微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇_雷梵章.pdf

法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇雷梵章1，陈曼1，梅书燕1，方雅婷1，2，朱波峰11.南方医科大学法医学院 广州市法医多组学精准鉴识重点实验室，广东 广州 510515；2.安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230031摘要：微生物群落演替与样本种族、性别、健康状况、生活方式、死亡时间等重要因素密切相关，具有较大的法医学潜在应用价值。本文总结了近年来微生物组学应用于法医学同一认定、地域特征鉴识、组织或体液来源鉴定以及死亡时间推断等方面的研究，并介绍了基于二代测序数据用于微生物学研究的主要机器学习算法。此外，还分析了当下法医微生物组学面临的检材提取与保存、标准化和数据库建设、伦理审查和实践适用性等问题。未来借助微生物多组学技术将有望以全面动态的角度探索微生态系统，从而推动法医微生物组学的应用发展。关键词：法医学；微生物组学；同一认定；地域特征鉴识；组织或体液来源鉴定；死亡时间推断；死因分析；综述中图分类号：DF795.2 文献标志码：A doi：10.12116/j.issn.1004-5619.2022.520303文章编号：1004-5619（2022）05-0625-15New Advances，Challenges and Opportunities in Forensic Applications of MicrobiomicsLEI Fan-zhang1,CHEN Man1,MEI Shu-yan1,FANG Ya-ting1,2,ZHU Bo-feng11.School of Forensic Medicine，Southern Medical University，Guangzhou Key Laboratory of Forensic Multi-Omics for Precision Identification，Guangzhou 510515，China；2.School of Basic Medical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230031，ChinaAbstract：The succession of microbiota is closely associated with several essential factors,including race,sex,health condition,lifestyle,postmortem interval,etc.,and it has great potential application value in forensic medicine.This paper summarizes recent studies on the forensic applications of the microbiome,including individual identification,geographical feature identification,origin identification of the tissue or body fluid,and postmortem interval estimation,and introduces the current machine learning algorithms for microbiology research based on next-generation sequencing data.In addition,the current problems facing forensic microbiomics such as the extraction and preservation of samples,construction of standardization and database,ethical review and practical applicability are discussed.Future multi-omics studies are expected to explore micro ecosystems from