一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究_薛江林.pdf

一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究DOI：10.13746/j.njkj.2022154薛江林1，2，3，杨贵2，3，张宿义2，3，范宏筠1，3，张煜亮1，梅海1，母娟1，杨明永1，杜鑫2，王程1(1.泸州国宝天酿集团股份有限公司，四川 泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000)摘要：为探索特殊香型白酒的工艺条件，满足消费者对白酒的多元化需求，本实验在传统泸型酒酿酒工艺基础上借鉴学习浓型、酱型、清型3种香型白酒的酿造工艺，创新设计了一套特殊香型白酒的生产工艺。利用高通量测序技术对酿造关键过程中糟醅微生物群落结构进行分析，通过感官品评对酿造出的白酒进行评价。结果表明：整个酿造过程中共检出18种优势细菌、22种优势真菌，加入麸皮能够极大地降低细菌的多样性；优势细菌为醋酸杆菌属（Acetobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus），优势真菌为嗜热真菌属（Thermomyces）、曲霉属（Aspergillus）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、毕赤酵母属（Pichia）、丝衣霉属（Byssochlamys）等。加入麸皮能够在堆积阶段显著增加氨基酸、辅酶以及无机离子的代谢；从配料差异分析，河内白曲和糖化曲对堆积前后细菌群落结构的影响较小，麸皮影响较大，真菌恰好相反。感官分析表明，采用粉碎高粱、高温大曲、糖化曲的方式进行酿造，酿造出的酒体香气浓郁，焦香突出，口感醇厚、绵柔，别具一格。本研究不仅丰富了基础酒的风味成分研究，也创新了传统中国白酒的生产工艺。关键词：高通量测序；多样性；感官品评中图分类号：TS262.3；TS261.1文献标识码：A文章编号：1001-9286（2023）03-0035-07Study on Microbial Diversity in FermentedGrains of a Compound Flavor BaijiuXUE Jianglin1,2,3,YANG Gui2,3,ZHANG Suyi2,3,FAN Hongjun1,3,ZHANG Yuliang1,MEI Hai1,MU Juan1,YANG Mingyong1,DU Xin2and WANG Cheng1(1.Luzhou Guobao Tianniang Group Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;2.Luzhou Laojiao Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;3.School of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Yibin,Sichuan 644000,China)Abstract:In order to explore the technological conditions of special flavor Baijiu and to meet the diversified needs of consumers forBaijiu,a set of production process of a compound flavor Baijiu was developed based on the traditional production process of Nongx-iang Baijiu.The microbial community structure of the fermented grains in the production process was analyzed by high-throughput se-quencing technology,and the produced Baijiu was evaluated by sensory evaluation.The results showed that 18 dominant bacteria and22 dominant fungi were detected in the whole fermentation process,and the addition of bran could greatly reduce the diversity of bac-teria.The dominant bacteria were Acetobacter and Lactobacillus,and the dominant fungi were Thermomycetes,Aspergillus,Issatchen-kia,Pichia,Byssochlamys,etc.The addition of bran could significantly increase the metabolism of amino acids,coenzymes and inor-ganic ions at the stacking fermentation stage.Henei white