温阳活血利水方对被动型He...ann肾炎大鼠足细胞的影响_薛雪.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 603 温阳活血利水方对被动型Heymann肾炎大鼠 足细胞的影响薛雪1,2，吴健3，付彤飞3，谭瑶3，袁军1,2（1湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430061；2湖北省中医院肾病科，武汉 430061；3湖北中医药大学中医临床学院，武汉 430061）摘要：目的：观察温阳活血利水方药对被动型Heymann肾炎（PHN）模型大鼠的干预作用，并探讨该方药的疗效机制。方法：雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、PHN模型组、温阳活血利水组、他克莫司组，每组15只。以尾静脉注射Anti-Fx1A血清法构建IMN模型。检测各组大鼠24 h尿蛋白定量、血清总蛋白、血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐、胆固醇及甘油三酯水平。采用免疫荧光法检测肾小球Klotho、瞬时受体电位通道6（TRPC6）、组织蛋白酶L（CatL）及其底物Synaptopodin表达；采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肾皮质Ras同源基因家族成员（Rho）A、Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）1与ROCK2的活性；采用Western blot方法检测肾皮质磷酸化LIM结构域激酶p-LIMK1、磷酸化后p-cofilin蛋白的表达。光镜下观察肾脏病理形态学变化，电子显微镜下观察肾小球足细胞足突及电子致密物变化情况。结果：与正常对照组比较，干预4周后PHN模型组24 h尿蛋白定量、血清胆固醇与甘油三酯水平显著升高（P0.01），血清白蛋白水平显著下降（P0.01）；肾小球Klotho及Synaptopodin的表达显著下调（P0.01），RhoA、ROCK1、ROCK2活性显著升高（P0.01），TRPC6、CatL、p-LIMK1/LIMK1及p-cofilin/cofilin表达显著上调（P0.01）；足细胞足突弥漫性融合，足细胞下电子致密物沉积。与PHN模型组比较，干预4周后温阳活血利水组血清白蛋白显著升高（P0.05），24 h尿蛋白定量与血清甘油三酯水平显著下降（P0.05，P0.01）；肾小球Klotho及Synaptopodin表达显著上调（P0.01），RhoA、ROCK1、ROCK2活性显著下降（P0.01），TRPC6、CatL、p-LIMK1/LIMK1与p-cofilin/cofilin表达显著下调（P0.01）；足突融合改善，足细胞下电子致密物沉积减轻。结论：Klotho/TRPC6/CatL/Synaptopodin/RhoA/ROCK/LIMK/cofilin信号通路表达异常可能参与了IMN的发病过程；温阳活血利水方药能够减少IMN大鼠蛋白尿，调整足细胞形态，其作用机制或与 调控该通路有关。关键词：温阳活血利水方；特发性膜性肾病；机制；足细胞基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.82074364），武汉市2022年度知识创新专项基础研究项目（No.2022020801020506）Effects of Wenyang Huoxue Lishui recipe on podocytes in rats with passive Heymann nephritis XUE Xue1,2,WU Jian3,FU Tong-fei3,TAN Yao3,YUAN Jun1,2(1First Clinical College,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430061,China;2Department of Nephrology,Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China;3Clinical College of Traditional Chinese Medicine,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)Abstract:Objective:To observe the interventional effect of Wenyang Huoxue Lishui recipe(WHLR)on passive heymann nephritis(PHN)model and to explore the therapeutic mechanism.Methods:Sixty male SD rats were randomly divided into normal control group,PHN model group,WHLR group,tacrolimus group,15 rats in each group.PHN rats were modeled 论著通信作者：袁军，湖北省武汉市武昌区花园山4号湖北省中医院肾病科，邮编：430061，电话：[phone]E-mail：内文1.indd 6032023/2/10 16:57:23中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 604 by