应用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体的效果_陈荫楠.pdf

1第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEDOI:10.3969/j.issn.1008-4118.2023.01.001*应用核糖体展示技术筛选抗人 p53 单链抗体的效果陈荫楠，罗婉妹，罗彩林，郑晨娜，郭娜燕（泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362000）摘要：目的 运用核糖体展示技术筛选抗人 p53 单链抗体，并进行初步分析。方法诱导表达 p53 蛋白，用其免疫小鼠。提取免疫小鼠脾脏组织的总 RNA，通过反转录 PCR 和重叠延伸 PCR 分别扩增抗体重链可变区基因 VH-Linker 和轻链可变区基因 VL-Linker，并合成 VH-linker-VL 型单链抗体基因。TNT T7 Quick for PCR DNA 试剂盒对单链抗体基因进行体外转录与翻译，以 p53 蛋白为靶标，经过 5 轮筛选富集 ScFv 基因。将获取单链抗体片段进行原核表达后，采用 ELISA 法和细胞免疫学法检测。结果 成功构建抗 p53 单链抗体库，并筛选出 p53 蛋白具有较强结合活性的单链抗体株 p53-scFv1、p53-scFv2 和 p53-scFv3，可用以检测细胞中的 p53 蛋白。结论 利用核糖体展示技术获得亲和力较好的抗人 p53 单链抗体，可为 p53 抗体的制备提供新思路。关键词：p53 蛋白；单链抗体；核糖体中图分类号：Q753 文献标识码：A 文章编号：1008-4118（2023）01-0001-06Screening of anti-human p53 single chain antibody by ribosome display technology CHEN Yinnan,LUO Wanmei,LUO Cailin,ZHENG Chenna,GUONayan（Quanzhou Medical College,Quanzhou 362000,Fujian）Abstract:Objective To screen and analyze anti-human p53 single chain antibody by ribosome display technology.Methods Immunemicewere induced expression of p53 protein.Total RNA was extracted from spleen tissues of immunized mice.The VH-Linker and VL-Linker genes were amplified by reverse transcription PCR and overlapping extension PCR respectively,and VH-Linker-VL type SCFV genes were synthesized.TNT T7 Quick for PCR DNA kit was used in transcription and translation of single chain antibody gene,with p53 protein as the target SCFV gene was enriched after five rounds of screening.After prokaryotic expression,the SCFV fragments were detected by ELISA and cellular immunoassay.Results Anti-p53 single chain antibody library was successfully constructed.The single chain antibody strains p53-scFv1,p53-scFv2 and p53-scFv3 with strong binding activity were screened out to detect p53 protein in cells.Conclusion The ribosome display technology was used to obtain anti-human p53 SCFV with good affinity,which can provide a new idea for the preparation of p53 antibody.Key words:p53 protein;Single-chain antibody;Ribosome基金项目：泉州医学高等专科学校科研项目（XJK1617B）p53 蛋白作为体内重要的转录因子，与机体的新陈代谢、免疫应答、DNA 的修复、肿瘤的发生等代谢过程密切相关。