a comprehensive and dynamic perspective,to promote the development of forensic microbiomics application.Keywords：forensic medicine;microbiomics;individual identification;geographical feature identification;origin identification of tissues and body fluids;postmortem interval estimation;analysis of death cause;review作为地球上最为丰富多样的生物资源之一，从土壤、水体到火山和冰川，从植物根际到人类体内腔道，微生物无处不在。微生物群落（microbiota）是原核生物与真核生物界中不同微生物的集合，其活动行为影 综述 基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（81930055）作者简介：雷梵章（1997），男，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：通信作者：朱波峰，男，教授，博士，主要从事法医学教学及法医物证学研究；E-mail：引用格式：雷梵章，陈曼，梅书燕，等.微生物组学的法医学应用新进展、挑战和机遇J.法医学杂志，2022，38（5）：625-639.To cite：LEI F Z，CHEN M，MEI S Y，et al.New advances，challenges and opportunities in forensic applications of microbiomicsJ.Fayixue Zazhi，2022，38（5）：625-639.625Journal of Forensic Medicine,October 2022,Vol.38,No.5响着微生物结构、代谢物、可移动遗传元件以及栖息地环境中的游离DNA1，同时通过微生物-环境-宿主之间独特的相互作用组成了动态多样的微生态环境。自2007年人类微生物组计划（The Human Microbiome Project，HMP）启动以来，各个国家和国际组织也相继响应，如地球微生物组计划（Earth Microbiome Project，EMP）、美国国家微生物组计划（National Microbiome Initiative，NMI）以及我国的中国科学院人类微生物组计划等。同时，DNA 测序技术和数据分析技术的快速发展提高了研究人员对不同环境中复杂微生物群落组成结构及其动态变化的认识2，这使得微生物组（microbiome）这一概念在被提出后逐渐成为生命科学领域的研究热点3。尽管微生物组通常被定义为“微生物群的基因和基因组，以及微生物群与宿主环境的产物”4，然而这一定义并不能概括当前所有领域中的微生物组研究。根据 2020年 MicrobiomeSupport研讨会的意见1，微生物组的定义被重新修订为“具有独特理化性质和合理明确栖息地的特征性微生物群落”，同时微生物组的含义还包括了这些微生物的活动影响范围及生态位。由此可见，微生物组及周围环境所组成的动态微生态系统是微生物组学的主要研究对象，而微生态系统中的微生物群落演替模式则可在一定程度上反映环境-宿主影响因素的变化。这些反映人类微生物群落演替规律的相关影响因素可为明确犯罪嫌疑人和被调查对象的种族、性别、年龄、健康状况、地理位置、饮食习惯、生活习惯、职业情况等信息提供重要依据，而环境微生物组的群落结构可用于对样本所处的地理环境情况进行推断。基于上述特点，微生物组学可应用于法医学同一认定、地域特征鉴识、组织或体液来源鉴定、死因分析、死亡时间（postmortem interval，PMI）推断、死后淹没时间（postmortem submersion interval，PMSI）推断等研究中。本文通过介绍微生物组学分析技术、法医学领域相关的微生物组学及其法医学应用等方面，系统阐述了微生物组学在法医学领域的应用研究进展，并对其在法医学实践中所面临的问题和前景进行总结。1微生物组学主流分析技术1.1 标记基因分析标记基因分析是一种对特定基因区域周围的保守区设计引物以获得标记基因的扩增子，从而进行微生物组分析的方法5。