injecting anti-Fx1A serum.The levels of 24 h urine total protein and serum total protein,albumin,alanine aminotransferase,aspartate aminotransferase,creatinine,cholesterol,triglyceride were detected in each group of rats.Immunofluorescence methods were used to detect the expression of glomerular Klotho,transient receptor potential channel 6(TRPC6),cathepsin L(CatL)and its substrate synaptopodin in each group of podocytes.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was adopted to measure the activities of Ras homologgene family member(Rho)A and Rho-activated kinase(ROCK)1 and ROCK2 of the renal cortex.And Western blot method was used to detect the expression of phosphorylated-LIMK1(p-LIMK1),p-cofilin protein of the renal cortex.The pathological changes of rat kidney tissue were observed under ordinary light microscope,and the changes of glomerular podocyte foot processes and electron dense deposits were observed under electron microscope.Results:Corresponding drugs were given by gavage for 4 weeks,compared with normal control group,the level of 24 h urine total protein,serum cholesterol and triglycerides significantly increased(P0.01)as well as the level of serum albumin decreased(P0.01);expression of glomerular Klotho and Synaptopodin were down-regulated(P0.01)as well as expression of TRPC6,CatL,RhoA,ROCK1,ROCK2,p-LIMK1/LIMK1 and p-cofilin/cofilin were up-regulated in the PHN model group(P0.01).The effacement of the podocyte foot processes was diffuse,and electron dense deposits were deposited under the podocytes.Corresponding drugs were given by gavage for 4 weeks,compared with the PHN model group,the level of serum albumin significantly increased(P0.05)as well as the level of 24 h urine total protein,serum triglycerides decreased(P0.05,P0.01)in WHLR group;expression of glomerular Klotho and Synaptopodin were up-regulated(P0.01)as well as expression of TRPC6,CatL,RhoA,ROCK1,ROCK2,p-LIMK1/LIMK1 and p-cofilin/cofilin significantly were down-regulated in WHLR group(P10 mg为造模成功9。实验结束后随机选取造模大鼠和正常对照组大鼠各2只，予以包埋、固定，光镜下能够观察到免疫复合物在造模大鼠肾小球毛细血管袢上皮下沉积，电镜下可见电子致密物沉积于毛细血管袢上皮下，毛细血管不均匀增厚呈钉突样改变，基底膜增厚，足突融合，表示造模成功。4.干预与取材 正常对照组与PHN模型组给予蒸馏水6 mLkg-1d-1灌胃，温阳活血利水组给予 12 g/d中药制剂灌胃，他克莫司组给予1 mgkg-1d-1他克莫司混悬液灌胃。连续干预4周，每周检测24 h尿蛋白定量。干预结束后，1.5%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离出血清；剖腹取肾脏分离肾皮质，保存于液氮罐中。分离左肾切块后，分别送冰冻切片、石蜡切片与电镜检查。5.观察指标及检测方法5.1 一般情况 每周观测大鼠的体质量、尿量、饮水、摄食、毛发光泽及反应状态等。