复合体，是大多数哺乳类动物共有的结构，位于颞叶内. 杏仁核可分为许多大小不等的核团，通常将这些核群分为皮质内侧群、基底外侧核群和前杏仁区、皮质杏仁移行区两大过渡区［4］. 杏仁核与皮层和皮层下结构有着广泛的纤维联系，随着神经科学的发展，杏仁核的功能倍受关注［5］. 然而由于解剖结构的关系，很难通过电生理的手段直接记录到在体动物杏仁核的神经细胞的活动，而且在体实验易受到血压、呼吸和血脑屏障等的影响. 脑片标本具有有序的神经元和纤维排列及比较完整的神经解剖通路，可在解剖显微镜下直接定位，便于电生理操作，脑片能够复制出整体动物大多数电生理现象，模拟在体实验，因而脑片是研究杏仁核功能的比较理想的标本.
脑片上应用场电位记录的方法研究神经细胞的活动多数是在海马上进行［6］. 有研究［7］报道，通过记录杏仁核的场电位研究杏仁核功能，然而这类研究都是在国外的研究室开展，而且实验仪器都是国外生产，价格昂贵. 我们应用国产SWF2W微电极放大器和RM6240记录系统，价格便宜，而且可以稳定地记录到杏仁核的场电位. 杏仁核的神经细胞分布较稀疏，场电位小，大约只有海马的1/10，实验中要求信号的放大倍数为记录海马CA1的10倍. 由于信噪比小，因此记录稳定的杏仁核场电位难度极大. 在脑片保持良好活性的前提下，记录系统要求抗干扰强，噪音的幅度应小于 mV. 记录系统具有良好的屏蔽和接地后，如果还有比较大的50 Hz的噪音，可使用噪音消除器去除该频率的干扰，但又不影响信号本身的提取. 在脑片保持良好活性及记录系统具有很强的抗干扰作用的情况下，只要信号放大到一定程度，就可以在杏仁核记录到场电位.
在杏仁核的脑片上，刺激外囊可以在BLA记录到突触后反应，来自皮层的神经纤维经外囊投射至BLA，刺激外囊可模拟皮层的兴奋输入［8］. 由皮层投射到BLA的纤维主要是谷氨酸能神经元，BLA记录到的主要是兴奋性的突触后电位. 在灌流液中加入谷氨酸，场电位明显增大；加入AMPA受体阻断剂CNQX后，场电位的幅度显着降低，进一步加入NMDA受体拮抗剂APV后，场电位几乎完全被阻断，洗去阻断剂后场电位基本恢复，提示外囊至BLA的突触联系主要以谷氨酸为神经递质，由AMPA受体和NMDA受体介导，以前者为主. 也提示在灌流液中加入药物，通过观察药物对场电位的作用探讨药物对杏仁核功能的影响.
脑片场电位常用于研究海马的突触可塑性如LTP和LTD，LTP和LTD被认为是学习记忆的基本机制［9］. 研究表明杏仁核参与情绪情感相关的学习与记忆过程，提示杏仁核的场电位有可能诱导出LTP. 结果表明，我们的实验系统在杏仁核可以诱导出LTP,实验中相隔10 min予以外囊高频刺激，观察到记录的BLA场电位的幅度和斜率均明显增大，而且持续时间在30 min以上. 杏仁核的LTP可能参与了学习与记忆的过程，杏仁核的场电位记录有助于研究杏仁核的突触可塑性.
综上所述，在杏仁核脑片上建立稳定的场电位记录方法，有利于研究杏仁核的功能、观察药物对杏仁核的作用以及探讨杏仁核在精神疾病中的作用及其机制.
【参考文献】
［1］ Murray EA. The amygdala, reward and emotion［J］. Trends Cogn Sci, 2007,11(11):489-497.
［2］ 李涛，王晓峰，李拴德，等. 精神分裂症患者额叶至杏仁核径路中电阻值变化规律的观察［J］. 第四军医大学学报，2003,24:54-55.
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［4］ Swanson LW, Petrovich GD. What is the amygdala?［J］. Trends Neurosci, 1998, 21(8):323-331.
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［7］ Alexandra K, Gal RL. Effects of stress and corticosterone on activity and plasticity in the amygdale［J］. J Neurosci Res, 2006,84(7):1580-1587.
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［9］ Sarvey JM, Burgard EC, Decker G. Longterm potentiation: Studies in the hippocampal slice［J］. J Neurosci Methods, 1989,28(1-2):109-124.