常用的标记基因包括细菌和古细菌的 16S rRNA基因以及真菌的 18S rRNA基因和内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）。在对上述标记基因进行扩增后，一般按照 97%的序列相似性的阈值对扩增子进行聚类并分组，得到细菌的分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）6，最后根据数据库已知信息将每个 OTU所代表的序列进行分类学注释。这种方法通过 97%的相似性将多个序列模糊成抽象一致的单个序列，虽然在分子生物学技术的早期发展阶段可以一定程度上减少 PCR和测序错误的影响，但其分类学注释水平也随之降低。近年来随着测序技术的发展，有学者认为上述阈值存在一定的局限性，以 16S rDNA 全长和 V4 高变区为例，理论上最优的 OTU 聚类阈值应分别为 99%和100%7。此外，目前新兴的扩增子序列变异（amplicon sequence variant，ASV）分析则从根本上提高了物种分类注释水平8。该方法首先对目标区域的基因进行精准测序，再使用如 DADA2等概率模型对测序及扩增错误所产生的序列进行过滤9，随后将位于相同基因区域的 ASV作为最小分类单元直接与参考数据库进行比较，从而实现种水平以上的物种分类。然而，应用 ASV 或使用较高的聚类阈值可能会将单个原先的代表性微生物类群也分成多个类群8，从而降低研究结果的可解释性。因此，在法医学实践中应结合研究目的和实际情况选择分类方法，以获得更具研究意义的微生物类群结果。标记基因分析法的优点：（1）效率高、成本低；（2）适用于低生物量或宿主 DNA 污染程度较高的样品5；（3）文库构建简便，已有大量公共数据集可供参考；（4）与基因组含量的相关性较高，易于定量10。然而，该方法的缺点：（1）分辨率较低，限制在属水平，可获得的功能信息有限11；（2）不能区分 DNA是否来源于活体；（3）无法同时研究细菌、真菌以及病毒等物种12；（4）引物和可变区的选择对结果影响较大，同时易受到PCR扩增偏倚的影响13。1.2 宏基因组分析由于传统研究无法对多种微生物进行大规模培养以及测序，因此 HANDELSMAN 等14在对土壤微生物进行研究时首次提出了将环境中全部微生物遗传物质作为研究对象的概念宏基因组学。与标记基因分析相比，宏基因组分析可对样品中存在的所有DNA进行测序分析，包括真核生物DNA和病毒等。宏基因组分析法的优点：（1）分辨率高，可对微生物群落进行种、株水平的分类15；（2）可直接获得功能基因的相对丰度；（3）较少受到扩增偏倚的影响。缺点5：（1）成本较高，样本处理方法复杂；（2）对测序通量有一定要求，数据分析难度大；（3）无法区分 DNA是否来源于活体，无法获得表达信息；（4）易受宿主DNA及其细胞器的污染；（5）组装中产生的错误会降 626法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期低群体平均微生物基因组的准确率。1.3 宏转录组分析上述两种方法仅对 DNA 序列进行分析，而对DNA来源生物体的存活与否并未加以区分，因此，在探究微生物功能时具有一定的局限性。宏转录组以活体中才能稳定表达的 RNA 为研究对象，可通过转录组数据直接获取微生物群落的基因表达和转录活性等信息。宏转录组分析的优点：（1）当与标记基因分析结合使用时，可以对群落中的微生物转录情况进行推断；（2）可对活动生物进行分析并直接评估其转录情况16；（3）可捕捉细胞内部的动态变化17。缺点：（1）费用最高，样本处理和建库难度高，数据分析复杂18；（2）必须排除宿主mRNA和rRNA的污染13；（3）RNA不稳定，样本的收集和存储难度高；（4）转录活性高的生物体可造成数据结果的偏倚。由于成本和技术限制，目前微生物宏转录组分析较少应用于法医学研究。1.4 法医学应用领域中微生物组学分析技术的对比为了研究微生物组学分析技术在法医学中的应用进展，笔者在 PubMed 文献数据库（https：/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）中以（forensicTitle/Abstract）AND（microbiomeTitle/Abstract）OR（microbiotaTitle/Abstract）OR（microbialTitle/Abstract）NOT（CorrigendumTitle/Abstract）NOT（Review）检索 2020年以来的法医微生物组相关文献。