5.2 血生化指标检测 全自动生化分析仪检测各组大鼠血肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血清总蛋白及白蛋白水平、血清谷草转氨酶及谷丙转氨酶水平；贝克曼Au5821全自动生化分析仪检测第0、1、2、3、4周各组大鼠24 h尿蛋白定量。5.3 Western blot检测肾皮质中磷酸化LIM结构域激酶1（phosphorylated-LIM domain kinase 1，p-LIMK1）、LIMK1、p-cofilin及cofilin蛋白 表达 蛋白含量按BCA蛋白浓度测定试剂盒测定。取总蛋白10 g经SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至0.45 m PVDF膜上。含5%脱脂牛奶的TBST 4 封闭2 h，洗膜后加入一抗（p-LIMK1：1 750；LIMK1：11 000；p-cofilin：11 000；cofilin：1900；-actin：150 000）孵育过夜。再用1 3 000的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG进行二抗杂交，最后加入ECL试剂显色并曝光成像。将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。5.4 检测肾皮质RhoA、ROCK1、ROCK2活性 切割 大鼠肾皮质，加入磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）将标本匀浆充分。离心20 min左右（3 000 r/min，离心半径10 cm），收集上清液，检测严格按照产品说明书进行。5.5 检测肾小球Klotho、CatL、瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel 6，TRPC6）及Synaptopodin表达 肾组织冰冻切片浸于-20 丙酮固定10 min。石蜡切片常规脱蜡水化，然后置于 0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液中高压锅15 min进行抗原修复。3%胎牛血清封闭后，滴加一抗（Klotho 1 100；CatL 1 100；TRPC6 1 150；Synaptopodin 150）孵育4 过夜，二抗室温孵育30 min，抗荧光淬灭封片剂封固后送检。荧光显微镜观察荧光并拍照，采用NIS-Elements AR Analysis 5.21.00软件分析荧光 强度。5.6 肾脏病理学检查 过碘酸雪夫氏染色（schiff periodic acid shiff，PAS）及Masson染色观察肾脏病理形态学变化；电子显微镜检测观察肾小球足细胞足突及电子致密物情况。6.统计学方法 用SPSS 23.0统计软件包进行数据处理。符合正态分布的计量资料以x-s表示，内文1.indd 6052023/2/10 16:57:24中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 606 表2 各组大鼠血生化检测结果比较（x-s）组别n血清总蛋白（g/L）血清白蛋白（g/L）血肌酐（mol/L）胆固醇（mmol/L）甘油三脂（mmol/L）谷草转氨酶（U/L）谷丙转氨酶（U/L）正常对照组1556.073.6725.861.9725.208.471.660.220.890.32192.5086.1671.3013.68PHN模型组1454.413.3321.201.79*21.782.864.421.316*2.721.05*135.7856.3460.8912.86温阳活血利水组1457.121.4823.771.36*25.781.563.421.16*0.710.28188.4483.2756.4410.03他克莫司组1356.265.8223.442.97*23.503.893.140.85*1.440.52*146.8826.5766.3817.71数据符合方差齐性的多组间比较采用方差分析；组间两两比较采用最小显著性差异法分析。不符合方差齐性的多组间比较采用非参数检验；两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。P0.05表示差异有统计学 意义。结果1.一般情况 造模后第1周PHN模型组、他克莫司组各死亡1只，造模后第3周他克莫司组再死亡1只，温阳活血利水组死亡1只。与正常对照组比较，PHN模型组毛发光泽减弱，精神萎靡，反应状态差。与PHN模型组比较，各治疗组大鼠毛发光泽度、精神以及反应状态稍好转。2.各组大鼠24 h尿蛋白定量比较 见表1。与正常对照组同期比较，PHN模型组第2周、3周、4周24 h尿蛋白定量显著升高（P0.01）。与PHN模型组同期比较，温阳活血利水组在2、3、4周时24 h尿蛋白定量均显著下降（P0.05，P0.01）；他克莫司组在第4周时24 h尿蛋白定量显著降低（P0.05）。3.各组大鼠血生化指标的比较 见表2。与正常对照组比较，PHN模型组血清白蛋白水平显著下降（P0.01），血清胆固醇及甘油三酯水平均显著升高（P0.01）。与PHN模型组比较，温阳活血利水组与他克莫司组血清白蛋白均显著升高（P0.05），甘油三酯均显著降低（P0.01，P0.05）；温阳活血利水组血肌酐较PHN模型组显著升高（P0.05）。4.免疫荧光检测各组大鼠肾小球Klotho、TRPC6、CatL及Synaptopodin表达情况 见图1-图2。