p53蛋白由于半衰期较短（约20 min），一般胞内浓度处于较低水平。野生型的p53 基因有抑癌作用，被称为基因卫士1。然而，当 p53 基因发生突变后，不仅失去了抑癌作用，而且促进了肿瘤细胞的形成，提高了对抗癌药的耐药性2。突变型的 p53 基因半衰期延长，在细胞内的含量会增加，可通过免疫学方法检测出来。检测肿瘤组织中p53蛋白的表达对早期诊断筛查、治疗方案及预后判断都有重要的参考意义3-4，因此，制备高效且便宜的 p53 抗体对 p53 蛋白的高2 第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE效检测及进一步研究具有重要的作用。随着基因重组技术的不断发展，抗体制备从传统的多克隆抗体、单克隆抗体发展到第三代基因工程抗体5-6。单链抗体作为新型的基因工程抗体，由含抗体重链可变区和轻链可变区组成，分子量小，细胞穿透能力强，无需经杂交瘤技术便可获得抗体7。核糖体抗体库技术通过 PCR 技术直接构建抗体基因文库，在体外进行转录和翻译，将核糖体表面表达的抗体与基因型进行偶联，最后用相应的目的蛋白筛选抗体8-9。该技术无需转化细胞，库容量大、操作简便10。本研究应用核糖体展示技术制备并筛选抗 p53 单链抗体，全程操作均在体外操作，过程简单、筛选效率高，便于大批量生产，为 p53 抗体的制备提供新思路。1材料和方法1.1 材料 p53蛋白实验室保存；E.coli DH5、E.coli BL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）、pET-32a（+）vector、pET-27b（+）vector 实验室保存；各种引物由上海生工生物有限公司合成；各种 DNA 限制性内切酶购自日本 Takara 公司；HRP 标记的抗 His-tag 抗体购自美国 Abcam 公司；First Strand cDNA Synthesis Kit 购自美 Thermo Fisher Scientific公司；山羊抗小鼠 IgG/FITC 标记购自北京中杉金桥生物科技有限公司。1.2 方法1.2.1 重组蛋白 p53 的分离纯化 将含有重组质粒pET-27b（+）-p53 的 E.coli DH5 菌株涂布于带有相应抗性的平板，培养过夜后，选取单克隆接种到含卡那抗性的 LB 液体培养基中，于 37下过夜培养至对数生长期，提取质粒11。将 提 取 的 pET-27b（+）-p53 质 粒 分 别 用PCR、双酶切的方法进行验证，将验证正确的重组质粒转化 E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞中，接种于含卡那霉素和氯霉素抗性的 LB 固体平板筛选转化子。选取的转化子接种于含抗性的液体培养基中，37、200 rpm 振荡培养至 OD600值达 0.6 时，加入 0.2 mM IPTG 诱导培养 3 h，同时以不加 IPTG诱导作为对照组。4、4000 rpm 离心 5 min 收集菌体，超声破碎后，分离出破碎菌液的上清和沉淀，SDS-PAGE 检测分析 p53 蛋白的表达。1.2.2 构建抗 p53 单链抗体文库 将获得的 p53 蛋白结合 Freund 佐剂对小鼠进行注射免疫，共免疫3 次，期间采集尾血测小鼠血清效价。达到要求后，从小鼠脾脏提取总 RNA，反转录成 cDNA，利用保守区引物扩增抗体的重、轻链12。具体引物序列如表 1 所示。表 1PCR 扩增引物基因引物序列（5 3）VHVH/backGCAGCTAATACGACTCACTATAGGAAGAACAGACCACCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG VH-linker/forGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTVLVL-linker/backTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCACk/forGCTCTAGAACACTCATTCCTGTTGGAGCTPCR 反应条件：95预变性 2 min，95变性30 s，58退火 30 s，72延伸 50 s，共 30 个循环，最后 72延伸 5 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后回收。通 过 重 叠 延 伸 PCR（SOE-PCR）将 获 得的 VH-linker 和 VL-linker 基因片段组装成 VH-linker-VL 单链抗体库。