随后对检索到的89条结果根据其与法医微生物组学的相关性进行筛选，最终得到39篇法医微生物组学文献。筛选标准：（1）被科学引文索引收录；（2）研究对象为微生物组本身；（3）研究内容不以实验方法改进为主；（4）研究结果具有较高的法医学意义。在上述39篇文献中摘选出在主要法医微生物组学应用领域中具有不同分析技术的代表性研究（表 1）。此外，根据不同分析和测序方法及其应用领域、物种分类方法、主要机器学习模型等维度，使用 Matplotlib v3.5.119对上述 39 篇法医微生物组学文献进行统计，并绘制了复合环形图（图1）。其中标记基因分析（74.35%）和 OTU（46.15%）分别是最常见的分析方法和物种分类方法，而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass-spectrometer，MALDI-TOF-MS）技术在分析如微生物群落的代谢产物等微生态生化环境时则较为常用。值得一提的是，近两年法医微生物组学研究中所使用的机器学习模型种类较多，其中以随机森林模型（25.64%）最常见，而人工神经网络模型（5.13%）的相关研究亦时有出现。表1 法医微生物组学主要研究应用领域中的分析技术Tab.1Analytical techniques in major application fields of forensic microbiomics研究应用领域同一认定组织或体液来源鉴定地域特征鉴识PMI推断PMSI推断死亡原因和（或）死亡方式推测分析或测序方法16S rDNA V4区测序hidSkinPlex靶向测序16S rDNA V3V4/V1V9区测序16S rDNA V1V5区宏基因组鸟枪法16S rDNA V3V4区测序宏基因组鸟枪法16S rDNA V3V4区测序16S rDNA V4区和18S rDNA测序飞行时间质谱（MALDI-TOF）16S rDNA V4区测序16S rDNA V4区和 ITS rDNA测序16S rDNA V3V4区测序16S rDNA V4区测序物种分类方法ASV-OTUASVOTUOTUOTUOTUASVOTUOTUASVOTUASV机器学习模型1）随机森林支持向量机/LASSO算法线性判别分析人工神经网络-随机森林支持向量机人工神经网络随机森林-随机森林随机森林-logistic回归参考文献2021-22232425262728293031323334注：1）指该研究中重点强调或预测效能最高的机器学习模型。PMI表示死亡时间（postmortem interval）；PMSI表示死后淹没时间（postmortem submersion interval）；OTU表示分类操作单元（operational taxonomic unit）；ASV表示扩增子序列变异（amplicon sequence variant）。“-”表示未使用机器学习模型。627Journal of Forensic Medicine,October 2022,Vol.38,No.52微生物组学的法医学应用新进展2.1 人类微生物组人类微生物组结构具有高度的个体特异性，早期研究35结果表明，同卵双生子之间肠道微生物组结构的相似性与异卵双生子接近，说明微生物群落受到环境因素的影响可能比宿主遗传因素更大。DAVID等36对受试者的口腔、皮肤和粪便样本进行长期采样，结果发现，不但个体间微生物组结构不同，而且同一个体的微生物组在不同部位及时间段中也存在差异，但其群落特征仍具有一定的时间稳定性。值得一提的是，昼夜变化也可能是影响微生物组的因素之一。WILKINS等37发现昼夜不同时段所采集的同一受试者皮肤、家庭物品以及公共设施表面样本之间有160个微生物类群存在显著丰度差异，认为这种昼夜差异可能与人类晓行夜宿的生活习性有关，并通过构建动态贝叶斯网络（dynamic Bayesian networks，DBN）初步验证了上述假设，但仍无法排除如洗澡和生理状况等因素的影响。微生物群落的差异也体现在同一个体之中。不同器官或身体部位中所定植的微生物之间其种类和特征具有显著差异，从而形成了各自的“核心微生物群”（core microbiota），如口腔中的乳杆菌属（lactobacillus）、嗜血杆菌属（haemophilus）等，皮肤上的丙酸杆菌属（propionibacterium）、棒杆菌属（corynebacterium）、微 球 菌 属（micrococcus）等，肠 道 中 的 梭 菌 属（clostridium）、拟杆菌门（bacteroidetes）等。