与正常对照组比较，其余组大鼠肾小球Klotho、Synaptopodin表达水平显著下降（P0.01），肾脏表1 各组大鼠干预前后周24 h尿蛋白定量比较（x-s，mg/24 h）组别n第0周第1周第2周第3周第4周正常对照组154.841.826.192.289.512.058.864.876.292.40PHN模型组142.282.4517.307.0675.1050.60*72.1251.25*55.3628.44*温阳活血利水组142.912.3613.8214.5827.1911.41*26.7114.80*28.8511.04*他克莫司组134.121.5925.4025.28*37.8625.34*36.7319.39*23.7317.90*注：与正常对照组同期比较，*P0.05，*P0.01；与PHN模型组同期比较，P0.05，P0.01。下表同。图2 各组大鼠肾脏Klotho、TRPC6、CatL、Synaptopodin 平均荧光强度表达比较（x-s）注：与正常对照组比较，*P0.01；与PHN模型组比较，P0.01。下图同。正常对照组（n=15），PHN模型组（n=14），温阳活血利水组（n=14），他克莫司组（n=13）；图3同。*Klotho平均荧光强度CatL平均荧光强度Synaptopodin平均荧光强度TRPC6平均荧光强度图1 各组大鼠肾脏Klotho、TRPC6、CatL、Synaptopodin表达情况（免疫荧光400）KlothoTRPC6CatLSynaptopodin正常对照组温阳活血利水组PHN模型组他克莫司组内文1.indd 6062023/2/10 16:57:25中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 607 TRPC6、CatL表达水平均显著上升（P0.01）。与PHN模型组比较，温阳活血利水组与他克莫司组Klotho、Synaptopodin表达水平均显著升高（P0.01），TRPC6、CatL表达水平均显著降低（P0.01）。5.各组大鼠肾皮质RhoA、ROCK1与ROCK2活性比较 见图3。与正常对照组比较，其余组大鼠肾脏RhoA、ROCK1、ROCK2活性均显著升高（P0.01）。与PHN模型组比较，温阳活血利水组与他克莫司组大鼠肾脏RhoA、ROCK1、ROCK2活性均显著下降（P0.01）。图3 各组大鼠肾皮质RhoA、ROCK1、ROCK2 活性比较（x-s）*RhoA（IU/L）ROCK1（IU/L）ROCK2（IU/L）6.各组大鼠肾皮质p-LIMK1/LIMK1与p-cofilin/cofilin的表达比较 见图4。与正常对照组比较，其余组大鼠肾脏p-LIMK1/LIMK1与p-cofilin/cofilin表达显著升高（P0.01）。与PHN模型组比较，温阳活血利水组与他克莫司组大鼠肾脏p-LIMK1/LIMK1与p-cofilin/cofilin表达显著下降（P0.01）。图4 各组大鼠肾皮质p-LIMK1/LIMK1与p-cofilin/cofilin 表达比较注：A.蛋白条带图；B.蛋白表达量（x-s，n=4）。Ap-LIMK1p-LIMK1/LIMK1p-cofilincofilinLIMK1正常对 照组正常对 照组PHN 模型组PHN 模型组温阳活血 利水组温阳活血 利水组他克莫 司组他克莫 司组-actin-actinB*p-cofilin/cofilin73 kDa18 kDa73 kDa19 kDa42 kDa42 kDa7.PHN模型组大鼠光镜下肾脏形态学变化情况 见图5。PAS染色显示肾小球毛细血管袢开放尚好，毛细血管襻僵硬，未见系膜增生；Masson染色图中箭头所示为嗜复红合物在上皮下免疫沉积；免疫荧光染色显示IgG与C3在肾小球内沉积。8.各组大鼠肾小球足细胞足突及电子致密物变化情况 见图6。与正常对照组大鼠足细胞比较，PHN模型组大鼠足细胞足突弥漫性融合，脏层上皮细胞（足细胞）下电子致密物沉积；而温阳活血利水组与他克莫司组足细胞足突融合改善，脏层上皮细胞（足细胞）下电子致密物沉积减轻。图6 各组大鼠肾脏电镜下肾小球足细胞足突及电子致密物 变化情况（8 000）正常对照组PHN模型组温阳活血利水组他克莫司组讨论IMN临证表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高度水肿。阳气蒸腾和气化调控全身水液代谢。阳气亏虚，气化不利则水湿内停；元阳不足，封藏失司，大量精微下注形成蛋白尿。水湿为阴邪，易伤阳气，进一步加重阳虚；水停气滞，气血运行不畅，血不利则为水，终致水湿瘀血互结。“脾肾阳虚、水湿瘀血互结”是IMN的关键病机。课题组临证观察IMN患者，脾肾阳虚兼瘀水互结证较常见，与多数研究10-11结果相似。结合本病的病因病机，课题组创立了“温阳活血利水”协定方剂，临床长期使用，反复优化，对难治性肾病综合征取得了较好疗效6。本研究采用尾静脉注射Anti-Fx1A血清法构建IMN模型。研究结果表明，“温阳活血利水”方药在降低IMN大鼠蛋白图5 PHN模型组大鼠肾脏光镜下肾脏形态学变化情况（400）注：箭头标注处荧光为相关蛋白表达。内文1.indd 6072023/2/10 16:57:27中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 608 尿、提高血清白蛋白、调节甘油三脂水平方面效果显著。肾脏病理结果显示“温阳活血利水”方药改善了足细胞足突融合，减轻了电子致密物沉积，与他克莫司组效果相当。Klotho水平下降和蛋白尿水平增加密切相关，尿中Klotho水平能够反映足细胞损伤状态，预测足细胞足突融合程度12。Klotho能够减轻ATP刺激足细胞后导致骨架重构，而这与抑制瞬时受体电位通道TRPC6有关12。