第一轮为无引物 PCR，按顺序加入下列试剂：2Ecotaq PCR supermix 20L、VH-linker 和 VL-linker 各 4L、ddH2O 12L，共 40L。扩增条件为：95预变性 2 min；95变性 30 s，52退火 30 s，72延伸 1 min，共 10 个循环。第二轮 PCR 反应体系为：2Ecotaq PCR supermix 5L、VH/back 和 Ck/for各 2L、ddH2O 1L，扩增条件设为：95预变3第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE性 2 min；95变性 30 s，58退火 30 s，72延伸 1 min，共 25 个循环。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后回收。1.2.3 核糖体展示技术翻译与筛选 单链抗体库在无 RNA 酶的 4环境中操作，于微量离心管中按顺序加入下列试剂：TNT T7 PCR Quick Master Mix 40L、1 mM Methionine 1L、DNA 模 板 8L、ddH2O 1L，共 50L。于 30水浴条件下反应 90 min。体外筛选步骤13-14：取 100L 纯化后的 p53蛋白包被于 96 孔板中，4反应过夜；次日，用PBS 缓冲液洗涤 3 次，加入 5%脱脂奶于 37封闭 1 h；再用 PBSM 缓冲液（含 5 mmol/L MgCl2）洗涤 3 次；将翻译混合物按每孔 50L 转至包被p53 蛋白的孔板中，置于冰上反应 2 h；PBSMT 缓冲液（含 0.5 mL/L Tween-20）洗涤 3 次；PBSM缓冲液洗涤 2 次；加入含 20 mM EDTA 的 1PBS缓冲液，在冰上放置10 min进行解离后吸取上清。以上清 mRNA 为模板，进行 RT-PCR，PCR 产物用以重复下一轮筛选。1.2.4 抗 p53 ScFv 的克隆和表达 将最后一轮筛选获得的基因产物两端插入 EcoR I 和 Xho I 酶切位点，双酶切后与经同样双酶切的表达载体 pET-32a（+）通过 T4 连接酶连接，重组质粒 pET-32a（+）-scFv 转化大肠杆菌 Rosetta2TM（DE3）感受态细胞中，用抗性平板（含 100g/mL 氨苄青霉素、25g/mL 氯霉素）筛选转化子。从中随机选取 100 个阳性克隆子，参照 1.2.1 进行小量诱导表达 p53 单链抗体。同时，随机挑取 50 个原始抗体基因表达的阳性重组子进行诱导表达，作为对照组。1.2.5 ELISA 检测抗 p53 单链抗体亲和力 采用ELISA 法检测单链抗体亲和力，具体实验操作如下15-16：包被 ScFv，于 37封闭 2 h，另设空白对照组和阴性对照组（包被 PBS）；加 100L p53 蛋白，37反应 1 h；加洗涤液 200L/孔，洗涤 3 次，3 min/次；加一抗：加 100L 稀释后的 p53 一抗，37反应 1 h；加洗涤液 200L/孔，洗涤 3 次，3min/次；加二抗：加稀释后 HRP-羊抗小鼠 IgG，100L/孔，37反应 1 h；加洗涤液 200L/孔，洗涤 3 次，3 min/次；显色：加100L 底物 TMB，避光条件下 37反应 15 min；终止：加入终止液 2 mol/L H2SO4、50L/孔；测定 OD450。1.2.6 细胞免疫化学法检测抗 p53 单链抗体亲和力 将 HepG2 细胞进行传代培养，点样于载玻片中；次日，用 4%多聚甲醛固定 20 min，PBS洗涤 3次；0.5%Triton 透化 20 min，PBS 洗涤 3 次；4%H2O2去内源性过氧化物酶透化 10 min，PBS 洗涤 3 次；5%脱脂奶于 37下封闭 30 min；加入 ScFv 于37反应 1 h，PBS 洗涤 3 次；加入 His-tag 抗体 37 反应 1 h，PBS 洗涤 3 次；加 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 于 37反应 1 h，PBS 洗涤 3 次；加入DAB显色5 min；加入苏木素染色30 s，冲洗后，显微镜下观察拍照。2结果2.1 p53 重组质粒的验证 实验室保存的重组质粒pET-27b（+）-p53 转化 E.coli DH5 后，挑取阳性克隆子进行扩培，提取质粒进行 PCR 扩增，电泳结果如图 1（A）所示，在 1200 bp 处出现特异性条带。重组质粒用 EcoR I 和 Not I 进行双酶切验证，结果如图（B）所示，扩增产物经电泳后出现两条带，在 5400 bp 处的大片段推测为线性 pET-27b（+）质粒，1200 bp 处的小片段推测为目的条带 p53。