starter and saccharification starter had little effect on the bacterial communi-ty structure before and after stacking fermentation,while bran had a greater effect;for fungi the opposite was the case.Sensory analy-sis showed that the liquor brewed by smashed sorghum,high-temperature Daqu and saccharification starter had strong aroma,promi-nent burnt aroma,and mellow and soft taste.This research has not only enriched the research on the flavor components of crude li-作者简介：薛江林（1991-），男，四川巴中人，硕士，工程师，从事酿酒技术研究。通讯作者：张宿义（1971-），男，博士，硕士生导师，正高级工程师，中国酿酒大师，从事酿酒技术及酒体设计研究。酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)3535酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)quor,but also innovated the production process of traditional Chinese Baijiu.Key words:high-throughput sequencing;diversity;sensory evaluation中国白酒由最初的浓香、酱香、清香3种基本香型发展到如今的十三大香型1，逐渐转向多种香型组合发展的方向。20世纪90年代末，各大酒企就提倡“浓香为主、多香并举”的生产发展战略2，以顺应社会快节奏、多社交、多频次等的消费需求3。目前针对白酒酿造工艺融合的研究，在国外研究较少，国内对于提高浓香型白酒出酒率及酒质的研究一直是行业内研究的重点，但在白酒酿造工艺融合的研究方面行业内一直在探索前进4-6。因此，本实验在传统泸型酒酿酒工艺基础上借鉴学习浓香型、酱香型、清香型白酒的酿造工艺，创新设计出一套特殊的白酒酿造工艺。通过分析不同工艺配料发酵过程的理化、风味、微生物以及白酒品质之间的关系不断优化调味酒酿造工艺；由多轮次试验得到三组较优的试验方案，通过高通量测序技术对3种试验方案的堆积前、入窖、出窖的糟醅微生物多样性、代谢途径进行分析研究；结合糟醅理化性质，以及最终酒质的感官尝评结果，确定出最优的工艺条件参数。本实验为中国白酒调味酒种类的丰富提供了一定参考，也对不同香型白酒的生产技术做出了一定的归纳总结。1材料与方法1.1材料、试剂及仪器材料：糯红高粱，四川联众供应链服务有限公司；谷壳，泸州市龙马潭区永福米厂；高温大曲，泸州市醇香生物制造有限公司；河内白曲，山东梁山徐坊大曲有限公司；糖化曲，安琪酵母股份有限公司。试验地点选在泸州某酒厂生产车间。试剂及耗材：氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、氯化钠、无水乙醇、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，分析纯，；2-辛醇，色谱纯，Sigma-Al-drich；购自聚合化工。仪器设备：TL2010S中通量组织研磨仪，北京鼎昊源科技有限公司；SP-756P 紫外可见分光光度计，上海屹谱仪器有限公司；MLS-375L全自动灭菌锅，日本日立公司；DHG-9245A烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；DL-1电炉，北京中兴伟业仪器有限公司；5804R 高速冷冻离心机，德国艾本德公司。1.2试验方法1.2.1工艺流程图1.2.2实验设计1.2.3取样每个方案同时做3口一样大小（3.2 m2.4 m1.8 m）的平行窖池，取堆积前、入窖、出窖三个时间点的样品，将统一方案的3口窖池所采样品置于无菌取样袋中立即密封混合均匀，再将其分为2份，1份保存在-20 用于理化特性检测，1 份保存在-80 用于基因组DNA提取。1.2.4理化指标检测理化指标检测参照书目 白酒分析与检测技术 和 白酒生产技术全书 中的步骤7-8。1.2.5DNA提取方法称取10 g糟样，用SDS9提取糟醅样品中微生物的基因组 DNA。基因组 DNA 送往上海美吉生图1工艺流程图表1实验配料方案组别方案1方案2方案3配料粉碎高粱+麸皮+高温大曲+河内白曲粉碎高粱+高温大曲+糖化曲粉碎高粱+麸皮+高温大曲+糖化曲3636物医药科技有限公司进行高通量测序，测序数据在美吉生物云平台(https:l/ GB/T 33404201610、GB/T 33405201611。1.2.7数据分析利用SPSS进行数据差异性检验分析，根据高通量扩增子测序数据，利用PICRUSt2(v2.2.0-b)对标记基因（16S/ITS）序列进行功能丰度预测，获得每个样本中对应的功能信息和丰度信息，并采用origin2018以及R语言进行绘图。2结果与分析2.1理化指标分析不同方案堆积、入窖、出窖糟醅水分、酸度、还原糖、淀粉含量如图 2 所示。