昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的影响_马玲利.pdf

2023年 第53卷 第2期81非酒精性脂肪肝是最常见的慢性肝病，其特点是肝脏的脂肪积累超过了5%，并且没有明显的酒精摄入、病毒感染或任何特定的肝病原因1。据报道，我国成人非酒精性脂肪肝的患病率为6%27%2。目前针对治疗非酒精性脂肪肝病还没有批准药物上市3，饮食干预和运动干预仍然是治疗非酒精性脂肪肝的基本和主要方法，但由于每个有机体都有平衡热量摄入的减少与静息代谢率下降的机能特征，使得该病的维持及治疗效果甚微4。因此，有必要研究适合非酒精性脂肪肝患者的饮食干预措施。间歇性禁食是一种备受关注的饮食干预措施，其定义是在一定时期内不吃、少吃少喝或两者兼有，目前已成为一种促进身体健康的饮食模式，并可作为对各种疾病，特别是对代谢收稿日期：2022-11-23作者简介：马玲利，在读硕士研究生，主要从事临床兽医学研究。E-mail：通信作者：李倬，教授，主要从事生物制品的质量控制研究。E-mail：性疾病的潜在干预措施，包括限时饮食、斋月禁食等多种模式5-6。限时饮食是对饮食的时间有限制，除进食时间外，其他时间禁止饮食饮水；斋月禁食是穆斯林特有的饮食方式，每天从日出至日落禁食、禁水，日落后开始饮食、饮水7。限时饮食和斋月禁食两者之间的主要差异是禁食者的昼夜节律不同。昼夜节律是哺乳动物特有的，以24h为一周期8。有研究表明，肝脏器官的细胞及其控制的代谢活动，包括营养物质的吸收、加工、转运等，以及糖、脂质、胆固醇和胆汁酸的代谢也都具有明显的昼夜节律性9。因此，本试验以小鼠为研究对象，研究昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的影响，为研究间歇性禁食对人体非酒精性脂肪肝的作用及影响提供前期研究的参考数据。昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的影响马玲利，马剑波，马忠仁，李倬*（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）摘要：为了探究昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的影响，本研究以C57BL/6J小鼠为研究对象，建立一个饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠模型，通过观察并记录小鼠体重、肝脏形态、肝脏组织病理结果，探究昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的预防作用。结果表明，异常节律联合间歇性禁食可抑制小鼠体重增加及肝脂肪变性。关键词：昼夜节律；间歇性禁食；非酒精性脂肪肝；小鼠中图分类号：R361+.1；Q485文献标识码：A文章编号：1006-799X（2023）02-0081-05试验研究DOI:10.15979/62-1064/s.2023.02.012822023年 第53卷 第2期试验研究材料与方法1.1试验材料试验材料为4周龄C57BL/6J小鼠（雄性），购自兰州兽医研究所实验动物中心。1.2试验试剂及配置1.2.1试验试剂高脂饲料（中国苏州双狮实验动物饲料科技有限公司）、多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）、二甲苯（福晨（天津）化学试剂有限公司）、PBS磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司）、盐酸（成都市科龙化工试剂厂）、乙醇（江苏海兴化工有限公司）、油红（合肥博美生物科技有限责任公司）、苏木素染液和伊红（武汉赛维尔生物技术有限公司）、甘油（天津市富宇精细化工有限公司）、高效切片石蜡（上海华灵康复器械厂）、异丙醇（天津市致远化学试剂有限公司）。