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Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序【摘要】 目的：利用RNA干扰(RNAi)技术，以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体，并进行测序鉴定. 方法：设计具有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体中构建重组表达载体，转化DH5菌株，提取质粒行酶切鉴定后，并进行序列测定. 结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上，经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论：Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功，可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录，供抗肿瘤研究参考.【关键词】 survivin基因；RNA干扰；重组表达载体0引言RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术. 用小片段RNA二聚体(small interfering RNA, siRNA)对高等哺乳动物细胞进行转导，成功排除了长片段双链RNA (doublestranded RNA, dsRNA)在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的现象，但其主要障碍是长于30 nt的双链RNA将激活抗病毒机制，导致非特异性的RNA转录降解. 而体外合成21 nt的siRNA能够成功地特异性抑制哺乳动物的基因表达1-3. 本实验我们针对凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein, IAP)基因家族的survivin基因的短发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)构建重组表达载体，为体外和体内抗肿瘤研究提供平台.1材料和方法材料含有人H1启动子的pSilencer 质粒为美国Ambion公司产品，由西南医院皮肤科王继文博士赠送. 克隆用大肠杆菌DH5由本校烧伤科实验室董征学硕士赠送. 限制性内切酶BamH,Hind及T4 DNA连接酶、核酸分子质量标准Hind digest, DL2000均为TaKaRa公司产品. 质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒均为美国Omega公司产品.方法基因干扰片段shRNA的设计与合成氯化钙法制备DH5大肠杆菌感受态细胞冻存于-70备用；扩增和纯化质粒根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列(No NM 001168)，参考shRNA设计原则进行设计4 ，最后选择出三条片段作为survivin基因干扰片段. 以间隔序列连接干扰片段正向和反向序列，两端加酶切位点，最后得到具有回文结构和发夹结构(hairpin siRNA)的干扰片段序列，并将其送北京赛百盛生物试剂公司合成.表达载体的构建将每对要退火的两条片段分别取2 L与46 L退火缓冲液混合，利用PCR仪加热至95 3 min，然后70水浴,自然冷却至室温. 用45 L的无酶去离子水稀释5 L的退火双链，使其终浓度为8 mg/L. 载体经BamH和Hind双酶切. 将退火片段与经酶切后的载体按摩尔比31的比例进行连接反应，同时设立阴性对照和质粒的阳性对照反应，置16过夜. 将连接产物各取4 L分别接种于100 L的DH5感受态细胞中进行转化. 挑取单菌落扩增培养，质粒小量抽提试剂盒进行质粒试抽提. 用限制性内切酶Bgl分别对重组质粒进行单酶切(此位点为目的序列所特有的酶切位点)鉴定. 得到的重组质粒分别命名为, ,重组质粒测序鉴定将鉴定证实后的三个重组质粒各取1管菌液送大连宝生物工程有限公司测序. 所用引物为M13+.2结果载体双酶切鉴定回收酶切产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳后，可见环状质粒已被切开,大片段约为 kb，小片段为61 bp因太小而无法检测.筛选重组质粒，pSilencer ，pSilencer 培养板上均有细菌克隆长出，形态和大小基本一致；质粒的阳性转化对照有大量细菌克隆长出；阴性对照培养板上无细菌克隆长出，连接转化可能成功.单酶切鉴定重组质粒第2孔经Bgl单酶切的，因该质粒无此酶切位点故仍保持环状结构；第4，6，8孔为经Bgl单酶切的三个重组质粒，因该重组质粒含有此酶切位点故可被酶切成线状结构.重组质粒测序鉴定测序结果均包含目的序列(图3）.3讨论肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病. 肿瘤中细胞凋亡现象很可能是机体对抗肿瘤的主动措施，因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展及治疗中起着关键性的作用. 细胞凋亡(apoptosis)受多个基因的凋控，抑制凋亡的基因主要包括bcl2基因家族和IAP家族. 其中，survivin基因是IAP基因家族的新成员. 1997年Ambrosini等5利用效应细胞蛋白酶受体1cDNA在人类基因组文库中筛选克隆得到的新基因. Survivin N端含有一个杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR)分子，其中含有对抑制凋亡有重要作用的氨基酸残基Trp67，Pro33和Cys84，survivin通过这些氨基酸残基与Caspase3和Caspase7结合抑制Caspase的活性，在COOH端有一个由40个氨基酸组成的螺旋结构，通过螺旋结构与细胞分裂微管结合，从而抑制细胞凋亡. Survivin基因特异性表达于人和鼠的胚胎发育组织，在终末分化的成人组织中不表达，而在转化细胞株和人体内大多数恶性肿瘤组织中明显表达6. 它与细胞凋亡和增殖、肿瘤血管的生成密切相关，还参与细胞周期凋控，并影响着肿瘤的发生发展. 因此，以survivin为靶点的肿瘤基因治疗成为肿瘤治疗研究的重要方面.测序鉴定抑制基因表达的方法很多，目前研究使用较多的主要有反义RNA技术、RNA干扰技术、基因敲除等. 反义RNA技术的使用量较大，抑癌效率低. 而RNAi则具有选择余地大和扩增放大效应7，只需微量特异的dsRNA即可产生明显的抑癌效果，具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点. 除了技术方面的差别，两者的作用机制也不同. RNAi技术中siRNA序列选择余地大，2123 nts中如果改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶向mRNA起作用，因此RNAi可以应用于单个核苷酸突变基因的抑制表达. 以质粒为载体将siRNA导入细胞内，所形成的siRNA专一作用于靶向基因的细胞系可用于较长时间的功能研究8-9. RNAi技术与基因敲除技术相比，后者往往需要较长时间才能了解所缺失功能基因后的生物学现象，而前者则在转染细胞48 h后即可了解抑制靶向基因表达后的生物学现象.质粒包括一种人H1 RNA聚合酶启动子，利用相对单一的启动子和终止序列产生大量的小RNA. 同时，位于启动子下游的shRNA是为了在RNAi质粒进入宿主表达后，单链的RNA配对形成短的dsRNA，引发RNA干扰. 而且，该载体中含有可供筛选的潮霉素耐药基因和氨卞青霉素耐药基因，利于阳性重组子的克隆筛选. 因此，我们根据Genbank中报道的survivin基因核苷酸序列，参考shRNA设计原则设计出了三条阻断survivin基因表达的RNAi序列，并成功克隆至载体，为进一步研究体内外抗肿瘤治疗提供新方法.【参考文献】1 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cellsJ.Nature, 2001, 411(6836): 494-498.2 Caplen NJ, Parrish S, Imani F, et al. Specific inhibition of gene expression by small doublestranded RNAs in invertebrate systemsJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(17):9742-9747.3 Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, et al. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysateJ. EMBO J, 2001, 20(23): 6877-6888.4 Tuschl T, Zamore PD, Lehmann R,et al. Targeted mRNA degradation by doublestranded RNA in vitroJ. Genes Dev, 1999, 13(24): 3191-3197.5 Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, surviving, expressed in cancer and lymphomaJ. Nat Med, 1997, 3(8): 917.6 Adida C, Crotty PL, McGrath J, et al. Developmentally regulated expression of the novel cancer antiapoptosis gene surviving in human and mouse differentiationJ. Am J Pathol, 1998, 152(1): 43.7 Sui GH, Soohoo C, Shi Y, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cellsJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(8): 5515-5520.8 Mello CC, Conte D Jr. Revealing the world of RNA interferenceJ. Nature, 2004, 431(7006): 338-342.9 Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing J. Cell, 2001, 106(1):23-34.