在IMN肾病患者及动物模型肾组织中均可发现TRPC6表达升高，TRPC6在IMN大鼠高表达后actin骨架蛋白重排，足细胞损伤，引起蛋白尿9。而TRPC6高表达导致Ca2+过度内流，从而使与CatL水平升高13。CatL通过水解下游底物骨架调节蛋白Synaptopodin，导致足细胞骨架紊乱14。作为调节actin动力学的分子开关，RhoA的过度激活可以使足细胞足突消失14。TRPC6通过调控Ca2+过度内流导致的足细胞损伤与激活RhoA/ROCK通路有关14。此外，在神经元细胞骨架的研究中发现RhoA和ROCK均可激活下游效应物LIMK。LIMK能够通过磷酸化之后发挥对肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家系ADF/cofilin（actin depolymerizing factor/cofilin）的活性调节，导致cofilin磷酸化增加15。正常活性的cofilin对于维持足细胞结构以及恢复足细胞损伤后发生的肌动蛋白结构变化是必要的15，当cofilin活性下降，继而会导致F-actin解聚，细胞骨架紊乱。但目前仅在神经元细胞骨架的研究15中有报道，而在IMN足细胞中尚无相关报道。本研究中PHN模型组Klotho表达显著下降，TRPC6与CatL表达明显升高，CatL底物骨架调节蛋白Synaptopodin表达降低，RhoA、ROCK1、ROCK2被过度激活，下游p-LIMK1/LIMK1及p-cofilin/cofilin表达均升高，骨架蛋白F-actin解聚，细胞骨架紊乱，足突融合甚至消失，蛋白尿发生。研究结果提示由Klotho介导的TRPC6/CatL/Synaptopodin/RhoA/ROCK/LIMK/cofilin通路可能参与了IMN的发病过程，由此更加丰富了IMN足细胞骨架损伤机制学说。此外，“温阳活血利水”方药干预IMN大鼠后逆转了上述变化。说明“温阳活血利水”方药治疗IMN的疗效或与上调Klotho与Synaptopodin表达，下调TRPC6与CatL表达，下调RhoA、ROCK1、ROCK2过激活性及下游相关蛋白的表达水平相关。综上，通过观察IMN大鼠（PHN模型）中Klotho/TRPC6/CatL/Synaptopodin/RhoA/ROCK/LIMK/cofilin通路及足细胞形态的变化，阐明Klotho介导的该通路在IMN发病机制中的重要作用。“温阳活血利水”方药干预IMN大鼠后能减少蛋白尿，调整足细胞形态，其临床疗效的作用机制或与调控该通路密切相关，为温阳活血利水法的临床应用提供了依据。参 考 文 献1 付平,李鑫睿.特发性膜性肾病诊疗进展.中国中西医结合肾病杂志,2020,21(7):565-567 2 Alsharhan L,Beck LH Jr.Membranous Nephropathy:Core curriculum.Am J Kidney Dis,2021,77(3):440-4533 刘娇娇,袁军.温阳活血利水法治疗肾病综合征的Meta分析.世界最新医学信息文摘,2018,18(72):4-104 柳强,薛雪,程虹,等.温阳活血利水法治疗特发性膜性肾病.中医学报,2019,34(10):2231-22355 邱雯雯,袁军,杨柳.温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L表达的影响.中国中西医结合杂志,2016,36(5):602-6076 陈凤,王相相,邱雯雯,等.温阳活血利水方含药血清对足细胞组织蛋白酶L、发动蛋白以及微丝、微管的影响.中医杂志,2018,59(10):882-8867 Yuan J,Wang X X,Xiao L,et al.Wenyang Huoxue Lishui formula ameliorates doxorubicin-induced nephrotic syndrome in a rat model by reducing cathepsin L expression.Biomed Res(Aligarh),2017,28(9):3927-39338 Yuan J,Xue X,Qiu W W,et al.Impact of Wenyang-Huoxue-Lishui formula on cytoskeletal structures and related proteins of immortalized podocytes in mice with puromycin aminonucleoside(PAN)-induced injury.Int J Clin Exp Med,2019,12(2):1479-14919 Wang X,Liu J,Tian R,et al.Sanqi Oral Solution mitigates proteinuria in rat passive Heymann nephritis and blocks podocyte apoptosis via Nrf2/HO-1 pathway.Front Pharmacol,2021(12):72787410 艾斯,郑健,林青,等.益肾活血法干预阿霉素肾病大鼠蛋白质组学的实验研究.中华中医药杂志,2011,26(5):1091-109711 鲁欢,张礼财,宋超,等.温阳利水方对阳离子化牛血清白蛋白致膜性肾病大鼠足细胞的保护作用.广州中医药大学学报,2021,38(1):116-122 12 Cho N J,Han D 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