糟醅水分含量为52.6%59.5%，发酵过程中每个方案的水分都呈现先降低后增加的趋势，变化差异显著，加麸皮在堆积过程中对水分消耗相对较大。3个方案的酸度变化差异显著，加麸皮能够增加溶氧，在堆积过程中酸能够快速被微生物代谢分解，在发酵过程中又能显著增加。从图2可以看出，方案1和方案3堆积和发酵前后酸度变化差异最大，方案1堆积前酸度最大，堆积后降为最小，发酵结束后又升至最大，方案2在堆积和发酵前后酸度变化差异最小。3种方案的还原糖和淀粉含量变化趋势基本一致，差异不明显，在堆积前后，方案2还原糖含量增加相对大于方案1和方案2，发酵前后，方案3中淀粉含量消耗最大，方案1和方案2次之。2.2微生物群落结构分析2.2.1糟醅微生物多样性分析对 3 个不同方案糟醅样品的 ASV（AmpliconSequence Variant）集、Chao1指数和Shannon指数进行比较分析（表2），可以看出，Chao1和Shannon指数都呈现先减少后增加的趋势，方案1和方案3中细菌堆积前后丰富度变化巨大，表明加入麸皮能够极大地降低细菌的多样性，对真菌却影响不显著；方案2整体变化相对较小；真菌堆积前后丰富度变化并不明显，在发酵过程中增加。2.2.2不同方案糟醅细菌群落结构对比分析糟醅原核微生物群落组成（1%合并为Oth-ers)如图3所示，不同方案中共检出18种优势细菌，细菌种类组成相似，丰度存在差异。从整体上来看，3种方案在堆积和发酵结束时，入窖和出窖糟醅的细菌结构相似，优势微生物分别为醋酸杆菌属（Acetobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus），丰度超过 90%；不同点更多在于堆积过程，通过对比D1、D2和D3，不难发现，D1和D3的细菌结构具有相似性，可能是由于都加有麸皮所导致，差别在于D3中克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)丰度显著高于D1；相较于D1和D3，D2中Lactobacillus和芽孢杆菌属（Bacillus）的丰度更小，糖多孢菌属（Saccha-注：a.出窖糟醅水分；b.出窖糟醅酸度；c.出窖糟醅还原糖；d.出窖糟醅淀粉图23种方案理化指标表2不同方案的原核和真核微生物菌群多样性指数组别方案1方案2方案3样本D1R1C1D2R2C2D3R3C3细菌Chao1575.8857.1470173.1332595.287118.5Shannon3.860.240.874.191.231.263.80.81.81真菌Chao176.175.8174.62822.5238.159.740.990.2Shannon1.042.593.631.460.144.012.190.682.31薛江林，杨贵，张宿义，范宏筠，张煜亮，梅海，母娟，杨明永，杜鑫，王程 一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究3737酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)图3不同方案堆积、入窖和出窖糟醅细菌群落结构图4不同方案堆积、入窖和出窖糟醅真菌群落结构ropolyspora）和Solitalea的丰度更大。对比R1、R2和R3，在堆积过程中加麸皮能够显著增加疏松度，使得溶氧增加，好氧微生物的丰度显著大于不加麸皮；在C3中还存在一定量的Acetobacter，表明在方案3的整个发酵过程中，Acetobacter因麸皮的增氧属性，一直参与整个酿造过程。从配料差异分析，河内白曲和糖化曲在堆积前后对细菌群落结构的影响较小，麸皮影响较大。2.2.3不同方案糟醅真菌群落结构对比分析糟醅真核微生物群落组成（1%合并为Oth-ers)如图4所示，不同方案中共检出22种优势真菌，且真菌种类和丰度都存在显著差异。对比发现，在堆积前，方案 1 的真菌优势微生物为嗜热真菌属（Thermomyces 89%），方案 2 为 Thermomyces 13%和曲霉属（Aspergillus 76%），方案 3 为丝衣霉属（Byssochlamys 12%）、Thermomyces 31%、Aspergil-3838lus 16%、嗜热子囊菌属（Thermoascus 30%）。堆积后，方案1中优势微生物以酵母属为主，包括伊萨酵母属（Issatchenkia 29%）、毕赤酵母属（Pichia29%）以及哈萨克斯坦酵母（Kazachstania 25%）；方案2优势微生物以Byssochlamys 98%为主；方案3 优势真菌微生物为 Byssochlamys 87%和 Issatch-enkia 10%。出窖后，方案1优势微生物群落结构复 杂，包 括 Byssochlamys 8.8%、Thermomyces2.6%、Aspergillus 7.9%、Issatchenkia 27%、Pichia15%、青霉菌属（Penicillium 4.2%）、节担菌属（Wal-lemia 7.4%）、Thermoascus 3.1%；方案2真菌微生物种类呈多元化，其中优势微生物为Byssochlamys2.7%、Thermomyces 2.4%、Aspergillus 6.9%、Is-satchenkia 9%、Penicillium 9.5%、Pichia 4.7%、Wallemia 23%；方案 3 优势微生物包括 Byssochla-mys 14%、Aspergillus 6%和Penicillium 52%。