2.2 p53 蛋 白 的 诱 导 表 达 与 纯 化 将 pET-27b（+）-p53 重组质粒转化至大肠杆菌 Rosetta2TM（DE3）中进行诱导表达。经 SDS-PAGE 检测后如图 2（A）所示，与泳道 1 诱导前相比，加入图 1pET-27b(+)-p53 重组质粒 PCR 扩增（A）与双酶切验证（B）4 第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEIPTG 诱导 3 h 后有一条明显增加的条带（图中箭头所示），分子量大小约为 53 KDa，这与 p53 蛋白理论值一致。纯化后，如图 2（B）所示，在 53 KDa处有单一明显条带，说明p53蛋白已得到纯化。2.3 抗 p53 单链抗体库的构建 经过 3 次免疫后，小鼠眼珠取血，ELISA 法测定血清效价在 106 以上。提取小鼠脾脏总 RNA，逆转录为 cDNA。以cDNA 为模板，设计重链和轻链可变区简并引物图 2重组蛋白 p53 诱导表达与纯化图 3抗体重链和轻链可变区扩增电泳图图 5核糖体展示技术筛选抗 p53 单链抗体基因图 4ScFv 基因 PCR 扩增电泳图图 6pET-32a(+)-scFv 重组质粒 PCR扩增（A）与双酶切验证（B）图 7重组蛋白 scFv 诱导表达与纯化进行 PCR 扩增。扩增产物电泳后如图 3 所示，轻链可变区 VL-linker 片段大小约 370 bp，重链可变区 VH-linker 片段大小约 400 bp。等浓度的 VH-linker 和 VL-linker 进行重叠延伸 PCR 拼接反应，扩增完整的 ScFv 片段。如图 4 所示，扩增产物在7501000 bp 之间有一明显的条带，对目的片段进行胶回收纯化。2.4 核糖体展示筛选抗体基因 以 p53 蛋白为筛选抗原，通过核糖体展示技术对构建的 ScFv 库进行体外转录、翻译和筛选，每轮回收的 mRNA 作为模板进行下一轮扩增筛选。结果如图 5 所示，通过 5 轮筛选，泳道 1-5 中约 750 bp 处的目的条带逐渐变亮，而以泳道 6 和 7 以 PBS 和 BSA 作筛选抗原的对照组没有扩增到目的条带，表明针对 p53蛋白的目的基因得到了有效富集。2.5 抗 p53 单链抗体原核重组质粒的构建与表达 设计单链抗体基因的上、下游引物，分别在其 5端添加 EcoR I 和 Xho I 酶切位点和保护碱基，将有酶切位点的目的基因片段克隆至 pET-32a（+）载体。重组质粒分别用 PCR、双酶切的方法进行初步验证，结果如图 6 所示，经过琼脂糖凝胶电泳后，在约 750 bp 处出现单一条带，说明单链抗体基因可能已插入 pET-32a（+）载体中。酶切产物出现两个条带，大片段约为 5900 bp，推测为线性 pET-32a（+）质粒，小片段约 750bp，推测为目的条带。将 pET-32a（+）-scFv 重 组 质 粒 转 化 至Rosetta2TM（DE3）宿主菌中。氨苄青霉素抗性平板筛选转化子，挑取单菌落至 LB 液体培养基中诱导表达。如图7所示，经SDS-PAGE检测后，与泳道 1 的非诱导菌株相比，重组菌诱导后约在48 kDa 处出现比较明显的蛋白条带。bp5000300020001000750500250100bp5000300020001000750500250100bp5000300020001000750500250100KDa94624030KDa97.266.444.329.020.114.31 2 3 4 5 6 MM 1 2 M 1 2 M M 3ABbp5000300020001000750500250100ABMM12bp50003000200010007505002501005第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGE图 8B、CELISA 法检测核筛选基因表达的单链抗体活性图 8AELISA 法检测原始基因表达的单链抗体活性2.6 ELISA 法筛选抗 p53 单链抗体 间接 ELISA 法检测筛选基因和原始基因表达的抗体蛋白活性。结果如图 8（A）所示，原始文库基因表达的蛋白测出的 OD450 较低，说明表达所产生的抗体特异性较低，很难获得高亲和力的菌株。图 8（B、C）所示，经过 5 轮核糖体展示筛选后的基因，大约有 25%的克隆子表达的产物 OD450 较高，显示与抗原 p53 有较好的特异性，其中 3 株抗体 p53-ScFv1、p53-ScFv2 和 p53-ScFv3 显 示 出 较 高 的ELISA 值。图 8A 和图 8B 中的 1、2 组分别代表空白对照组和阴性对照组，两组 OD450 值均低于0.2，三株单链抗体的 OD450 均高于空白组和阴性对照组（P0.05)，说明这三株单链抗体对抗原p53 具有一定的亲和力。