同一个器官或腔道内的微生物群落之间亦存在差异，如不同部位的皮肤微生物在组成和结构上有显著差异，这可能是不同部位皮肤的形态特征差异所导致的38。人类与环境的相互作用是影响微生物群落结构发生变化的重要因素38，这些环境因素或作为免疫刺激物，通过炎症反应等方式影响微生物群，或带来了定植在个体中的微生物。此外，影响群落演替的因素还包括性别、年龄、种族、饮食、地域、疾病、体型、生活方式等，这些特点使得微生物组分析可应用于法医学同一认定、组织或体液来源鉴定、地域特征推断及 PMI推断等，为案件侦查提供指向性线索。2.1.1 同一认定研究微生物组成具有一定的个体特异性，可应用于法医学同一个体认定。早期相关研究39主要描述人体口腔和唾液微生物群落特征和时空稳定性，为微生物组学的未来发展带来深远影响。2016年，OH 等40利图1 近3年来法医微生物组学在不同应用领域研究中所使用的分析方法复合环形图Fig.1 Composite ring chart of analytical methods used in forensic microbiomics studies for different applications in the last 3 years 628法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期用鸟枪法测序进一步对种、亚种分类阶元水平的人类皮肤微生物组进行分析，该研究随后公开了近3年间采集的 594 份皮肤样本中所测得共 720 kGbp 的测序数据，为后续的皮肤微生物组学研究提供了重要的数据资源。SCHMEDES等41则基于OH等40公开的宏基因微生物组测序数据开发了一种将皮肤微生物组与受试者进行配对的新方法，通过有监督机器学习模型从12个微生物进化支上筛选出如疮疱丙酸杆菌（propionibacterium acnes）等个体特异性皮肤微生物类群及其核苷酸多态性标记。随后 SCHMEDES等42在先前研究的基础上开发了一个法医皮肤微生物组个体识别的 hidSkinPlex 体系，该体系可对 22 个不同微生物进化支上从属到亚种水平的 286 个皮肤标志性微生物类群进行靶向测序。该团队先后使用最邻近分类43、支持向量机21和 LASSO算法22以验证该体系在法医个体识别中的效能，并进一步开发了更为精简稳定的hidSkinPlex+体系22。值得一提的是，SHERIER等22在上述研究中还计算了来自不同个体间皮肤微生物类群的直系同源 SNP 的固定指数（fixation index，FST），可以直观地对不同微生物类群的遗传距离进行区分，同时提高了皮肤微生物组与其人类宿主的匹配准确性。与 STR 等主流 DNA 遗传标记相比，利用微生物组分析技术所进行个体同一认定准确率虽然较低，但通过微生物组学分析技术可在具有相同基因组信息的同卵双生子的同一认定中起到辅助甄别的作用。STAHRINGER 等44首次对全同胞兄弟姐妹和双生子使用口腔微生物组进行同一认定的可能性进行评估，发现同卵和异卵双生子之间的细菌群落结构差异无统计学意义，但双生子之间的相似性在成年独居后有下降趋势。SUNDSTRM 等45对同一家族成员的唾液样本微生物群进行 16S rRNA基因测序分析，结果显示，13%的个体细菌群落差异可以用家族关系来解释，母亲比父亲与成年子女共有的 OTU更多，但这种相似性随着成年子女离家独居逐渐减弱。然而，目前研究大多根据事先设定好的阈值（cut-off value）将双生子分为两个相斥的类别，这可能会带来潜在问题即根据二分类结果进行同一认定时存在的“悬崖效应”。BOZZA 等46通过贝叶斯因子对 Jaccard 距离进行量化，不仅实现了同卵双生子的有效区分，同时避免了通过阈值进行同一认定时潜在的上述问题。LEE 等47使用 16S rRNA 扩增子对 4份 STR 分型失败的案件样本直接进行二次分析，其中2份样本成功进行了同一认定。总而言之，人类微生物组在个体中不仅具有长期的时间稳定性和较高的个体特异性，还能在二次分析中仍可获得足够的微生物学证据，可在同一认定领域中作为法医学 DNA分析的有力补充工具。2.1.2 组织或体液来源鉴定基于“核心微生物组”理论，微生物组分析可为法医案件中的体液鉴定提供新方法。早期研究48-49首先对唾液和皮肤微生物组进行研究，发现唾液与手指皮肤的微生物组具备组织和体液来源特异性，同时在两种检材的混合样本中皮肤微生物群落仍占显著优势。