对比3种方案，从微生物的种类、多样性和丰度进行讨论，在堆积前期，不同种曲药使优势真菌微生物群落结构差异巨大；堆积过后，方案1的优势微生物主要集中在酵母属，方案2和方案3的优势微生物主要集中在霉菌属；发酵结束后，各方案中真菌微生物种类基本一致，丰度各有不同。可见，不同种曲药对整个发酵过程微生物群落结构的影响要远大于辅料对白酒酿造的影响。值得注意的是，优势微生物 Thermomyces 能够产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶和脂肪酶等酶类，为酵母的生长提供了重要动力，同时还能产生蛋白酶，为美拉德反应提供物质基础，故该菌在白酒酿造过程中有着重要的作用12-13；Aspergillus 能够合成纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、果胶酶，还能合成有机酸14-15，这可能是方案2在堆积过程中酸度降幅最小以及在堆积结束时 Byssochlamys 成为优势微生物的原因之一。2.3微生物代谢通路及主要代谢功能分析通过图5分析可见，代谢通路占比最大，3个方案之间差异较大，方案1和方案3呈现先增加后减少的趋势，方案2呈现持续减少的趋势。具体通过图6可以看出，在方案1、方案2以及方案3的代谢功能丰度对比中，可以明显看出，方案2要大于方案1和方案3。在氨基酸、辅酶和无机离子代谢中，图5各方案堆积和发酵前后细菌微生物群落KEGG通路分布图6各方案堆积和发酵前后细菌微生物群落主要COG代谢功能分布薛江林，杨贵，张宿义，范宏筠，张煜亮，梅海，母娟，杨明永，杜鑫，王程 一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究3939酿酒科技2023年第3期（总第345期）LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.3(Tol.345)堆积后方案1和方案3丰度显著增加，在发酵阶段显著降低，方案2呈减小趋势，表明加入麸皮确实能够在堆积阶段显著增加氨基酸、辅酶以及无机离子的代谢。然而通过对比发现，方案1和方案3在堆积过程中氨基酸、辅酶以及无机离子的COG代谢丰度相较于方案2更小，表明加入麸皮，糟醅中空隙增加的同时也使得细菌微生物的平均丰度降低，从而在堆积前COG代谢功能丰度降低，进一步表明方案2对含氮类物质的代谢消耗更多。在碳水化合物的代谢中，方案1和方案3在堆积前后变化不大，在发酵过程中，逐渐增加；方案2随着酿造时间的增加，碳水化合物的代谢途径呈现先减小后增加的趋势,表明方案1和方案3中的细菌微生物对淀粉、糖等物质的消耗速度一直在增加，方案2在堆积过程中细菌微生物对淀粉、糖等物质的消耗速度逐渐降低，在发酵过程中逐渐增加，堆积前的代谢丰度却大于方案1和方案3。结合图2可以看出，在入窖和出窖糟醅中，3种方案的优势细菌微生物都是 Acetobacter 和 Lactobacillus，且丰度相差比不显著，说明3种方案发酵过程中细菌微生物对淀粉、糖等的消耗速度基本一致，在堆积前后存在较大差异。2.4基础酒感官尝评结果分析组织专家对三个试验方案三个轮次共九个综合酒样进行感官品评,对每个试验方案的三个酒样分数进行综合平均排序，专家组由4名酿酒专家和6名品酒专家组成，白酒感官品评严格按照国家标准GB/T 334042016进行，评分细则主要包括：色泽（5分）、香气（25分）、口感（60分）、风格（10分）四个方面。专家组给出的综合平均结果如表3所示。对评价结果绘制风味雷达图如图7所示。结合基础酒的品评结果及图7可以分析总结出，经过高温堆积、入窖发酵、量质摘酒、长期储存等酿酒工艺后，所酿基础酒在色泽、香气、口感、风格等方面融合了浓香型、酱香型白酒风格之长，特点突出、复合优雅。三实验方案三个轮次共9个酒样的酒体皆表现为无色或微黄透明、复合感强、风格独特，特别是方案F1（高温大曲+糖化曲）放置一年以后的基础酒酒体颜色明显微黄，醇厚绵甜、丰满协调、具有非常舒适优雅的复合香气。3结论通过对酿造过程中微生物多样性、代谢通路以及基酒的感官品评，发现不同方案之间差异巨大。方案2（高温大曲+糖化曲）的评价结果优于方案1（高温大曲+河内白曲+麸皮）和方案3（高温大曲+糖化曲+麸皮）。通过多轮次实验，最终确定方案2更适用于特殊香型白酒的酿造。通过研究不同香型的工艺融合，分析不同工艺配料发酵过程的理化、风味、微生物以及白酒品质之间的关系来不断优化调味酒酿造工艺，为丰富中国白酒调味酒种类，创新传统中国白酒的生产工艺以及满足消费者多元化需求奠定了坚实基础。参考文献：1GAO W J,FAN W L,XU Y.Characterization of the keyodorants in light aroma type chinese liquor by gaschromatography-olfactometry,quantitativemeasurements,aroma recombination,and omissionstudiesJ.Journal of agricultural and food chemistry,2014,62(25)：5796-5804.2WANG X X,FAN W L,XU Y.Comparison on aroma表3基础酒综合样对比品评记录表酒样F1F2F3特征色泽4.554.5香气232423口感565857风格8.59.59得分9296.593.5评语略带焦香，后味略酸复合香感强，风格独特复合香较强，略带焦香图7基酒感官评价雷达图4040compounds in Chinese soy sauce and strong aroma typeliquors by gas chromatography-olfactometry,chemicalquantitative and odor activity values analysisJ.Europeanfood research technology,2014,239：813-825.3李梦婷,许德富,敖宗华,等.