2.7 细胞免疫学检测抗 p53 单链抗体 复苏培养HepG2 细胞，待细胞贴壁生长后，将其进行免疫细胞化学实验，检测 ScFv 与 p53 蛋白的结合能力。显微镜观察染色效果如图 9，（A）为 HepG2 细胞的核染结果，实验过程中设定阴性对照组（B）。如图（C）、（D）、（E）所示，三株单链抗体能与细胞中 p53 抗原相结合。图 9细胞免疫学法检测抗 p53 单链抗体3讨论p53 蛋白的免疫组化是病理科常用的诊断手段，通过检测获取的癌症组织中 p53 蛋白的表达情况，对早期的肿瘤诊断、预后以及制定治疗方案都具有十分重要的意义。p53 蛋白的检测最主要的是获得单克隆抗体进行免疫组化相关实验，但单克隆抗体制备复杂、成本较高，使其应用受到限制17。随着基因重组技术的发展，单链抗体成为近年来抗体研究的热点。通过将抗体的重链可变区和轻链可变区进行拼接，使其有分子量小、制备简单且穿透力强等优势18。单链抗体的制备主要通过传统杂交瘤技术或展示技术来获得19。其中，核糖体展示技术作为一种体外展示技术，跟体内展示技术相比，其更易于构建大容量抗体库。抗体库的构建只需通过PCR扩增，筛选在体外进行，不受细胞的限制，避免了细胞融合等传统抗体制备的复杂操作。该技术将基因型和表型偶联在一起，利用相应的抗原即可筛出目标蛋白并获得相应的基因型，可以针对大容量基因库进行高效筛选20。因此，本研究选择免疫小鼠的脾脏细胞作为材料，建立核糖体展示文库。通过 TNT T7 Quick for PCR DNA 系统对文库进行转录和翻译，生成“mRNA-核糖体-单链抗体”复合体。在下一步的亲和筛选过程中，包被抗原 p53 蛋白，利用抗原抗体的特异性，5 轮筛选后回收目的基因。将筛选获得的抗 p53 单链抗体基因和原始抗体基因进行原核表达，采用间接 ELISA 检测抗体特异性。结果表明，经过核糖体展示筛选后的单链（下转第 13 页）13第35卷 第1期2023年VOL.35NO.12023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 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抗原相结合。综上所述，利用核糖体展示技术可获得抗人p53 单链抗体，且具有良好的亲和力和组织穿透力。相比传统抗体制备，有费用低廉，操作简便等优势，可用于免疫组化等研究，该技术为免疫检测抗体的筛选制备提供了新的思路和途径。参考文献：1 尚文涛,王敏娜.p53 基因在癌症发展过程中作用的研究 J.世界最新医学信息文摘,2018,18(20):34-35.2 王嘉健,欧霞,耿学业,等.靶向突变 p53 聚集体的肿瘤治疗研究进展 J.生物化学与生物物理进展,2021,48(10):1121-1129.3 谢林峰,向俊蓓,姜欣.突变 p53 在肿瘤发生过程中的功能研究与进展 J.中国医学创新,2020,17(24):169-172.4 Levine AJ.Targeting the p53 Protein for cancer therapies:the translational impact of p53 researchJ.Cancer Research,2022,82(3)：362-364.5 邓龙,周思,郭新东.基于基因突变的基因工程抗体亲和力成熟研究 J.生物技术进展,2014,4(6):400-404.6 王沁芸,潘晔,陈克平，等.基因工程抗体及其在识别小分子中的应用 J.生物学杂志,2021,38(2):95-99.7 赵小玲，陈伟强，李静梅，等.应用核糖体展示技术筛选制备抗 TNF-人源抗体的研究 J细胞与分子免疫学杂志,2009,25(2)：145-1498 严浩，王芳，毛伟平，等抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建J安徽农业科学，2013,41(33):12819-128229 Shabaui S，Moghadam MF，Gargari SLM，et al.Isolation and characterization of a novel GRP78-specific single-chain variable fragment（scFv）using ribosome display methodJ.Medical Oncology，2021,38（9）：115.10 Yuan Q,Xia Y,Nian S,et al.Selection of single chain fragments against the phytopathogen 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