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135Hz极低频电磁场对Hep G
【摘要】 目的： 观察135Hz极低频电磁场照射对Hep G2细胞生长及凋亡的影响. 方法： 用MTT比色法、流式细胞仪，检测经135Hz ELF照射6, 12, 24 h后相应时间点细胞的活性、细胞周期、凋亡细胞的比例，并用扫描电镜以及透射电镜观察细胞超微结构变化. 结果： ELF磁场暴露后，与相应对照组相比其A值均下降，细胞活性随照射时间延长而下降；使Hep G2细胞G1期阻滞，凋亡率随照射时间延长逐渐增高. 扫描电镜以及透射电镜观察到实验组细胞几种特殊的形态学特征： 凋亡细胞收缩，出泡，质膜及细胞器保持完整. 染色质浓缩于核膜，最后，细胞解离成凋亡小体. 结论： 135Hz的ELF照射抑制Hep G2细胞生长并促进其凋亡.

　　【关键词】 极低频电磁场；细胞凋亡；Hep G2细胞
　　0引言
　　手提电话、计算机等家用电器方便人们生活的同时所产生的极低频电磁场(ELF)越来越引起人们的广泛关注. 如何诱导肿瘤细胞发生凋亡，成为治疗肿瘤的主要研究思路之一［2］.Simko等［3］报道ELF持续照射可诱导肿瘤细胞凋亡. 研究表明细胞内游离Ca2+的浓度与细胞凋亡密切相关［4］，胞内高浓度的Ca2+可以激活内源性核酸内切酶从而导致细胞发生凋亡［5］. 我们采用流式细胞仪技术、MTT法、扫描电镜以及透射电子显微镜对细胞周期、细胞活性、凋亡率及细胞超微结构进行观测.
　　1材料和方法
　　材料
　　人肝癌Hep G2细胞，由病理教研室隋延仿教授惠赠. 主要试剂： 10 mL/L四氧化锇，丙酮，EPON812，乙腈，醋酸双氧铀. 主要仪器：流式细胞仪， JEE4X真空蒸发仪，JFC1100离子溅射仪， S520扫描电子显微镜， LKBNova超薄切片机， JEM2000EX透射电子显微镜.

　　方法
　　G2细胞培养将Hep G2细胞按照×108/L 密度接种于带孔的培养皿以及培养瓶中，以完全培养基(10 mL/L胎牛血清，青、链霉素1×105 U/L) 送入50 mL/L CO2的培养箱，37℃常规培养.

　　实验分组将细胞随机分为6组，实验组为3组，分别是6, 12, 24 h照射组；对照组为3组，分别是6, 12, 24 h对照组，对照组置于37℃孵箱中.
　　照射将Hep G2细胞放入XFDS超低频信号发生器中的TEM小室℃，并保持恒温. 将频率调至135Hz，电场强度为80 V/m，分6, 12, 24 h, 37℃进行辐照.
　　法检测细胞活性将Hep G2细胞均匀接种于96孔板，每组10个样本，细胞密度为1×107/mL，分别照射6, 12, 24 h后实验组以及对应时间点对照组弃去培养液，96孔板每孔加入MTT20 μL, 37℃继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲亚砜，振荡10 min，使结晶充分溶解，选取A490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测各孔A值.