DOBAY 等50将研究对象进一步扩展到除皮肤、唾液外的精液、阴道分泌液、月经血、外周血等检材，16S rDNA 扩增子测序分析结果显示，除了外周血样本扩增失败外，其他样本在室内环境中保存30 d后仍保留其身体部位来源的细菌表征。YAO 等51对皮肤样本、唾液样本以及两者之间的不同混合模式进行16S rDNA扩增子分析，结果发现，微生物群落的特征可用于混合样本的体液鉴定。DEZ LPEZ 等24则对女性泌尿生殖道、鼻腔、皮肤和静脉血样本进行大规模16S rDNA扩增子分析，通过所训练深度神经网络实现了高准确度的组织或体液来源鉴定，预测模型在不同样本中的曲线下面积（area under curve，AUC）均在 0.97以上。为进一步分析不同测序方法对微生物组织或体液来源鉴定的影响，MEI等23基于二代测序和单分子实时测序技术分别对 16S rDNA V3V4高变区与基因全长进行分析，结果表明，阴道分泌液和月经血样本的微生物组成相似，而前两者与唾液、外周血之间则存在显著差异。值得注意的是，该研究在线性判别效应大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析中发现，同一体液中的微生物组在二代测序和单分子实时测序中存在群落结构差异，其中全长测序的序列注释率更高，适合属水平以下的微生物组研究。生殖器部位的微生物组分析在性侵案件中同样具有潜在法医学价值。QUAAK52使用微阵列技术对手、足、腹股沟以及阴茎等部位的皮肤微生物组进行检测，发现手、足等皮肤核心微生物组在阴茎微生物组中并不具有代表性，两者的群落结构存在差异。基于 生 殖 器 与 其 他 皮 肤 部 位 的 微 生 物 群 落 差 异，WILLIAMS 等53进 一 步 通 过 基 于 贝 叶 斯 模 型 的SourceTracker软件包对 43位受试者的阴阜拭子与阴毛样本进行 16S rRNA扩增子测序分析，发现阴阜微生物组具有长达6个月的稳定性，其中超过77%的样本以棒杆菌属、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、丙酸杆菌属、乳杆菌属为主，男性和女性的优势菌属则分别为棒杆菌属和乳杆菌属。为了获得分类 629Journal of Forensic Medicine,October 2022,Vol.38,No.5阶元更高的微生物多样性图谱，GHEMRAWI等25分别对阴茎与阴道微生物组进行宏基因组鸟枪法测序，结果发现，阴道中的乳杆菌属、加德纳菌属（gardnerella）和阴茎上的厌氧球菌（anaerococcus）、芬沟德菌属（finegoldia）、嗜蛋白胨菌属（peptoniphilus）等类群可分别作为对应部位的候选标志物。2.1.3 地域特征鉴识微生物群落生态在不同地域人群中的差异可能与其所处的地理位置、工业化程度以及生活习惯有关。早在 2013年，NAGASAWA 等54便发现幽门螺杆菌（helicobacter pylori）的基因型与其宿主的地理来源之间存在特异性，从而开发了一种在日本、韩国和中国人群中推断尸体地理来源的方法。LI等55对德国、非洲和阿拉斯加人群从更大的地理尺度上进行唾液微生物组分析：其中德国人群有着最高的微生物群落 多样性，这可能与其人口密度高、饮食结构多样有关；而在地理分布上较为分散且饮食结构单一的非洲人群则微生物群落的 多样性较高。ESCOBAR等56将哥伦比亚成年人肠道菌群与北美、欧洲、日本和韩国进行比较，发现肠道菌群在人群之间具有显著差异，其中放线菌门（actinobacteria）和疣微菌门（verrucomicrobia）等微生物类群表现出良好的地域特异性。虽然唾液和肠道微生物组的确展现出一定的地域特征鉴识应用潜力，然而这些微生物组与消化系统紧密相关，其群落结构受到不同地域饮食习惯特征的影响可能比地域环境本身更大。为了减少上述混淆因素的影响，BRINKAC等57选取了来自美国3个州的成年人的头发和阴毛微生物组进行分析，其中马里兰州和加利福尼亚州个体样本中的嗜蛋白胨菌属、葡萄球菌在丰度上有差异，而头发在环境暴露的条件下更容易具备地域特征鉴识的应用潜力。2.1.4 其他应用人类皮肤微生物与物品之间的接触可能会将微生物群落转移到个人物品之上40，通过微生物组分析将物品与个体进行联系有潜在的法医学应用价值。