1.2.2试剂配置组织标本固定液：称取0.4kg多聚甲醛，加入500mL0.1mol/L的PBS磷酸盐缓冲液（pH值7.27.4），逐渐加热至60，一边搅拌一边滴加1mol/LNaOH直至溶液清亮为止，待液体冷却后，再加PBS缓冲液定容至1L，调节pH值至7.4左右，即得40%甲醛溶液；量取100mL40%甲醛溶液，加入磷酸二氢钠6.5g，再加入蒸馏水900mL混匀后，调节pH值至7.0左右，保存。盐酸乙醇分化液：量取416mL无水乙醇，加入178mL蒸馏水混合均匀后，再缓慢加入600mL浓盐酸，快速混匀封口，防止盐酸挥发。脱水试剂：取无水乙醇用蒸馏水稀释，配成浓度为70%、80%和90%乙醇溶液，封口备用。1.3试验方法1.3.1动物饲养与干预饲养环境：小鼠饲养标准温度为1823、湿度为50%、光照周期为12h（12h光照、12h黑暗）。诱导与干预方法：小鼠正常饮食饲喂1周后开始试验，正常饮食的1周记为第0周。将23只小鼠随机分为3组，其中，对照组8只，间歇性禁食（正常节律）组8只，间歇性禁食（异常节律）组7只。每4只小鼠饲养在1个笼子里，3组小鼠的饮食均为高脂高糖饮食。对照组小鼠每日自由饮水和饮食，经高脂高糖饮食诱导使小鼠成为脂肪肝阳性对照。因为考虑到小鼠是夜行动物，昼夜节律与人类相反，因此间歇性禁食（正常节律）组小鼠从白天8点至晚上8点禁食禁水，而晚上8点至次日早上8点自由饮水和饮食。间歇性禁食（异常节律）组小鼠从白天8点至晚上8点自由饮食饮水，晚上8点至次日早上8点禁食禁水。1.3.2体重测量在第4周、第8周、第12周的同一时间点，分别对3组小鼠测量体重。1.3.3肝脏形态观察在第12周对小鼠进行解剖，观察肝脏形态并拍照记录。1.3.4肝脏组织病理检测12周时，解剖小鼠取新鲜肝脏制作肝脏去蜡切片（46 m），按标准程序用苏木精和伊红（H&E）染色。具体操作流程如下：切片脱蜡苏木精染色1020min自来水冲洗13min盐酸酒精分化510s自来水冲洗13min放入50的温水或弱碱性水溶液中返蓝自来水冲洗13min放入85%酒精溶液中浸泡35min使用伊红进行染色35min水洗35s梯度酒精脱水二甲苯透明中性树胶封固镜检。用油红O染色法观察肝脏脂肪积累情况。新鲜肝脏用OCT冰冻切片包埋剂速冻后切成68 m切片，然后采用标准方法进行染色：蒸馏水水洗使用60%异丙醇浸洗使用油红O染液染色10min使用60%异丙醇分色至背景无色蒸馏水水洗使用苏木精进行复染自来水洗（蓝化）13min蒸馏水水洗甘油封片。采用Image-Plus软件进行油红O染色平均光密度分析。1.4统计学分析应用GraphPadPrism8.2统计软件对小鼠体重数据进行处理和分析，体重数据以“平均数标准差”（MeansSD）的形式呈现，两组样本间的比较使用单因素方差分析，P0.05表示差异显著。2023年 第53卷 第2期83结果2.1 间歇性禁食（异常节律）可抑制高脂高糖饮食喂养小鼠的体重增加分析第4周、第8周和第12周小鼠体重测量结果（图1），发现第4周时，对照组小鼠平均体重是26.632.56g，间歇性禁食（正常节律）组小鼠平均体重是25.382.90g，间歇性禁食（异常节律）组小鼠平均体重是26.751.70g（图1a）；第8周时，对照组小鼠平均体重是34.234.42g，间歇性禁食（正常节律）组小鼠平均体重是33.226.41g，间歇性禁食（异常节律）组小鼠平均体重是28.172.70g（图1b）；第12周时，对照组小鼠平均体重是36.445.53g，间歇性禁食（正常节律）组小鼠平均体重是40.228.41g，间歇性禁食（异常节律）组小鼠平均体重是30.012.24g（图1c）。如图1所示，随着时间的延长，3组小鼠体重均有所增加，但是增幅有所差异，第8周时，相比于前2组，间歇性禁食（异常节律）组小鼠体重增加量最低，且与对照相比差异显著（P0.05）；第12周时，与对照组相比，间歇性禁食（正常节律）组小鼠体重增加，而间歇性禁食（异常节律）组小鼠体重下降显著（P0.05）。Gotthardt等10和Spezani等11研究发现间歇性禁食异常节律可以显著抑制高脂高糖饮食小鼠体重增加，这与本研究结果一致。