　　流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率① 分别将6, 12, 24 h照射组及对应时间点对照组的Hep G2细胞消化，吹打成单细胞悬液； ② 将单细胞悬液在室温条件下离心，1400 r/min离心5 min后弃上清；③ 用冷PBS液洗涤一次；④ 将细胞以1×109/L的浓度重新悬浮于700 mL/L的乙醇中室温下固定30 min， PI染色；待测细胞凋亡率的活细胞用膜联素V试剂盒进行标记， Couter ELITE ESP型流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率.
　　扫描电镜观察① 制备细胞爬片： 将细胞制成细胞悬液，接种于含12 mm×12 mm盖玻片的培养板中，密度为4×108/L，常规培养；待细胞长成单层后，135 Hz ELF照射24 h;　mol/L PBS洗，5 min×2次，30 mL/L戊二醛固定30 min,　mol/L PBS洗，5 min×2次；4℃保存待用. ② 样品制备： 将爬片依次经乙腈梯度脱水；真空干燥仪干燥，喷金，扫描电镜下观察.
透射电镜观察① 样品制备： 将对数生长期各组的细胞制成悬液，离心成1 mm3细胞团，加入30 mg/L戊二醛，4℃固定2 h以上， mol/L PBS漂洗，5 min×2次；10 g/L锇酸后固定2 h,　mol/L PBS漂洗，5 min×2次；丙酮梯度脱水，浸透；Epon812包埋，65℃聚合24 h. 制备50 nm超薄切片，电子染色；② 透射电镜下观察.
　　统计学处理： 数据均以x±s表示，采用统计软件进行析因设计方差分析，组间两两比较用LSDt检验，认为差异有统计学意义.
　　2结果
　　G2细胞正常对照组之间A值差别不大， 照射6, 12, 24 h组与相应对照组有明显差异. 135 Hz的ELF作用细胞后，Hep G2细胞周期发生了改变， 凋亡率升高(Tab 2). 表1135Hz ELF对Hep G2细胞活性的影响表2细胞周期及凋亡率比较
　　电镜观察正常对照组细胞呈扁平状，细胞生长旺盛，核分裂相常见，细胞表面有丰富的微绒毛，符合肿瘤细胞形态特点. 照射24 h，细胞收缩，变圆，细胞表面出现大小不等的泡状隆起.透射电镜下， ① 6, 12, 24 h的正常对照组细胞呈圆形或椭圆型，体积大小不等，异型性明显，细胞表面微绒毛丰富，细胞之间可见桥粒连接，符合肿瘤细胞形态特点. ② 6 h照射组，少量细胞变圆，表面微绒毛减少，部分细胞表面出泡，线粒体浓缩，部分滑面内质网扩张，胞浆及染色质发生浓缩，核膜腔轻度扩张，异染色质增多，发生边集. ③ 12 h照射组，部分细胞胞浆内轻度泡状隆起突出于细胞表面，胞浆及部分线粒体浓缩，异染色质边集. ④ 24 h照射组，胞浆及染色质浓缩，分解成大小不等，形态不一的有膜包绕的团块，突出于细胞表面，团块脱落形成凋亡小体.
　　3讨论
　　细胞增殖调控与肿瘤发生的密切关系已被人们所认识. 关于ELF 是否影响正常细胞以及肿瘤细胞的增殖、分化无疑成为研究的热点［6，7］. 我们在实验中，应用透射电镜观察135 Hz的ELF照射Hep G2细胞所发生的形态学变化，表明这种照射可抑制Hep G2细胞生长并促进其凋亡.

　　细胞发生凋亡有其独特的形态学特征［8,9］： 亚细胞水平上，染色质浓缩，核裂解，核膜完整. 胞浆浓缩，内质网扩张. 随着凋亡的进一步发展，染色质沿核膜聚集成块，扩张的内质网与细胞膜融合，细胞膜卷曲，分别包绕各种细胞器和细胞核的染色质，并以出芽的方式使细胞发生碎裂，形成凋亡小体. 本实验中，我们观察到了135 Hz的ELF照射所引发的Hep G2细胞发生凋亡的细胞超微结构改变，但考虑到体外实验的局限性，135 Hz的ELF的这一作用尚需在动物体内实验加以验证.
　　我们实验的结果表明 ，在所用的实验条件下，低频电磁场的生物学效应： 在细胞水平上，表现为抑制Hep G2细胞的增殖；在染色体 DNA水平上，表现为对细胞周期的影响，使细胞S期百分比降低，使细胞组滞于G1期. 可以认为，135 Hz的ELF可能是通过改变Hep G2细胞的周期从而影响细胞增殖的［24］. 本实验中也同时观察到低频电磁场对细胞凋亡的影响，低频电磁场作用以后，Hep G2细胞的凋亡比率增高，说明135 Hz的ELF促进了细胞凋亡. 增殖与凋亡是对立而统一的整体，细胞群体表现出来的生长减低的效应，应该是细胞生长受抑制与细胞凋亡的综合体现. 135 Hz的ELF能抑制Hep G2细胞增殖的部分原因可能是促进了细胞的凋亡.
　　【参考文献】
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　　Xu GF, Liu QG, Liu QM, et al. Pancreatic acinar cell apoptosis in severe acute pancreastitis in rats ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(10): 908-910.
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