NECKOVIC等58对个体微生物组能否转移到另一个物体表面或其他介质上进行了研究，并指示受试者按照两种转移模式（两两握手-触摸介质，触摸介质-交换介质-触摸交换后的介质）进行接触，结果发现，无论介质的类型或转移模式如何，同组受试者之间的皮肤微生物组均发生了转移。KODAMA 等59对不同犯罪现场中的26种物证进行分析，随后将死后皮肤微生物组与现场物证进行匹配，其平均准确率可达到75%。通过微生物组分析以获取饮食习惯、体重指数、生活方式等信息也可以为法医案件侦查提供更多线索。饮食是影响微生物群落结构的主要因素之一，如HUANG等60发现食物中的脂肪酸通过影响口腔微生态改变口腔内微生物膜的表征，从而一定程度上抑制口腔细菌的生长。相比于附着在口腔内的微生物膜，唾液中的微生物群落表征则呈现出不同特点，DE FILIPPIS等61对杂食、乳蛋素食以及纯素食者的唾液进行微生物组和代谢组学分析，虽然唾液代谢组特征可用于区分饮食习惯，但其微生物群落受到饮食因素的影响并不显著。此外，体重指数影响着肠道微生物群落的组成结构，WANG等62发现在属水平上有44个微生物类群在不同BMI组中具有丰度差异，并使用线性判别分析对事先按照体重指数划分的不同体型组别成功分类，准确率达 94.4%。该团队随后使用岭回归分析和线性回归分析对测试集样本进行体型预测，准确率分别达 72%和 74%。生活方式也是影响微生物结构的重要因素之一；YU 等63对吸烟者和非吸烟者进行了调查，相比于非吸烟者，吸烟者颊黏膜中的微生物多样性和组成显著不同，同时 多样性较低；AL-ZYOUD 等64发现吸烟行为对男性和女性均产生了唾液微生物组的变化，从而有可能通过 LEfSe分析在属的水平上对吸烟者和非吸烟者进行分类。此外，如运动、职业、睡眠、饲养宠物和夫妻间的身体互动等生活方式相关因素对微生物结构也有一定影响65-69。2.2 死亡微生物组当宿主死亡时，其体内数以亿万的微生物会进行典范转移（paradigm shift）70。由于宿主死亡，其内环境发生缺氧并触发细胞内因子的释放，导致细胞自溶并向周围组织释放营养物质71。随着尸体内缺氧情况的加剧，尸体分解从有氧发酵转变为厌氧发酵，从而使环境中充满了如二氧化硫、硫化氢等腐败气体。随后外源微生物、昆虫、食腐动物在尸体中的活动会进一步改变微生物所处的环境，使得人体死后的微生物组发生巨大变化70。为了对微生物因宿主死亡而发生演替的群落表征进行描述，死后生物组（necrobiome）、死后细菌群落（epinecrotic bacterial community）等概念于 2013年和2014年被先后提出72-73，前者的定义是“参与分解如动物腐肉和人类尸体等异养型生物遗骸的所有物种群落的总和”，后者则意为“在尸体分解时定植或迁徙到其表皮或腔道黏膜上的细菌”，属于死后生物组概念的子集。为进一步将死后生物组中的微生物作为主要研究对象，CAN等74在此基础上进一步提出“死亡微生物组”（thanatomicrobiome），即宿主死后在其尸体内部存在的微生物群。许多生物因素以及非生物因素影响着死亡微生物组的群落演替变化70，如时间、温度、630法 医 学 杂 志 2022年 10月 第38卷 第5期湿度、日照、氧气、pH值、埋葬位置等非生物因素，以及宿主生前状况、昆虫、食腐动物等生物因素。此外，死亡微生物组在保存条件下还具有一定的时间稳定性，SGUAZZI等75对存储在-20 下 516年的 18份案件样本进行微生物组分析后发现，在长期冷冻的陈旧DNA提取物中没有微生物特征受到污染的迹象，其微生物群落对比冷冻前也未发生显著变化，表明保存良好的陈旧人类 DNA提取物或可成为微生物群落样本的可靠来源。基于上述诸多特点，微生物组分析技术具有推断 PMI 和 PMSI 以及死因分析等法医学应用潜力。2.2.1 PMI推断目前的 PMI推断方法主要依赖于传统的主观形态学检查，其结果易受到环境因素的影响。基于客观测序数据的微生物组分析可为 PMI 推断提供新方法76。研究77表明，死亡微生物组群落演替规律与尸体分解所处的时间阶段联系密切，如早期腐败期开始时以兼性厌氧菌为主，随后则以专性厌氧菌占优势74，晚期腐败期主要以土壤微生物为主，而在白骨化期时则以孢子形成的微生物群为主77。这种演替时间规律性为死亡微生物组在 PMI推断中的应用奠定了基础。2013 年，METCALF 等78在小鼠模型中首次确认了死后微生物群落演替与PMI的高度相关性。同年，HYDE 等79发现人类死后近端结肠样本中拟杆菌门和副拟杆菌属（parabacteroides）的丰度与 PMI存在显著负相关，梭菌属则是PMI推测的可选标志物。