高酸调味酒酿造研究综述J.中国酿造,2020(12)：20-23.4李增,程伟,张倩,等.金种子中国力量复合香白酒的生产工艺分析与探讨J.酿酒科技,2019(8)：48-53.5张宿义,许德富.泸型酒技艺大全M.北京：中国轻工业出版社,2011.6高志远,程伟,张杰,等.一种多粮复合香型白酒的酿造工艺分析与探讨J.酿酒科技,2019(9)：48-51.7沈怡方.白酒生产技术全书M.北京：中国轻工业出版社,1998.8先元华,李雪梅.白酒分析与检测技术M.北京：中国轻工业出版社,2015.9ZHANG L Q,ZHOU R Q,ZHENG J,et al.Characterisation of microbial communities in Chineseliquor fermentation starters Daqu using nested PCR-DGGEJ.World journal of microbiology andbiotechnology,2014,30(12)：3055-3063.10中国轻工业联合会.白酒感官品评导则：GB/T 334042016S.北京：中国轻工业出版社,2016.11中国轻工业联合会.白酒感官品评术语：GB/T 334052016S.北京：中国轻工业出版社,2016.12ZHENG Y,SUN B G,ZHAO M,et al.Characterizationof the key odorants in Chinese Zhima aroma-type Baijiuby gas chromatography-olfactometry,quantitativemeasurements,aroma recombination,and omissionstudiesJ.Journal of agricultural food chemistry,2016,64(26)：5367-5374.13郑伟,薛江林,张炼,等.不同糖化发酵剂酿造复合香型白酒工艺研究J.食品与发酵工业,2022(21)：61-66.14赵春青,李多川.嗜热子囊菌两个中国新记录种J.菌物研究,2005,3(1)：27-28.15杨贵,张宿义,赵金松,等.一种调味白酒发酵过程中微生物菌群结构及代谢研究J.食品与发酵工业,2022,48(14)：1-10.生物代谢物质规律不明显。3.2微生物方面无论是否加菌液，窖泥的培养均以芽孢杆菌和乳酸菌启动，为厌氧体系的形成提供了经济高效的模式。加克氏梭菌或复合菌液培养，起始克氏梭菌的数量更高，但培养90 d后克氏梭菌的相对比例并不高于不加菌液培养的窖泥。窖泥中还存在其他相对比例更高的产己酸菌，比如 Caproiciprodu-cens、Megasphaera 埃氏巨球型菌、Ruminococcus_1瘤球菌1。3组在发酵过程均出现放线菌，克氏组比例高于对照和复合，己酸菌和放线菌具有协同促进生长的作用，种类较多的放线菌可结瘤固氮，为窖泥己酸菌提供丰富的有机氮，增强窖泥肥力。同时还存在其他的厌氧菌影响窖泥的质量。培育中的窖泥微生态系统是由己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌等多种微生物组成的微生物共生群落系统，该微生物群落随发酵时间的不同，导致窖泥的化学生态不同,菌类菌种呈现明显的区别。窖泥的培育过程是一个典型微生态群落的演替过程和各菌种间的共生、共酵、代谢调控过程，该过程不但对微生态群落中的菌种演替具有反馈抑制作用，而且会体现到窖泥的理化以及感官上，直接影响窖泥的质量。参考文献：1姚继承,张宗奇.影响己酸菌生长代谢的因素与培养应用J.酿酒科技,2008(2)：82-85.2戚元民.有关窖泥老化及保养J.山东食品发酵,2012(3)：26-28.3范文来,徐岩.白酒窖泥挥发性成分研究J.酿酒,2010(3)：24-31.4杜礼泉.浓香型大曲酒生产中正丁醇生成量差异的原因C/2006年第六届国际酒文化学术研讨会论文集.2006.5杨鹏举.窖泥中微生物菌群及其代谢模式J.酿酒科技,1995(2)：14-17.6吴天福.丁酸梭菌厌氧发酵机制及高密度厌氧发酵方式研究进展J.食品与机械,2020(1)：222-229.7朱晓军.浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析D.无锡：江南大学,2018.8鲁少文,魏翠翠,李泽华,等.新型己酸菌强化对人工窖泥培养过程中原核生物群落结构及酸酯含量的影响J.应用与环境生物学报,2020(1)：144-151.（上接第34页）薛江林，杨贵，张宿义，范宏筠，张煜亮，梅海，母娟，杨明永，杜鑫，王程 一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究4141