2.2间歇性禁食可改善饮食诱导的小鼠肝脂肪变性第12周解剖小鼠，观察3组肝脏图片（图2）发现，对照组小鼠肝脏脂肪变性明显，肝脏肥大，由于脂肪的沉积，肝脏边缘钝而厚，肝脏质地变硬脆，肝脏表面有一层黄色的脂肪分布（图2a）；间歇性禁食（正常节律）组小鼠肝脏颜色暗红，变性不明显（图2b）；而间歇性禁食（异常节律）组小鼠肝脏为红褐色，肝脏质地柔软，无明显变性（图2c）。以上结果说明间歇性禁食显著抑制了肝脏中的脂质积累。为探究小鼠肝脏组织学变化特点，对小鼠肝脏进行了H&E染色，结果如图3所示。由于受到高糖高脂饮食的诱导干预，对照组小鼠的肝小叶结构遭到破坏，因受到挤压出现了变形，肝细胞的排列紊乱且拥挤，出现了明显水肿，细胞核固缩染色加深，出现了大量空泡状的脂肪细胞，细胞呈现坏死性损伤状态（图3a）；与对照组相比，间歇性禁食（节律正常）组小鼠肝细胞水肿减轻，空泡细胞数减少，细胞坏死性损伤也减轻（图3b）；间歇性禁食（节律异常）组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝窦无明显扩张和挤压，肝细胞形态正常，没有出现明显的炎性病灶和脂肪变性（图3c）。以上结果说明间歇性禁食可以减轻因高糖高脂饮食诱导的肝组织细胞积累脂肪，尤其是联合节律异常的生活干预抑制脂肪积累效果更加显著。图1第4周、第8周和第12周小鼠体重测量结果图3小鼠肝脏组织H&E染色图2小鼠肝脏对比油红O是脂溶性染料，能使细胞内脂肪高度溶解，可特异性地使肝脏组织内甘油三酯等中性脂肪染成红色。小鼠肝脏组织的油红O染色结果如图4所示，对照组小鼠肝脏细胞水肿变性，脂肪滴的堆积明显，红染脂肪滴的面积显著增加（图4a）；相比对照组，间歇性禁食（节律试验研究842023年 第53卷 第2期试验研究图4小鼠肝脏组织油红O染色正常）组小鼠肝脏脂滴的积累减少，水肿变性和炎性细胞浸润减轻，红染脂肪滴的面积减少（图4b）；间歇性禁食（节律异常）组小鼠的肝组织细胞排列整齐，结构完整，未见红染脂肪滴和明显的病理改变（图4c）。讨论与结论非酒精性脂肪肝给个人、家庭和卫生保健系统带来巨大负担12，但目前还没有有效的治疗药物。不良生活方式和过度营养是非酒精性脂肪肝发生发展的重要因素13。许多健康指南中对预防非酒精性脂肪肝提出了控制风险因素和改变生活方式的建议，包括改变饮食习惯和增加体育活动等方式14。饮食限制增加了内源性脂肪酸的合成，而膳食和内源性合成的脂肪酸有助于形成全身脂肪酸库15-16。间歇性禁食是一种既定的饮食模式，多项研究表明，间歇性禁食可以帮助非酒精性脂肪肝患者减肥，改善患者肝纤维化状况，降低患者体内丙氨酸转移酶和天冬氨酸转移酶水平14,17。本试验以C57BL/6J小鼠为研究对象，探讨昼夜节律及间歇性禁食对小鼠非酒精性脂肪肝的影响，结果表明间歇性禁食可以减缓高脂高糖饮食喂养小鼠后的体重增长趋势，改善饮食诱导的肝脂肪变性，尤其是节律异常联合间歇性禁食效果更好，这可能是因为异常节律联合间歇性禁食重新调整了肝脏的代谢。科学研究发现，间歇性禁食可以改善胰岛素抵抗、减少炎症、降低血压和血液胆固醇水平，而在啮齿动物和非人灵长类动物中的广泛研究表明，饮食限制促进健康和长寿的分子机制主要涉及抑制雷帕霉素信号通路，及胰岛素/胰岛素样生长因子信号、生长激素信号和自噬通路中的靶点18-19。此外，间歇性禁食改善肝脏功能的机制被认为与其对昼夜生物学、肠道微生物群和生活方式行为的改变有关20-21。本研究虽然证明异常节律联合间歇性禁食可减轻小鼠体重及肝脂肪变性，但其具体协同增效机制尚不清楚，需进一步研究验证。参考文献1MichelottiGA,MachadoMV,DiehlAM.NAFLD,NASHandlivercancerJ.NatRevGastroenterolHepatol,2013,10(11):656-665.2非酒精性脂肪性肝病与相关代谢紊乱诊疗共识(第二版)J.临床肝胆病杂志,2018,34(10):2103-2108.3Bhushan B,Banerjee S,Paranjpe SP,et al.Inhibition of Epidermal 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