经大量研究80-83发现，此类标志物在死亡微生物组学中被进一步归纳为“死后梭菌属效应”（postmortem clostridium effect，PCE），对 PMI 推断有着重要意义。相较于近端结肠，HU等84从死后5192 h的人类遗体中收集阑尾和横结肠的微生物群落样本，阑尾中 ASV的丰度、数量以及 多样性均高于横结肠，表明阑尾可能是死后肠道微生物组的更佳采样部位。该团队随后基于人类阑尾微生物群根据随机森林算法构建了PMI预测模型，其平均绝对误差为（25.790.43）h。LIU等85通过分层聚类分析对分解时间为 15 d 的小鼠盲肠分解模型进行死后肠道微生物组研究，并通过乳杆菌属、杜博斯菌属（dubosiella）、肠球菌属（enterococcus）和毛螺菌科（lachnospiraceae）等核心类群构建了基于随机森林的 PMI 推断模型，平均绝对误差为20.01 h。除了死后肠道微生物组外，死后遗骨中的微生物组也可用于白骨化尸体的晚期PMI推断。DEEL等29根据肋骨微生物组的 16S rRNA 和 18S rRNA 基因分析结果开发了一个基于随机森林用于预测 PMI的模型，在历经 19个月分解时间的尸体样本中，该模型 PMI 预测准确度可达34 d，其中夏季样本和16S rRNA方法的平均绝对误差分别低于春季样本和18S rRNA方法。此外，亦有学者应用真菌微生物组进行PMI的报道，如 FU 等86利用宏条形码（meta barcoding）技术发现，环境土壤和尸体土壤真菌区系之间存在显著差异，并认为晚期腐败尸体的真菌群落表征具有一定PMI推断潜力；PROCOPIO 等76则首次对深埋尸体进行研究，进一步调查真菌群落在尸体长时间分解周期中的作用，发现真菌群落表征存在与PMI相关的分类趋势，如被孢霉门（mortierellomycota）的丰度在尸体分解46个月后增加，子囊菌门（ascomycota）在2个月后增加，而担子菌门（basidiomycota）的丰度则始终减少。2.2.2 PMSI推断由于水体环境和生态系统的复杂性，PMSI推断易受如水温、盐度、潮汐、水深、尸体水中移动、水体化学成分、水生微生物以及食腐动物等因素影响31，因此 PMSI 推断具有一定挑战性。累积日度（accumulated degree days，ADD）法是目前主流的PMI和PMSI尸体分解评分模型，具体方法是将死者从死亡到其尸体被发现时所历经的天数按 0 以上的日均温度进行累加，其意义在于综合温度和时间两个因素进行PMSI 推断87。鉴于该方法的局限性，利用微生物组分析进行 PMSI 推断逐渐成为研究热点。DICKSON等88是最早对猪尸体中淡水水生微生物组进行研究的团队之一，该团队发现变形菌门（proteobacteria）、厚壁菌门（firmicutes）、梭菌属（clostridium）、拟杆菌门和放线菌等为门水平的优势类群，而微生物群落随淹没时间和季节改变会发生演替。在此基础上，BENBOW等89对放置于夏季和冬季淡水河流中的脊椎动物遗骸上的微生物组进行高通量测序后发现，其微生物组在门水平上仍以变形菌门、厚壁菌门等为主，但属水平上的微生物群落在季节和天数之间则存在显著差异。CARTOZZO 等31将 200 份猪白骨化尸体在淡水河中浸没 353 d，并对死亡微生物组的长期变化和演替模式进行分析，发现梭菌属、全噬菌科（holophagaceae）和伽玛变形菌纲门（gammaproteobacteria）等类群的丰度与PMSI相关，基于肋骨和肩胛骨微生物组所构建的线性回归预测模型其均方根误差（root mean square error，RMSE）分别为472.31 h和 498.47 h。2.2.3 死因分析对尸体解剖中未发现明确死因的猝死者进行死因鉴定是法医工作者经常面临的挑战。鉴于微生物组能够反映其宿主生前的健康情况，利用死亡微生物 631Journal of Forensic Medicine,October 2022,Vol.38,No.5组学分析进行死亡方式和（或）死亡原因鉴定可为此类难题提供新思路。ZANEVELD 等90提出了“安娜卡列尼娜原则”（Anna Karenina principle，AKP），即长时间暴露在任意应激原下的个体，其微生物群落会比健康个体更易发生改变，且这些个体之间的微生物群落结构也具有一定差异。临床研究91表明，肠道、口腔微生物的群落结构和演替变化与宿主的局部疾病、系统性疾病以及精神疾病等具有显著